第五章 工业微生物诱变育种诱变剂

1、LOGO第五章第五章 工业微生物工业微生物 诱变育种诱变诱变育种诱变剂剂Company Logo本章内容本章内容微生物育种诱变剂微生物育种诱变剂微生物的诱变育种微生物的诱变育种Company Logo诱变剂诱变剂是指那些能诱发基因突变、并使是指那些能诱发基因突变、并使突变率突变率提高到超过自发突变水平的物理或提高到超过自发突变水平的物理或化学因子。化学因子。 物理诱变剂物理诱变剂 种类种类 化学诱变剂化学诱变剂 生物诱变剂生物诱变剂第一节第一节 微生物育种诱变剂微生物育种诱变剂Company LogoCompany Logo诱变育种的特点诱变育种的特点（1 1）提高突变率、扩大突变谱。）提高突

2、变率、扩大突变谱。 （2 2）改良单一性状比较有效，同时改良多）改良单一性状比较有效，同时改良多 个性状较困难个性状较困难. . （3 3）性状稳定快，育种年限短。）性状稳定快，育种年限短。（4 4）诱发突变的方向和性质尚难掌握。）诱发突变的方向和性质尚难掌握。Company Logo一、物理诱变剂一、物理诱变剂包括包括紫外光紫外光、x x射线、射线、射线、快中子、射线、快中子、射线、射线、射线和超声波射线和超声波等。其中紫外光沿用最广，诱变等。其中紫外光沿用最广，诱变抗生素高产突变株有很优异的效果。抗生素高产突变株有很优异的效果。 非电离辐射：电子级能提高，但不产生离子。非电离辐射：电子级能

3、提高，但不产生离子。 电离辐射电离辐射: :能击中电子并产生正离子能击中电子并产生正离子物理诱变主要是由于物理诱变主要是由于高能辐射导高能辐射导致生物系统损伤，致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。常可以分为常可以分为物理、物理物理、物理- -化学、化学、生物学化学、化学、生物学阶段阶段(p35)(p35)。Company Logo（一）物理诱变剂的生物学效应（一）物理诱变剂的生物学效应直接作用直接作用间接作用间接作用击中击中DNA或其它生物结构引起的能量吸收或其它生物结构引起的能量吸收环境中其它分子环境中其它分子激发和电离分子

4、激发和电离分子激发和电离分子激发和电离分子重排重排重排重排原初损伤原初损伤扩散自由基扩散自由基分子的变化分子的变化代谢代谢代谢代谢突变突变体突变体生物变化生物变化细胞死亡细胞死亡物理物理物理物理- -化学化学化学化学生物学生物学Company Logo1 1、物理阶段、物理阶段 持续时间极短（持续时间极短（1010-5-51010-8-8秒）。电离辐射产生能秒）。电离辐射产生能量转移，在体内形成电离效应。量转移，在体内形成电离效应。2 2、化学阶段、化学阶段 持续时间极短（持续时间极短（1010-5-51010-8-8秒）秒） 。形成大量的自。形成大量的自由基。由基。3 3、生物化学阶段、生物

5、化学阶段持续时间短（持续时间短（10101010-2-2秒）秒） 。大量的自由基与生物大分子发生化学反应，形成大大量的自由基与生物大分子发生化学反应，形成大量的烷化自由基量的烷化自由基(R.)(R.)，将辐射效应转移到生物大分，将辐射效应转移到生物大分子中。子中。烷化自由基持续时间长，并可通过繁殖传递。烷化自由基持续时间长，并可通过繁殖传递。Company Logo4 4、生物学阶段、生物学阶段持续时间长（甚至几个世代）持续时间长（甚至几个世代）, ,并可通过繁殖传递。并可通过繁殖传递。烷化自由基烷化自由基(R.)(R.)与生物大分子发生一系列反应，引与生物大分子发生一系列反应，引起生理和遗传

6、损伤。起生理和遗传损伤。4.1 4.1 形态方面的表现形态方面的表现损伤损伤：造成死亡，死亡率与辐射剂量成正比造成死亡，死亡率与辐射剂量成正比生长生长：抑制生长等，与辐射剂量成正比抑制生长等，与辐射剂量成正比形态变异形态变异：菌落（体）、色泽大小变化。菌落（体）、色泽大小变化。生理变异生理变异：不能遗传，逐渐消失。不能遗传，逐渐消失。遗传变异遗传变异：能遗传能遗传Company Logo4.2 4.2 生理方面的表现生理方面的表现生理方面的表现生理方面的表现酶活性的变化酶活性的变化PODPOD（过氧化物酶）、（过氧化物酶）、 SOD SOD 、CAT CAT （过氧（过氧化氢酶）、核酸酶化氢酶

7、）、核酸酶相关物质含量的变化相关物质含量的变化蛋白质、氨基酸、核苷酸蛋白质、氨基酸、核苷酸生长素、生长素、ABAABA（天然脱落酸） Company Logo4.3 4.3 遗传方面的表现遗传方面的表现细胞核方面的表现细胞核方面的表现: :细胞核扩大、松散（膨松细胞核扩大、松散（膨松 puffingpuffing）微核细胞，微核细胞率与辐射剂量成正比微核细胞，微核细胞率与辐射剂量成正比微核细胞率微核细胞率是评价遗传损伤的指标是评价遗传损伤的指标染色体方面的表现染色体方面的表现: :断裂，形成染色体断片、环、桥等。断裂，形成染色体断片、环、桥等。染色体畸变率与辐射剂量成正比染色体畸变率与辐射剂量

8、成正比染色体畸变率染色体畸变率是评价遗传损伤的指标是评价遗传损伤的指标Company LogoDNADNA方面的表现方面的表现: :DNADNA断裂、分解，形成单链结构断裂、分解，形成单链结构DNADNA非按时合成非按时合成存在自我损伤修复机制，提前进行存在自我损伤修复机制，提前进行DNADNA合成，合成，进行进行DNADNA损伤修复损伤修复生长素类物质促进生长素类物质促进DNADNA损伤修复损伤修复咖啡因、咖啡因、EDTAEDTA等拟制等拟制DNADNA损伤修复损伤修复Company Logo菌种的遗传背景和生理状态；菌种的遗传背景和生理状态；可见光；可见光；水分；水分；电离辐射诱变剂在氧气

9、或空气中使用时，其辐电离辐射诱变剂在氧气或空气中使用时，其辐射效应一般要比在真空中或在惰性气体中时要射效应一般要比在真空中或在惰性气体中时要高；高；温度对电离辐射效应也有影响，主要是能改变温度对电离辐射效应也有影响，主要是能改变氧与自由基，或自由基相互间的作用程度。氧与自由基，或自由基相互间的作用程度。（二）影响辐射效应的因子（二）影响辐射效应的因子Company Logo1 1、性质和来源、性质和来源波长在波长在4040一一390nm390nm之间。之间。由于由于DNADNA分子的紫外分子的紫外光吸收值为光吸收值为260nm260nm，因而波长在，因而波长在200-300nm200-300n

10、m的的紫外光才有诱变作用。紫外光源一般要求为发紫外光才有诱变作用。紫外光源一般要求为发射光谱集中在射光谱集中在260nm260nm附近的紫外光灯，灯管内附近的紫外光灯，灯管内装有氖气的低压放电灯是较理想的光源，国内装有氖气的低压放电灯是较理想的光源，国内一般采用一般采用3030瓦的紫外光灯瓦的紫外光灯，光谱分布范围广，光谱分布范围广，诱变效率差。诱变效率差。特点：特点：能量较低；对组织穿透力强能量较低；对组织穿透力强. .（三）非电离辐射（三）非电离辐射紫外线紫外线Company Logo2 2、紫外光的剂量、紫外光的剂量单位单位: :尔格能量尔格能量/mm/mm2 2( (灯具发射强度随使用

11、时间延长而下降灯具发射强度随使用时间延长而下降。) )实际应用实际应用- -相对剂量：相对剂量：照射时间、杀菌率照射时间、杀菌率来表示来表示O 杀菌率：杀菌率：90.0%-99.9%90.0%-99.9%O 时间：芽孢菌时间：芽孢菌10min10min； 小芽孢杆菌营养缺陷型小芽孢杆菌营养缺陷型1-3min1-3min； 一般营养体一般营养体3-5min3-5min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌无芽孢菌和革兰氏阳性菌0.5-2min0.5-2min。Company Logo3 3、诱变机理、诱变机理O 嘧啶二聚体嘧啶二聚体O DNA DNA链的断裂链的断裂O 胞嘧啶与尿嘧啶的水和作用胞嘧啶与尿嘧啶

12、的水和作用O DNA DNA与蛋白质交联与蛋白质交联Company LogoCompany LogoO 出发菌株出发菌株O 前培养前培养；培养基丰富营养、细菌培养到；培养基丰富营养、细菌培养到 对数期对数期、真菌孢子刚成熟；、真菌孢子刚成熟；O 制备菌悬液：制备菌悬液：处理液均用生理盐水制处理液均用生理盐水制 备。细菌调节菌液浓度到备。细菌调节菌液浓度到10108 8个个/ml/ml，真，真菌约为菌约为10106 610107 7 /ml/ml，放线菌则为，放线菌则为l0l07 710108 8/ml./ml.4 4、操作方法、操作方法Company LogoO 照射照射v设备：紫外灯、磁力搅

13、拌器、暗室、培养皿等设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室、培养皿等; ;v紫外灯：波长为紫外灯：波长为253.7253.7nm,nm,功率是功率是1515W;W;v处理时的照射距离：处理时的照射距离：2020cm 30cm;cm 30cm;v样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3 3mm,mm,照射时，要用照射时，要用磁力搅拌器搅拌。磁力搅拌器搅拌。 注意注意：操作和培养时必需避免可见光直射液面，：操作和培养时必需避免可见光直射液面，最好在黄色或红色灯光下操作。最好在黄色或红色灯光下操作。O 后培养后培养：1.5-21.5-2小时；小时；O 稀释涂皿稀释涂

14、皿Company Logo（四）、电离辐射（四）、电离辐射Company Logo（五）新型诱变剂（五）新型诱变剂v 微波微波: :电磁波电磁波v 红外线：红外线：0.751000m v 激光：光量子流激光：光量子流v 高能电子流：强电离辐射高能电子流：强电离辐射v 航天育种：利用返回式卫星进行航天育种：利用返回式卫星进行农农作物新品种作物新品种的选育的一种方法。的选育的一种方法。Company LogoCompany LogoCompany Logo6、低能离子注入过程：能量沉积、动量传递、离子注入和电荷交换时间：10191013s中间时发生。特征：具有Y射线能量沉积引起机体损伤的；动能交换

15、产生的级联损伤，表现为遗传物质原子转移、重排或基因的缺失；慢化离子、移位原子和本底元素复合反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造成的损伤。 Company Logo常用离子：通常采用N+、H+、Ar。生物学效应：相当于物理和化学诱变两者相结合的复合诱变效应Company Logo化学诱变剂化学诱变剂是一些能和是一些能和DNADNA起作用，改变起作用，改变其结构，并引起遗传变异的化学物质。其结构，并引起遗传变异的化学物质。 碱基类似物碱基类似物 烷化剂烷化剂 移码突变剂移码突变剂 其他类其他类二、化学诱变剂二、化学诱变剂种类种类Company Logo1 1、种类、种类胸胸腺腺嘧

16、嘧啶啶的的结结构构类类似似物物（一）碱基类似物（一）碱基类似物常常用用Company Logo腺嘌呤腺嘌呤的结构类似物的结构类似物常常用用Company Logo鸟嘌呤鸟嘌呤的结构类似物的结构类似物Company Logo2 2、碱基类似物作用机制、碱基类似物作用机制5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU5-BU）是胸腺嘧啶的结构类似物也）是胸腺嘧啶的结构类似物也是一种强诱变剂。它渗入到是一种强诱变剂。它渗入到DNADNA中，会发生酮中，会发生酮式和烯醇式互变，不仅和原来的碱基配对而且和式和烯醇式互变，不仅和原来的碱基配对而且和其它碱基配对。其它碱基配对。Company Logo例例5-BU5-

17、BU诱发诱发A-TA-T变为变为G-CG-C过程过程掺入到DNA的复制过程，碱基类似物又成为掺入诱变剂掺入诱变剂Company Logo3 3、各种碱基类似物的性质和使用方法、各种碱基类似物的性质和使用方法 O性质性质5-5-溴溴( (氟氟) )尿嘧啶尿嘧啶(5-Bu(5-Bu，或，或5-Fu)5-Fu)为白色无味结晶粉为白色无味结晶粉末，末，溶于水或醇中溶于水或醇中，几乎不溶于氯仿和乙醚，几乎不溶于氯仿和乙醚。脱氧溴尿核苷脱氧溴尿核苷( (亦即溴脱氧尿核苷，亦即溴脱氧尿核苷，5-BudR)5-BudR)，白色白色结晶状粉末，无臭、无味，结晶状粉末，无臭、无味，难溶于水和甲醇难溶于水和甲醇，易

18、，易溶于碱性溶液。溶于碱性溶液。6-6-巯基嘌呤巯基嘌呤(6MP)(6MP)为黄色无臭结晶粉末，熔点为黄色无臭结晶粉末，熔点313-314(313-314(当即分解当即分解) )，在空气中或见光会发黑变，在空气中或见光会发黑变质，质，溶于乙醇，碱性溶液和稀硫酸，几乎不溶于溶于乙醇，碱性溶液和稀硫酸，几乎不溶于水、丙酮、氯仿和醚。水、丙酮、氯仿和醚。Company LogoO使用方法使用方法1 1）将待处理的细菌于液体培养基中培养到）将待处理的细菌于液体培养基中培养到对数对数 期期，离心去培养液。，离心去培养液。2 2）饥饿饥饿培养：生理盐水培养：生理盐水8-108-10小时小时3) 3) 把把

19、 5-Bu5-Bu或或5-Fu5-Fu（一般剂量为（一般剂量为5-300g5-300gmlml，细，细菌菌25-40 g25-40 gmlml）加到培养基中，做平板。）加到培养基中，做平板。4 4）涂皿菌体涂布在含一定浓度的碱基类似物的培）涂皿菌体涂布在含一定浓度的碱基类似物的培 养基平皿上，适温培养，挑取菌落筛选。养基平皿上，适温培养，挑取菌落筛选。Company Logo( (二二) ) 烷化剂烷化剂烷化剂是一种常见的诱变剂，这类诱变剂烷化剂是一种常见的诱变剂，这类诱变剂具有具有一个或多个一个或多个活性烷基，他们容易取代活性烷基，他们容易取代DNADNA分子中的活泼氢原子，直接和一个或分子

20、中的活泼氢原子，直接和一个或多个碱基起烷化反应多个碱基起烷化反应。85Company Logo1）单功能烷化剂：有一个烷化基团，对生）单功能烷化剂：有一个烷化基团，对生物毒性小诱变效应大。物毒性小诱变效应大。2）双功能或多功能烷化剂：有两个或多个）双功能或多功能烷化剂：有两个或多个烷化基团对生物毒性大，诱变效应小。烷化基团对生物毒性大，诱变效应小。1 1、烷化剂种类、烷化剂种类Company Logo甲基磺酸甲酯甲基磺酸甲酯 MMSSCH3OCH3OOCH3SO2 OCH3SO2 (OC2H5)2:硫酸二乙酯硫酸二乙酯DMSCompany Logo2 2、烷化剂作用机理、烷化剂作用机理EMS引

21、起碱基转换引起碱基转换 Company Logo一般认为甲基化比乙基化造成能造成更多的断裂和缺失，所以MMS的毒性大于EMS。甲基黄磺酸乙酯 EMSSCH3OC2H5OO甲基黄磺酸甲酯 MMSSCH3OCH3OO烷化剂Company Logo3 3、常用烷化剂及其使用方法、常用烷化剂及其使用方法亚硝基胍亚硝基胍（NGNG、NTGNTG）黄色结晶、性质不稳定，遇光分解。是一种特别黄色结晶、性质不稳定，遇光分解。是一种特别强的诱变剂，有强的诱变剂，有超诱变剂超诱变剂的称号。还能诱发邻近的称号。还能诱发邻近的基因同时发生突变，即的基因同时发生突变，即并发突变并发突变。且易诱发复。且易诱发复制叉附近并

22、发突变。有微弱移码作用制叉附近并发突变。有微弱移码作用, ,适于诱变营适于诱变营养缺陷型突变株养缺陷型突变株(10%(10%营养缺陷型营养缺陷型) )。CH3NNOCNHNHNO2Company LogoNTG在水溶液中随着不同pH将产生不同的分解物，从而影响诱变效用.当溶液pH低于5.5时，NTG分解成亚硝酸；当溶液pH在8.0以上时，NTG会分解产生重氮甲烷，对核酸其烷化作用；当溶液pH6.0时，NTG本身DNA其烷化反应而导致突变。Company Logoa、根据处理菌体特性，选用一定范围根据处理菌体特性，选用一定范围pHpH值的缓冲值的缓冲液制备菌体或孢子悬液。再离心洗涤，除去培液制备

23、菌体或孢子悬液。再离心洗涤，除去培养液，然后用缓冲液制备孢子液。养液，然后用缓冲液制备孢子液。b b、NGNG试剂要保存在冰箱内，使用时要试剂要保存在冰箱内，使用时要特别注意特别注意安全安全 操作要在通风柜内，带上橡皮手操作要在通风柜内，带上橡皮手套，穿上工作服，也不得将套，穿上工作服，也不得将NGNG直接放在纸上暴直接放在纸上暴露称量。最好先准备一只灭菌小瓶，在通风柜露称量。最好先准备一只灭菌小瓶，在通风柜中用小勺取中用小勺取15-30mg15-30mg放入小瓶中称重放入小瓶中称重( (现用现配现用现配) )。NGNG难溶于水，可按难溶于水，可按10mg/1ml10mg/1ml的比例加入丙酮

24、溶的比例加入丙酮溶解，再用缓冲液稀释。解，再用缓冲液稀释。!NGNG使用注意事项使用注意事项Company Logoc、取取0.2mlNG0.2mlNG处理液与处理液与2ml2ml孢子液混合，在一定孢子液混合，在一定温度下处理温度下处理n n分钟分钟; ;d d、用缓冲液或生理食盐水大量稀释或多次离心洗、用缓冲液或生理食盐水大量稀释或多次离心洗 涤处理后的混合液并稀释到合适浓度，涂布平涤处理后的混合液并稀释到合适浓度，涂布平皿，分离培养。皿，分离培养。 f f、所有接触过、所有接触过NGNG的器皿均须用的器皿均须用l-2Nl-2N的的NaOHNaOH液液解解毒毒处理。要浸泡过夜并在阳光下晒。最

25、好将接触处理。要浸泡过夜并在阳光下晒。最好将接触 稀浓不同的稀浓不同的NGNG液的器皿分别作解毒处理。液的器皿分别作解毒处理。Company Logo能和能和DNADNA分子结合，并造成其碱基对增多或缺分子结合，并造成其碱基对增多或缺失，从而诱发突变的化合物。包括压吖啶类杂失，从而诱发突变的化合物。包括压吖啶类杂环染料以及一些烷化剂和吖啶类相结合的化合物，环染料以及一些烷化剂和吖啶类相结合的化合物，总称为总称为ICRICR类化合物类化合物。使用方法使用方法：用：用pH7.0pH7.0磷酸缓冲液将吖啶黄配制成磷酸缓冲液将吖啶黄配制成浓度为浓度为0.2%0.2%溶液，在溶液，在2828振荡振荡34

26、34小时使其完小时使其完全溶解。直接加入孢子液接触处理或加入培养基全溶解。直接加入孢子液接触处理或加入培养基内。如为生长过程处理，平皿内浓度一般为内。如为生长过程处理，平皿内浓度一般为10-10-50g50gmlml的吖啶黄，处理时的吖啶黄，处理时避光操作。避光操作。( (三三) ) 移码诱变剂移码诱变剂Company LogoDNADNA链上的两个碱基插链上的两个碱基插入移码突变剂后，两个入移码突变剂后，两个碱基之间的距离变大，碱基之间的距离变大，引起碱基缺失和插入引起碱基缺失和插入Company Logo 羟胺：专一作用于胞嘧啶，改变了羟胺：专一作用于胞嘧啶，改变了DNADNA上该碱上该碱

27、基的结构，以致在基的结构，以致在DNADNA复制过程中，结构改变复制过程中，结构改变的胞嘧啶同腺嘌呤而不与鸟嘌呤配对，从而引起的胞嘧啶同腺嘌呤而不与鸟嘌呤配对，从而引起了碱基转换了碱基转换G G：CACA：T T。 羟胺（羟胺（NHNH2 2OHOH）（白色晶体，具有腐蚀性）和）（白色晶体，具有腐蚀性）和其它诱变剂相比，只引起其它诱变剂相比，只引起G:CG:C转变为转变为A:TA:T, ,而不引而不引起起A:TA:T转变为转变为G:CG:C。 （四） 羟胺剂Company LogoCGCGHAC*GC*ACGC*ATA羟胺和细胞内其它物质也能发生作用，生成羟胺和细胞内其它物质也能发生作用，生成

28、过氧化氢。过氧化氢是非专一性诱变剂。过氧化氢。过氧化氢是非专一性诱变剂。对于噬菌体或离体DNA，羟胺是专一性很强的诱变剂，但对细菌、真菌和放线菌等微生物，诱变效果不理想Company LogoCompany Logo（五）脱氨剂（五）脱氨剂-亚硝类诱变剂作用原理亚硝类诱变剂作用原理作用：通过氧化脱氨基造成的。胞嘧啶作用：通过氧化脱氨基造成的。胞嘧啶(C)(C)经氧化脱氨后成为尿嘧啶经氧化脱氨后成为尿嘧啶(U)(U)、腺嘌、腺嘌呤呤(A)(A)经脱氨后成为次黄嘌呤经脱氨后成为次黄嘌呤(H)(H)，鸟嘌，鸟嘌呤呤(G)(G)脱氨成为黄嘌呤脱氨成为黄嘌呤(X)(X)。Company LogoComp

29、any LogoO使用方法使用方法 不稳定，常用盐类不稳定，常用盐类亚硝酸钠亚硝酸钠1 1、 0.1M0.1M亚硝酸钠溶液：称用亚硝酸钠溶液：称用0.1M0.1M醋酸缓冲液配制醋酸缓冲液配制 浓度为浓度为0.05M0.05M亚硝酸钠溶液。亚硝酸钠溶液。2 2、挑大肠杆菌一环于、挑大肠杆菌一环于5ml LB 5ml LB 肉汤中，肉汤中，3737培养培养14-14-1616小时。小时。3500r/min3500r/min，离心，离心5min5min。弃上清液，。弃上清液， 打匀沉淀加打匀沉淀加5ml pH4.65ml pH4.6的醋酸缓冲液，二次离心。的醋酸缓冲液，二次离心。弃上清液，加现配的弃

30、上清液，加现配的HNOHNO2 21ml1ml混匀，混匀，37 37 保温保温5 min5 min。3 3、5 min5 min后，涂皿（稀释到后，涂皿（稀释到1010-5-5）。）。 Company Logo（六）其它化学诱变剂（六）其它化学诱变剂 秋水仙碱秋水仙碱诱法细胞染色体加倍。抑制纺锤丝纺诱法细胞染色体加倍。抑制纺锤丝纺锤体的形成，在染色体复制完成后无法移向两极。锤体的形成，在染色体复制完成后无法移向两极。Company Logo抗生素作为诱变剂的主要抗生素有放线菌素、争光霉素、作为诱变剂的主要抗生素有放线菌素、争光霉素、链黑霉素。这些抗生素一般都是抗癌药物。它们的链黑霉素。这些抗生素一般都是抗癌药物。它们的诱变作用一般没有烷花剂显著，常和其它诱变剂搭诱变作用一般没有烷花剂显著，常和其它诱变剂搭配使用。配使用。金属盐类用于诱变的金属盐类有用于诱变的金属盐类有LiClLiCl、硫酸锰等。其中、硫酸锰等。其中LiClLiCl比比较常用，同其它诱变剂搭配使用效果显著。较常用，同其它诱变剂搭配使用效果显著。