第六章 微生物的生长与环境条件13

1、第六章第六章 微生物的生长微生物的生长 第一节第一节 微生物的个体与群体生长和繁殖微生物的个体与群体生长和繁殖 一一 微生物的个体生长与繁殖微生物的个体生长与繁殖二二 微生物的群体生长规律微生物的群体生长规律 生长就是细胞物质有规律、不可逆增加，导生长就是细胞物质有规律、不可逆增加，导致细胞致细胞体积体积扩大的生物学过程。扩大的生物学过程。生长生长是一个逐步发生的是一个逐步发生的量变量变过程过程;繁殖繁殖是一个产生新的生命个体的是一个产生新的生命个体的质变质变过程。过程。这种从量变到质变的过程又称为这种从量变到质变的过程又称为发育发育 在在高等生物高等生物里里生长和繁殖生长和繁殖这两个过程可以

2、这两个过程可以明显分开明显分开，但在低等特别是在，但在低等特别是在单细胞的生物单细胞的生物里，里，由于由于，这两个，这两个过程是过程是紧密联系又很难划分紧密联系又很难划分的过程。的过程。在微生物学中提到的在微生物学中提到的“生长生长”，一般均指，一般均指群群体生长体生长，这一点与研究大生物时有所不同。，这一点与研究大生物时有所不同。群体中个体数目的增加。可以用重量、群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。体积、密度或浓度来衡量。个体生长个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加。陈代谢，原生质与细胞组分的增加。群

3、体生长群体生长群体生长群体生长 = 个体生长个体生长 + 个体繁殖个体繁殖 群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程。殖交替进行的过程。一一 微生物的个体生长与繁殖微生物的个体生长与繁殖一、细菌细胞的生长一、细菌细胞的生长 细菌细胞的生长是指一个新生的细胞长大以细菌细胞的生长是指一个新生的细胞长大以及最后分裂为两个子细胞的过程及最后分裂为两个子细胞的过程( (二分分裂二分分裂) )。 生长周期内主要的阶段有：生长周期内主要的阶段有：染色体染色体DNADNA的复的复制和分离，制和分离，细胞壁细胞壁扩增和细菌的扩增和细菌的分裂分裂。细菌的生长与繁

4、殖实际是一次细胞分裂细菌的生长与繁殖实际是一次细胞分裂隔膜完全形隔膜完全形成成子细胞分离子细胞分离DNA分配和分配和隔膜开始形隔膜开始形成成 当细菌的各种细胞当细菌的各种细胞结构复制完成之后就进结构复制完成之后就进入分裂时期，此时在细入分裂时期，此时在细菌长轴的中间位置，通菌长轴的中间位置，通过细胞质膜内陷并伴随过细胞质膜内陷并伴随新合成的肽聚糖插入，新合成的肽聚糖插入，导致横隔壁向心生长，导致横隔壁向心生长，最后在中心汇合，完成最后在中心汇合，完成一次分裂，通常情况下，一次分裂，通常情况下，将一个细胞分裂成两个将一个细胞分裂成两个大小相等的子细胞。大小相等的子细胞。 酵母菌主要的繁殖方式是酵

5、母菌主要的繁殖方式是出芽出芽，酵母菌，酵母菌细胞的生长细胞的生长芽细胞的生长。芽细胞的生长。 酵母菌的酵母菌的细胞周期细胞周期是两次细胞分裂之间是两次细胞分裂之间的时间，这个周期分为的时间，这个周期分为4个时期：个时期：第一间隔期第一间隔期G G1 1DNADNA合成期合成期S S第二间隔期第二间隔期G G2 2有丝分裂期有丝分裂期MM二、酵母细胞的生长二、酵母细胞的生长 细胞分裂期细胞分裂期M 间隔期间隔期G1DNA合成期合成期S第二间隔期第二间隔期G2核膜上的纺锤体斑通过复制由一个变为两核膜上的纺锤体斑通过复制由一个变为两个，个，DNA开始复制，芽体出现。开始复制，芽体出现。 纺锤体斑产生

6、约纺锤体斑产生约15根微管，其中一个纺锤根微管，其中一个纺锤体斑沿核膜移动体斑沿核膜移动180度，从而使两个纺锤度，从而使两个纺锤体斑通过直线形的微管连在一起。体斑通过直线形的微管连在一起。 芽体增大，细胞核移到母细胞与芽体交界芽体增大，细胞核移到母细胞与芽体交界处，微管延长。处，微管延长。 细胞核有丝分裂，其中一个核进入芽体，细胞核有丝分裂，其中一个核进入芽体，芽体子细胞与母细胞之间的壁开始合成，芽体子细胞与母细胞之间的壁开始合成，随后子细胞与母细胞分离，或暂时不分离随后子细胞与母细胞分离，或暂时不分离（如假丝酵母属）继续出芽。（如假丝酵母属）继续出芽。 丝状真菌的生长：从丝状真菌的生长：从

7、孢子孢子萌发开始萌发开始，以其菌丝以其菌丝顶端延长顶端延长的方式进行。当菌丝伸的方式进行。当菌丝伸长到一定程度后就会出现分支。长到一定程度后就会出现分支。 霉菌菌丝的延伸过程：霉菌菌丝的延伸过程：“菌丝尖端生长的泡囊假设菌丝尖端生长的泡囊假设” 顶端生长需要高尔基体、顶端生长需要高尔基体、内质网等细胞器参与。在菌丝内质网等细胞器参与。在菌丝的亚顶端区富含内质网和核糖的亚顶端区富含内质网和核糖体等细胞器。体等细胞器。 细胞膜脂肪和蛋白质在亚细胞膜脂肪和蛋白质在亚顶端区的内质网中合成后，通顶端区的内质网中合成后，通过小泡囊转移到高尔基体的近过小泡囊转移到高尔基体的近侧潴泡中，由高尔基体转向远侧潴泡

8、中，由高尔基体转向远侧时，成熟而分泌泡囊。侧时，成熟而分泌泡囊。 分泌的泡囊从亚顶端区移分泌的泡囊从亚顶端区移向顶端，泡囊与细胞膜融合形向顶端，泡囊与细胞膜融合形成细胞膜。同时释放出细胞壁成细胞膜。同时释放出细胞壁分解酶与合成酶，分解酶使壁分解酶与合成酶，分解酶使壁组份间的键断裂，合成酶催化组份间的键断裂，合成酶催化合成新壁成分，并将其转移到合成新壁成分，并将其转移到壁区形成新壁。壁区形成新壁。 二二 微生物的群体生长规律微生物的群体生长规律一、单细胞微生物的生长曲线一、单细胞微生物的生长曲线 将少量细菌纯培养物接种到一恒定容积的将少量细菌纯培养物接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，并保持一定

9、的温度、新鲜液体培养基中，并保持一定的温度、pHpH和和溶解氧量，之后定时取样测定其细菌含量。以溶解氧量，之后定时取样测定其细菌含量。以培养时间为横坐标培养时间为横坐标，以，以细胞数目的对数或生长细胞数目的对数或生长速度为纵坐标作图速度为纵坐标作图，所得的曲线，就是，所得的曲线，就是单细胞单细胞微生物的生长曲线微生物的生长曲线。反映了细菌在新环境中生。反映了细菌在新环境中生长繁殖至衰老死亡全过程的动态变化情况。长繁殖至衰老死亡全过程的动态变化情况。 一般可把典型生长曲线粗分为一般可把典型生长曲线粗分为延滞期延滞期、指数期指数期、稳定期稳定期和和衰亡期衰亡期4个时期。个时期。 延滞期（延滞期（）

10、指数期（指数期（）稳定期（稳定期（）衰亡期（衰亡期（） 延滞期延滞期指数期指数期稳定期稳定期衰亡期衰亡期1.1.延滞期延滞期将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零的一段时不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零的一段时期。也称迟缓期、适应期。期。也称迟缓期、适应期。微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为等。为适应新的环境适应新的环境，产生诱导酶或合成中间代，产生诱

11、导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。谢产物，就需要一段适应期。产生原因产生原因细胞数目虽然没有增加，但细胞内细胞数目虽然没有增加，但细胞内代谢代谢十分活跃十分活跃延滞期的特点延滞期的特点生长速率接近于零；生长速率接近于零；细胞形态变大或增长，一般来说该期细胞形态变大或增长，一般来说该期细胞体积最大；细胞体积最大；细胞内的细胞内的RNA尤其是尤其是rRNA含量增高；含量增高；合成代谢活跃，核糖体、酶类和合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加速，易产的合成加速，易产生诱导酶；生诱导酶；对外界不良条件反应敏感。对外界不良条件反应敏感。 通过遗传学方法改变菌种的遗传特性使迟缓期缩短；通过遗传

12、学方法改变菌种的遗传特性使迟缓期缩短； 利用对数生长期的细胞作为利用对数生长期的细胞作为“种子种子”； 尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； 适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良影响。适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良影响。缩短延滞期的措施缩短延滞期的措施繁殖速度较快的菌种的延滞期一般较短！繁殖速度较快的菌种的延滞期一般较短！接种量增大可缩短甚至消除延滞期！接种量增大可缩短甚至消除延滞期！接种后培养基成分变化不大时延滞期较短！接种后培养基成分变化不大时延滞期较短！利用对数生长期的细胞作为种子！利用对数生长期的细胞作为种子！ 在在

13、细胞处于细胞处于活跃生长活跃生长中，只是中，只是分裂迟缓分裂迟缓。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。2 2. .对数生长期对数生长期又称指数生长期，指生长曲线中紧接着延滞期的一段又称指数生长期，指生长曲线中紧接着延滞期的一段细胞数以细胞数以几何级数增长几何级数增长的时期。的时期。 l生长速率常数生长速率常数R最大，细胞分裂时间最短；最大，细胞分裂时间最短； l细胞平衡生长，菌体内各成分均匀；细胞平衡生长，菌体内各成分均匀； l代谢旺盛；代谢旺盛； l对理化因素敏感；对理化因素敏感； l细胞数以几何级数增长。细胞数以几何级数增长。对数生长

14、期的特点对数生长期的特点延滞期延滞期指数期指数期稳定期稳定期衰亡期衰亡期 代时反映细菌的生长速率代时反映细菌的生长速率。 代时短，生长速率快。代时短，生长速率快。 不同种微生物，代时的变化很大。不同种微生物，代时的变化很大。 多数为多数为13 h，有些，有些 10 min；另一些几小时到几天。；另一些几小时到几天。 同一种微生物，在不同生长条件下其代时不同。同一种微生物，在不同生长条件下其代时不同。 在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的， 因此它是微生物菌种的一个重要特征。因此它是微生物菌种的一个重要特征。代时代时又称世代时间或增代时间，指细胞每分

15、裂一次所需的时间又称世代时间或增代时间，指细胞每分裂一次所需的时间生长速率常数生长速率常数（R）即每小时的分裂次数即每小时的分裂次数（1 1）菌种）菌种（2 2）营养成分）营养成分影响微生物代时长短的因素：影响微生物代时长短的因素：（3 3）营养物浓度）营养物浓度（4 4）培养温度）培养温度不同菌种的代时差别极大 菌名菌名培养基培养基培养温度培养温度代时代时 E. coli（大肠杆菌）（大肠杆菌）肉汤肉汤 3717min E. coli牛奶牛奶 3712.5Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）（产气肠细菌）肉汤或牛奶肉汤或牛奶 371618E. aerogenes 组合组

16、合 372944 B. Cereus（蜡状芽孢杆菌）（蜡状芽孢杆菌）肉汤肉汤3018 B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌）（嗜热芽孢杆菌）肉汤肉汤5518.3 Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌）（嗜酸乳杆菌） 牛奶牛奶376687 Streptococcus lactis（乳酸链球菌）（乳酸链球菌）牛奶牛奶3726 S. lactis乳糖肉汤乳糖肉汤3748 Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）（伤寒沙门氏菌）肉汤肉汤3723.5 Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌）（褐球固氮菌） 葡萄糖葡萄糖2534446Mycob

17、acterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合（结核分枝杆菌）组合3779293Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌）（活跃硝化杆菌）组合组合271200 纳米细菌纳米细菌(nanobacteria) 三天才分裂三天才分裂一次；一次； 九十年代初期从地下九十年代初期从地下数公里发现的超微型细菌，数公里发现的超微型细菌，用代谢产生的用代谢产生的CO2作指标，作指标，计算出这些超微菌的代谢计算出这些超微菌的代谢速率仅为地上正常细菌的速率仅为地上正常细菌的10-15，有人认为它们需要，有人认为它们需要100年才能分裂一次。年才能分裂一次。 营养成分：丰富时，生长快，代时

18、短 影响生长速度及生长量。凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物，称为生长限制因子。 营养物浓度一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比培养温度 在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关大肠杆菌大肠杆菌 10 代时代时860分，分， 15 代时代时120 分，分， 40 代时代时17.5分。分。 营养物浓度对微生物生长速度和菌体产量的影响营养物浓度对微生物生长速度和菌体产量的影响时间时间8.0 mg/mL6.0 mg/mL4.0 mg/mL2.0 mg/mL只最大收只最大收获量受影响获量受影响生长速率和最

19、大收生长速率和最大收获量受影响获量受影响细胞数或菌体量细胞数或菌体量0.2 mg/mL 0.1 mg/mL1.0 mg/mL0.5 mg/mL对数生长期的应用对数生长期的应用 由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种接种的最佳菌龄；的最佳菌龄； 发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。等的良好材料。 3 3. .稳定期稳定期 又称恒定期或最

20、高生长期。这个时期是处于新分又称恒定期或最高生长期。这个时期是处于新分裂增加的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生裂增加的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。该阶段培养液中长相等的动态平衡之中。该阶段培养液中活细菌数最高活细菌数最高并维持稳定。并维持稳定。 营养物尤其是营养物尤其是生长限制因子生长限制因子的耗尽；的耗尽； 营养物的比例失调，例如营养物的比例失调，例如CN比值不合适等；比值不合适等； 酸、醇、毒素或酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；等有害代谢产物的累积； pH、氧化还原势等理化条件越来越不适宜等。氧化还原势等理化条件越来越不适宜等。产生原因

21、产生原因稳定期特点稳定期特点1. 1. 生长速率常数生长速率常数R=0R=0，即新繁殖的细胞数与，即新繁殖的细胞数与衰亡相等，菌体产量达到了最高点；衰亡相等，菌体产量达到了最高点； 2. 2. 细胞开始贮存各种储藏物：如肝糖、异染细胞开始贮存各种储藏物：如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等；颗粒、脂肪粒等； 3. 3. 芽孢细菌在此阶段形成芽孢；芽孢细菌在此阶段形成芽孢；4. 4. 次级代谢产物开始增多并趋向高峰。次级代谢产物开始增多并趋向高峰。延滞期延滞期指数期指数期稳定期稳定期衰亡期衰亡期延长稳定期的措施延长稳定期的措施（1 1）补充营养物质（补料）补充营养物质（补料）（2 2）取走代谢产物）取走代

22、谢产物（3 3）调节）调节pHpH值值（4 4）调节温度）调节温度（5 5）对好氧菌增加通气、搅拌或振荡）对好氧菌增加通气、搅拌或振荡 延长稳定生长期延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或积，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。累更多的代谢产物。4 4. .衰亡期衰亡期 营养物质耗尽和有毒代谢产物大量积累，营养物质耗尽和有毒代谢产物大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。负增长。 外界环境对继续生长越来越不利，例如，营养外界环境对继续生长越来越不利，例如，营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累等，从而引起物质耗尽和有毒代谢产物的大量

23、积累等，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。体死亡。产生原因产生原因衰亡期的特点衰亡期的特点细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。阳性菌变成阴性反应等。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，该时期死亡的细菌以对数方式

24、增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低。由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低。 由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多则不易得到准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测定采用分光光度计测定ODOD值的方法绘制细菌的生长曲线。值的方法绘制细菌的生长曲线。采用分光光度计测定采用分光光度计测定ODOD值的方法绘制生长曲线值的方法绘制生长曲线分光光度计测定分光光度计测定OD值的方法绘制细值的方法绘制细菌的生长曲线菌的生长曲线不能反映衰亡期

25、不能反映衰亡期微生物的二次生长微生物的二次生长 不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。能力是不同的。当培养基中同时含有速效和迟效碳源当培养基中同时含有速效和迟效碳源（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成二次生长二次生长现象。现象。速效碳源（或氮源）：速效碳源（或氮源）：有的物质可直接被利用（例如，有的物质可直接被利用（例如，葡萄糖或葡萄糖或NH4+等）；等）；迟效碳源（或氮源）：迟效碳源（或氮源）：有的需要经过一定的适应期后有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（例如，乳糖或才能获得利用能力（

26、例如，乳糖或NO3-等）。等）。菌丝状微生物（如放线菌、霉菌等）的生长曲线菌丝状微生物（如放线菌、霉菌等）的生长曲线与单细胞微生物存在显著不同，繁殖不是以几何，与单细胞微生物存在显著不同，繁殖不是以几何，级数倍增，一般没有典型的对数生长期。级数倍增，一般没有典型的对数生长期。二、丝状真菌的生长曲线二、丝状真菌的生长曲线以以培养时间培养时间为为横坐标横坐标以以菌丝干重菌丝干重为为纵坐标纵坐标作图作图反映反映丝状微生物群体生长变化规律丝状微生物群体生长变化规律的曲线的曲线生长停滞期生长停滞期迅速生长期迅速生长期衰亡期衰亡期 造成生长停滞的原因：一是孢子萌发前真正的停滞状态，造成生长停滞的原因：一是

27、孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始但还无法测定。另一种是生长已经开始但还无法测定。 菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系。因为菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系。因为它不是单细胞，繁殖不是以几何级数倍增，没有对数生长期。它不是单细胞，繁殖不是以几何级数倍增，没有对数生长期。生长主要表现在生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期等，此时期碳、氮、磷等营养物质被迅速利用，菌体呼吸强度达到高峰，碳、氮、磷等营养物质被迅速利用，菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。有的开始积累代谢产物。3. 衰亡期衰亡期 菌丝体干重下降，

28、一般在短期内失重很快，以后变化不菌丝体干重下降，一般在短期内失重很快，以后变化不再明显，大多数再明显，大多数次级代谢产物次级代谢产物在此期合成。大多数处于衰亡期在此期合成。大多数处于衰亡期的细胞都出现大的的细胞都出现大的空泡空泡。菌体自溶程度因菌种和培养条件而异。菌体自溶程度因菌种和培养条件而异。第二节第二节 微生物的生长与测定方法微生物的生长与测定方法一一 微生物的培养方法微生物的培养方法（一）好氧培养和厌氧培养（一）好氧培养和厌氧培养（二）液体培养和固体培养（二）液体培养和固体培养（三）分批培养和连续培养（三）分批培养和连续培养二二 获得纯培养体的方法获得纯培养体的方法三三 微生物生长的测

29、定方法微生物生长的测定方法1. 好氧培养好氧培养 氧对微生物的生命活动有极其重要影响。好氧氧对微生物的生命活动有极其重要影响。好氧微生物在有氧条件下才能生长，培养时应不断微生物在有氧条件下才能生长，培养时应不断供给空气。供给空气。 试管斜面试管斜面 、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶、茄子瓶等茄子瓶等 一一 微生物的培养方法微生物的培养方法（一）好氧培养和厌氧培养（一）好氧培养和厌氧培养2. 厌氧培养厌氧培养 培养厌氧菌除了需要培养厌氧菌除了需要特殊培养装置特殊培养装置外，还要外，还要配制配制特殊培养基特殊培养基，既要满足，既要满足6种营养要素需种营养要素需求，又要在

30、其中加入求，又要在其中加入还原剂还原剂和和氧化还原电位氧化还原电位的指示剂的指示剂。主要培养方法有：。主要培养方法有：高层琼脂柱高层琼脂柱Hungate滚管技术滚管技术厌氧罐技术厌氧罐技术 将加有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，以培养相应的厌氧菌，在这种培养基中，越是深层，其氧化还原电位越低，因而越有利于厌氧菌的生长。高层琼脂柱高层琼脂柱. . 利用除氧铜柱来制备高纯氮用以驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和储存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了瘤胃微生物和产甲烷菌等严格厌氧菌的存活。用这种方法制作的培养基称为预还原无氧灭菌

31、培养基PRAS。 接种融化PRAS琼脂培养基后用丁基橡胶塞封严平放置冰浴中均匀滚动，使含菌培养基布满在试管内表面上，最后长出许多单菌落。Hungate滚管技术滚管技术 聚碳酸酯制成的透明罐体，上有一可用螺旋夹夹牢的罐盖，盖内中央可放置钯催化剂，罐内放一含美蓝的氧化还原指示剂。罐内可放置10个常用培养皿或试管。装入待培养对象后，密闭罐盖，抽真空-灌氮-抽真空-灌氮-抽真空-灌混合气（氮气：二氧化碳：氢气=80：10：10，体积比）。罐内少量剩余氧会被氢气在催化剂作用下还原，从而造成很高的无氧状态。 美蓝还原为无色 厌氧罐技术厌氧罐技术厌氧手套箱1.1.固体培养固体培养（1 1）斜面培养）斜面培养

32、 用琼脂等固体培养基在试管中制成斜面，在此面用琼脂等固体培养基在试管中制成斜面，在此面上对微生物进行培养。上对微生物进行培养。 形态观察、菌种保藏形态观察、菌种保藏（2 2）平板培养）平板培养将琼脂或明胶等凝胶状固体培养基制成平面状，然将琼脂或明胶等凝胶状固体培养基制成平面状，然后在此平面上培养微生物或多细胞生物的细胞、组后在此平面上培养微生物或多细胞生物的细胞、组织或器官，这种培养称为平板培养。培养皿、克氏织或器官，这种培养称为平板培养。培养皿、克氏瓶、罗氏瓶、锥形瓶等。观察菌落形状，检测菌落瓶、罗氏瓶、锥形瓶等。观察菌落形状，检测菌落数目，测定抗生素效价等数目，测定抗生素效价等（二）液体培

33、养和固体培养（二）液体培养和固体培养2.2.液体培养液体培养（1 1）静止培养静止培养： 接种后的液体静止不动。接种后的液体静止不动。（2 2）摇瓶振荡培养摇瓶振荡培养：将待测菌株的单菌落接种到三：将待测菌株的单菌落接种到三角瓶培养液中，震荡培养。通过调节震荡速度调节角瓶培养液中，震荡培养。通过调节震荡速度调节供氧量。供氧量。（3 3）发酵罐培养发酵罐培养： 实验室较大量的通气扩大培养实验室较大量的通气扩大培养可采用罐容在可采用罐容在5-30L5-30L的小型发酵罐，以供给培养所需的小型发酵罐，以供给培养所需营养物质和氧气，使培养物均匀生长，进而大量生营养物质和氧气，使培养物均匀生长，进而大量

34、生产微生物细胞或代谢产物，并可在实验过程中得到产微生物细胞或代谢产物，并可在实验过程中得到必要的数据。必要的数据。工业上大型发酵罐，工业上大型发酵罐，3000m3000m3 3, ,计算机自动控制，在线计算机自动控制，在线监测，自动收集和分析数据。监测，自动收集和分析数据。fermenter分批培养分批培养（batch culture）： 将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入，不再补充和更换，最后一次性收获。一次性加入，不再补充和更换，最后一次性收获。培养基一培养基一次加入，不予补充，不再更换。次加入，不予补充，不再更换。连

35、续培养连续培养（continuous culture）： 在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除老菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时同时排除老菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。处于某种稳定状态。培养过程中不断地培养过程中不断地补充营养物质，补充营养物质，和以和以同样的速率同样的速率移出培养物移出培养物（三）分批培养和连续培养（三）分批培养和连续培养连续培养的基本原理：连续培养的基本原理：由于对

36、典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。培养技术。当微生物在单批培养方式下生长达到对数当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基流进新鲜培养基并搅并搅拌，另一方面以溢流方式拌，另一方面以溢流方式流出培养液流出培养液，使培养物达到，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期长期保持对数期的平衡的平衡生长状态和稳定的生长速率生长状态和稳定的生长速率。根据根据

37、连续培养连续培养控控制方式的不同制方式的不同恒浊连续培养恒浊连续培养通过调节培养基流速，使培养液浊通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。度保持恒定的连续培养方法。恒浊恒浊器器（turbidostat），不断调节流速，不断调节流速而使细菌培养液而使细菌培养液浊度浊度保持恒定保持恒定恒化连续培养恒化连续培养采用采用恒定流速恒定流速使营养物质浓度恒使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方定而保持细菌生长速率恒定的方法。法。恒化器恒化器（chemostat 或或 bactogen）， 保持恒定的保持恒定的流速流速最简单的连续培养装置包括：最简单的连续培养装置包括：培养室培养室、无

38、菌培养基储存器无菌培养基储存器和调流速的和调流速的控制系统控制系统。 连续培养的主要参数连续培养的主要参数 稀释率稀释率D （h-1）：即培养基每）：即培养基每小时流过培养容器的体积数。小时流过培养容器的体积数。D= =培养基的流动速率培养基的流动速率 培养室的容积培养室的容积FV无菌培养基储存器无菌培养基储存器培养室培养室调节流速的调节流速的控制阀控制阀特点：特点：基质过量基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，繁琐。工艺复杂，繁琐。应用范围：应用范围： 用于生产大量菌体、生产

39、与菌体生长相用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。恒浊连续培养恒浊连续培养 恒浊器（恒浊器（turbidostat）是一种根据培养器内微生是一种根据培养器内微生物的生长密度，借光电控物的生长密度，借光电控制系统来控制培养液流速，制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的速度恒定的微生物细胞的连续培养器。连续培养器。恒浊培养系统恒浊培养系统 1. 盛无菌培养基的储存器盛无菌培养基的储存器 2. 控制流速阀控制流速阀 3. 培养室培养室 4. 排出管排出管 5. 光源光源 6. 光电

40、池光电池 7. 排出物排出物 当培养室中浊度超过预期数值时，流速加快，浊度降低；当培养室中浊度超过预期数值时，流速加快，浊度降低；当培养室中浊度低于预期数值时，流速减慢，浊度升高当培养室中浊度低于预期数值时，流速减慢，浊度升高特点：特点： 维持营养成分的维持营养成分的亚适量亚适量，控制微生物生长，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一，密度稳速率。菌体生长速率恒定，菌体均一，密度稳定，产量低于最高菌体产量。定，产量低于最高菌体产量。遗传学：突变株分离；遗传学：突变株分离；生理学：不同条件下的代谢变化；生理学：不同条件下的代谢变化；生态学：模拟自然营养条件建立实验模型。生态学：模拟自然营

41、养条件建立实验模型。应用范围：应用范围： 恒化连续培养恒化连续培养 恒化器（恒化器（chemostat或或bactogen） 是一种设法使培养液是一种设法使培养液流速保流速保持不变持不变，并使微生物始终在接近，并使微生物始终在接近其最高生长速率条件下进行生长其最高生长速率条件下进行生长繁殖繁殖的一种连续培养装置。的一种连续培养装置。 它通过控制它通过控制某一种营养物某一种营养物的的浓度，使其始终成为浓度，使其始终成为生长限制因生长限制因子子的条件下达到的，因而可称为的条件下达到的，因而可称为外控制式的连续培养装置。外控制式的连续培养装置。 恒化培养系统恒化培养系统 1. 盛无菌培养基的储存器盛

42、无菌培养基的储存器 2. 控制流速阀控制流速阀 3. 培养室培养室 4. 排出管排出管 7. 排出物排出物 连续发酵与单批发酵相比的优点：连续发酵与单批发酵相比的优点：（1）高效高效，简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵，简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵 罐等单元操作，从而罐等单元操作，从而缩短生产周期，提高设缩短生产周期，提高设 备利用率备利用率；（2）自控自控，便于利用各种仪表进行自动控制；，便于利用各种仪表进行自动控制；（3）产品质量稳定产品质量稳定；（4）节约节约，节省大量动力、人力、水和蒸汽，节省大量动力、人力、水和蒸汽， 且且 使水、汽、电的负荷均衡合理。使水、汽、电的负荷均衡合理。连

43、续培养应用于生产就称为连续发酵连续培养应用于生产就称为连续发酵连续发酵与单批发酵相比的缺点：连续发酵与单批发酵相比的缺点：（1）菌种易于退化；）菌种易于退化；（2）易于遭到杂菌污染；）易于遭到杂菌污染；（3）营养物利用率低于单批培养。）营养物利用率低于单批培养。 所以，连续发酵的生产时间受以上因素限制，所以，连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月至一般只能维持数月至 1年。年。二二 获得纯培养体的方法获得纯培养体的方法 在自然界中哪怕是在自然界中哪怕是1 1克土壤或一滴污水，都克土壤或一滴污水，都常常生长着多种微生物，而他们总是混杂在一起常常生长着多种微生物，而他们总是混杂在一起生

44、活着。要想研究或利用其中的一种微生物，首生活着。要想研究或利用其中的一种微生物，首先必须将其从混杂的微生物类群中分离出来，进先必须将其从混杂的微生物类群中分离出来，进而得到只含该微生物的纯培养。而得到只含该微生物的纯培养。 所谓所谓纯培养纯培养，就是指从一个细胞或一群相同，就是指从一个细胞或一群相同的细胞繁殖得到后代。的细胞繁殖得到后代。纯培养技术是进行微生物学研究的重要方法纯培养技术是进行微生物学研究的重要方法微生物纯培养的获得微生物纯培养的获得 平皿划线分离法平皿划线分离法 稀释平皿分离法稀释平皿分离法 单细胞挑取法单细胞挑取法 （二）利用选择性培养基分离法（二）利用选择性培养基分离法 （

45、一）稀释分离法（一）稀释分离法 1. 稀释平皿分离法稀释平皿分离法 2.2.平皿划线分离法平皿划线分离法 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线连续划线 ，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。经培养后，可在平板表面得到单菌落。 3. 单细胞挑取法单细胞挑取法 采取显微分离法从混杂群体中采取显微分离法从混杂群体中直接分离单直接分离单个细胞个细胞或或单个个体单个个体进行培养以获得纯培养

46、。进行培养以获得纯培养。 在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。培养。 4 4.选择性培养基分离法选择性培养基分离法 各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制适合某种微生物而限制其它微生物生长的选择培

47、适合某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。养基，用它来培养微生物以获得纯培养。 v 高温下培养：高温下培养： 分离嗜热细菌；分离嗜热细菌；v 培养基中不含培养基中不含N N： 分离固氮菌；分离固氮菌；v 培养基加抗生素培养基加抗生素：分离抗性菌；分离抗性菌；v 无氧环境下：无氧环境下： 分离厌氧菌。分离厌氧菌。微生物纯培养分离方法的比较微生物纯培养分离方法的比较分离方法分离方法应用范围应用范围平皿划线法平皿划线法方法简便，多用于分离细菌方法简便，多用于分离细菌稀释倒平皿法稀释倒平皿法既可定性，又可定量，用途广泛既可定性，又可定量，用途广泛单细胞挑取法单细胞挑

48、取法局限于高度专业化的科学研究局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法利用选择培养基法适用于分离某些生理类型较特殊适用于分离某些生理类型较特殊的微生物的微生物个体计数个体计数群体重量测定群体重量测定群体生理指标测定群体生理指标测定评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制( (或杀死或杀死) )作作用的效果；用的效果；客观地反映微生物生长的规律。客观地反映微生物生长的规律。三三 微生物生长的测定方法微生物生长的测定方法单细胞状态的细菌和酵母菌单细胞状态的细菌和酵母菌放线菌和霉菌等

49、丝状生长的微生物放线菌和霉菌等丝状生长的微生物计算其孢子数计算其孢子数计算各个体的数目计算各个体的数目一、计数法一、计数法1. 显微镜直接计数法显微镜直接计数法2. 比浊法比浊法（一）细胞总数的测定（一）细胞总数的测定1. 显微镜直接计数法显微镜直接计数法采用特殊的采用特殊的计数板计数板（血球计数板血球计数板或或细菌计数器细菌计数器），），在普通光学或相差在普通光学或相差显微镜显微镜下直接观察并记录一定下直接观察并记录一定体积中的平均细胞数。体积中的平均细胞数。仅适用于细菌、酵母等单细胞的微生物类群仅适用于细菌、酵母等单细胞的微生物类群血球计数板基本原理：血球计数板基本原理： 将将0.1 mm

50、3( (1/10 000 mL) )的薄层空间划分为的薄层空间划分为400小小格，从中均匀分布地选取格，从中均匀分布地选取80或或100小格，计数其中的小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。血球计数板血球计数板 适用于个体较大细胞或颗粒，如血细胞、适用于个体较大细胞或颗粒，如血细胞、酵母菌和霉菌的孢子等酵母菌和霉菌的孢子等, 不适用于细菌等个体较小细胞。不适用于细菌等个体较小细胞。细菌细胞太小，可用细菌细胞太小，可用Peteroff-Hauser计菌器和计菌器和Hawksley计菌器计菌器（可以使用油镜，因此可以直接计数细菌）。（可以使用油镜，

51、因此可以直接计数细菌）。缺点：缺点：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的菌体浓度；需要相对高的菌体浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。个体小的细菌在显微镜下难以观察。优点：优点：快速，准确，快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率。对酵母菌可同时测定出芽率。改进：改进： 染色后活菌计数法染色后活菌计数法 采用特定的染色技术进行活菌染色，然后用光学显采用特定的染色技术进行活菌染色，然后用光学显微镜计数的方法。可分别对活菌和死菌进行计数。微镜计数的方法。可分别对活菌和死菌进行计数。细菌经细菌经吖吖啶橙啶橙染色后，在紫外光显微镜下可观察：

52、染色后，在紫外光显微镜下可观察：活细胞活细胞橙色荧光橙色荧光死细胞死细胞绿色荧光绿色荧光酵母细胞采用酵母细胞采用美蓝染色美蓝染色酵母活细胞酵母活细胞无色；无色；酵母死细胞酵母死细胞蓝色。蓝色。 将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。的比例直接推算待测微生物细胞浓度。比例计数法比例计数法过滤计数法过滤计数法 当样品中菌数很低时，可以将一定体积的样品当样品中菌数很低时，可以将一定体积的样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理通过膜过滤器

53、。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上（或一定面积中）使膜透明，再在显微镜下计算膜上（或一定面积中）的细菌数。的细菌数。 在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度（光密度（optical density, 即即OD）表示菌量。一表示菌量。一般对般对无色的微生物无色的微生物悬浮液进行测定，一般选用悬浮液进行测定，一般选用450650 nm波段。波段。2. 比浊法比浊法 实验测量时应将测量值控制在菌浓度与光密度成正比实验测量时应将测量值控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。的线性范围内，否则不准确。 若要连续跟踪某一培养物

54、的生长动态，例如，测定若要连续跟踪某一培养物的生长动态，例如，测定生长曲线时可用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定，即不生长曲线时可用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定，即不必取样。必取样。（二）活细菌数量的测定（二）活细菌数量的测定 是一种是一种活菌计数法活菌计数法，这是一种依据活菌在，这是一种依据活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上液体培养基中会使其变混或在固体培养基上（内）形成菌落的原理而设计。（内）形成菌落的原理而设计。1. 稀释平皿计数法稀释平皿计数法3. 浓缩法（滤膜法）浓缩法（滤膜法）2. 最大概率法最大概率法1. 稀释平皿计数法稀释平皿计数法 在高度稀释条件下，微生物细胞充分分在高

55、度稀释条件下，微生物细胞充分分散形成单个细胞，每个活的单细胞均能繁殖散形成单个细胞，每个活的单细胞均能繁殖形成一个菌落，通过平皿培养的方法使其生形成一个菌落，通过平皿培养的方法使其生长，并统计长出的菌落数，进而推算待测样长，并统计长出的菌落数，进而推算待测样品中的活菌数。品中的活菌数。 迄今仍广泛使用的活菌计数法，可反映迄今仍广泛使用的活菌计数法，可反映样品中样品中活菌活菌的数量。的数量。稀释平皿计数法：稀释平皿计数法：样品充分混匀；样品充分混匀；每支移液管及涂布棒最每支移液管及涂布棒最好只接触一个稀释度的好只接触一个稀释度的菌液；菌液；同一稀释度三个以上重同一稀释度三个以上重复，取平均值；复

56、，取平均值；每个平板上的菌落数目每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；合适，便于准确计数；涂布涂布平板平板法法倾注平板法倾注平板法 一个菌落可能是多个细胞一起形成，一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用所以在科研中一般用菌落形成单位菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，来表示，而不是直接表示为细胞数。而不是直接表示为细胞数。优点：优点： 此方法最为常用，适用于此方法最为常用，适用于测定细菌、酵母测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况菌等单细胞微生物的生长情况。缺点：缺点： 操作较繁琐，故要求操作者技术熟练、准操作较繁琐，故要求操作者技术熟练、

57、准确，确，否则难以得到正确的结果。否则难以得到正确的结果。 不适于霉菌等多细胞微生物测定。不适于霉菌等多细胞微生物测定。技术要求：技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速，严格无样品充分混匀，操作熟练快速，严格无 菌操作；菌操作；注意事项注意事项：每一支吸管只用于一个稀释度，样品混每一支吸管只用于一个稀释度，样品混 匀处理，倾注平板时的培养基温度；匀处理，倾注平板时的培养基温度；适用范围适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂 上生长的微生物；上生长的微生物；误差：误差：主要误差来源是多次稀释造成的，其次还有主要误差来源是多次稀释造成的，其次还有 样品内菌体分

58、布不均匀以及不当操作。样品内菌体分布不均匀以及不当操作。2. 最大概率法最大概率法 对未知样品进行一系列十倍稀释，每个稀释度平对未知样品进行一系列十倍稀释，每个稀释度平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性。进行统计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性。 会看到在一定稀释度以前会看到在一定稀释度以前平行试管中有菌生长，平行试管中有菌生长，在这些稀释度以后平行试管中不再有菌生长。将最后在这些稀释度以后平行试管中不再有菌生长。将最后三级有菌生长的稀释度称为临界级数，三级有菌生长的稀释度称为临界级数，然后根据数学然

59、后根据数学统计计算出样品中的微生物数目。统计计算出样品中的微生物数目。优点：优点：主要适用于只能进行液体培养的微生物，或采主要适用于只能进行液体培养的微生物，或采用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微生物。用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微生物。缺点：缺点：结果较粗放结果较粗放。3. 浓缩法（滤膜法）浓缩法（滤膜法） 对于测定像空气、水等体积大而且含菌浓度较对于测定像空气、水等体积大而且含菌浓度较低的样品中的活菌数时，应先将待测样品通过微孔低的样品中的活菌数时，应先将待测样品通过微孔薄膜（如硝酸纤维素薄膜）过滤富集，再与膜一起薄膜（如硝酸纤维素薄膜）过滤富集，再与膜一起放到合适的培养基或浸

60、有培养液的支持物表面上培放到合适的培养基或浸有培养液的支持物表面上培养，最后可根究菌落数推算出样品含菌数。养，最后可根究菌落数推算出样品含菌数。 霉菌的生长表现为菌丝的伸长和分枝，可以以其菌落的直径或面积作为生长的指标。 平皿培养法：将霉菌接种在平皿中央，在一定的时间内测量菌落的直径和面积，直到菌落掩盖全皿为止。由此可求出菌丝的平均生长速度并绘制生长曲线。缺点：不能反映菌丝总量。 U形管培养法： 将霉菌自管的一端孔口接到管内的培养基上，经一定时间间隔测菌丝长度。优点：实验时间长且不易污染，缺点是不能测菌丝总量，不易挑出菌丝和孢子作检查，且通气不良。（三）丝状真菌、霉菌生长的测定（三）丝状真菌、