酶工程第二章产酶微生物的分离和选育

1、 酶活力的表示方法酶活力的表示方法活力单位活力单位（active unit） 习惯单位（习惯单位（U）: 底物底物(或产物或产物)变化量变化量 / 单位时间单位时间 国际单位（国际单位（IU）: 1moL变化量变化量 / 分钟分钟 Katal（Kat）：）：1moL变化量变化量 / 秒秒比活力比活力=总活力单位总活力单位总蛋白总蛋白mg数数= U(或或IU) mg蛋白蛋白量度酶催化能力大小量度酶催化能力大小量度酶纯度量度酶纯度比活力比活力（specific activity）回收率和纯化倍数回收率和纯化倍数回收率回收率 100每次总活力每次总活力第一次总活力第一次总活力纯化倍数纯化倍数每次比活

2、力每次比活力第一次比活力第一次比活力1kSE 1kES 2kEP 第二章第二章 产酶微生物的分离和选育产酶微生物的分离和选育 1.1产酶产酶微生物微生物1.2分离和筛选分离和筛选1.3诱变育种诱变育种1.4基因育种基因育种程育种程育种1.5原生质体原生质体融合育种融合育种教教 学学 内内 容容1.1 产酶微生物 微生物产酶的优势 1、种类多，产能高，酶种类多样化2、周期短，繁殖快，培养简单、成本相对低3、易突变，易选育获得高产菌株4、易进行基因工程改造 从自然界中分离出来直接利用； 对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能利用。 使用重组DNA技术改造的菌株从野生菌转向变异菌；自然选育转向代谢育

3、种；诱发基因突变转向基因重组的定向育种目前育种总趋势：工业生产常用的微生物：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌51、细菌 2、放线菌 属原核单细胞生物，有球菌、杆菌和螺旋菌三类，属原核单细胞生物，有球菌、杆菌和螺旋菌三类，分革兰氏阳性菌和阴性菌。在发酵专业中常用的是杆菌，分革兰氏阳性菌和阴性菌。在发酵专业中常用的是杆菌，它易形成芽孢。它易形成芽孢。 属原核生物，菌落呈放射状，广泛存在于泥土中，属原核生物，菌落呈放射状，广泛存在于泥土中，最大经济价值是用来生产抗生素。最大经济价值是用来生产抗生素。3、霉菌 属真核生物，俗称丝状真菌。在发酵工业、农业、食品属真核生物，俗称丝状真菌。在发酵工业、农业、食品和

4、皮革等方面有重要用途，但易引起工业原料、产品和农副和皮革等方面有重要用途，但易引起工业原料、产品和农副产品的发霉变质。产品的发霉变质。4、酵母菌 属真核单细胞生物，主要生长在偏酸含糖量较高的属真核单细胞生物，主要生长在偏酸含糖量较高的环境中，酒精、饮料等生产中有重要用途。环境中，酒精、饮料等生产中有重要用途。1.1.1 产产酶微生物的种类酶微生物的种类 6 工业生产常用的细菌有工业生产常用的细菌有 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 乳酸杆菌乳酸杆菌(Lactobacillus lactics) 醋酸杆菌醋酸杆菌(Acetobacter) 棒状杆菌棒状杆菌(Cory

5、nebacterium) 短杆菌短杆菌(Brevibacterium) 用于生产：用于生产： 生产淀粉酶生产淀粉酶(amylase） 蛋白酶（蛋白酶（proteinase） 乳酸乳酸(lactic acid) 醋酸醋酸(acetic acid) 氨基酸氨基酸(amino acid) 肌苷酸肌苷酸(inosinic acid) 细菌（细菌（bacteria）： 基因工程常用宿主（工程）菌之一。7 放线菌放线菌(Actinomycetes) 常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。 最大经济价值在于能产生多种抗生素多种抗生素（antibiotics）。）。从微生物中发现

6、的抗生素，有60%以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。8 酵母菌（酵母菌（yeast） 工业上用的酵母菌有：啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)、类酵母(Saccharomycodes)等用于酿酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（lipase），以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。 基因工程常用宿主（工程）菌之一。基因工程常用宿主（工程）菌之一。9 霉菌（霉菌（mould）工业上常用的霉菌有：工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等；

7、产品产品： 酶制剂（enzyme preparation）、抗生素(antibiotic)、有机酸（organic acid）及甾体激素（steroid hormone） 等。10几种菌落11常见酶u蛋白酶u酸性蛋白酶u中性蛋白酶u碱性蛋白酶u糖化酶u淀粉酶u脂肪酶u纤维素酶1.1.2 微生物酶的种类医药与分析研究用酶u青霉素酰化酶uSODu溶栓酶u透明质酸酶121.1.3 产酶微生物的来源 向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种 土壤 水体 空气 极端环境13菌落数与空气清洁度的关系空气清洁度菌落数最清洁的空气1洁净空气30个以下普通空气30

8、-150轻度污染空气300以下严重污染空气301以上14 微生物工业对菌种的要求P55 作为大规模生产，对菌种有下列要求： (1)产酶量高、易分离。 (2)易于控制培养条件，酶活性高；发酵周期较短。 (3)非致病菌、不产生任何有害的物质和毒素， (4)菌株稳定、抗杂菌和抗噬菌体能力强。15分离思路分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。第二节第二节 产酶微生物的分离和筛选产酶微生物的

9、分离和筛选 从自然界筛选从自然界筛选17 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。新种分离与筛选的新种分离与筛选的步骤（步骤（P56）（一）样品采集从大自然中分离筛选新的微生物菌种纤维素酶：堆积和腐烂纤维素区域，如腐烂树干上；果胶酶：霉烂果蔬淀粉酶：酿酒厂、淀粉厂周围土壤、污泥、排水中

10、蛋白酶：屠宰场、豆制品厂污泥中。土壤分离为主要来源：15cm处土壤19农田上层 15cm 处微生物的数量微生物每克土壤中的数量细菌9.8107放线菌2.0106真菌1.2105藻菌2.5104原生动物3.0104方法：35个取样点、10g/点，混合后于灭菌纸袋中，标记：地点、日期、土壤性质、植被情况及pH。采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。20方方 法法 为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。1土样采集方法土样采集方

11、法 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集； 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面515cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。2 2植物体采集方法植物体采集方法 在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。 采集植物根及根系时，将洗净的根装入采样袋中。3 3水样采集方法水样采集方法 用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中

12、采集水样。 方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4下贮存。（二）增殖培养（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。富集方法富

13、集方法1、添加特殊的营养物质2、调整培养基的酸碱性3、控制培养温度和热处理4、添加抑制剂（三）培养分离（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。1.稀释平皿分离法1.稀释平皿分离法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀 释1.稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法涂布平皿分离法a.倾注平皿分离法倾注平皿分离法2.平皿划线分离

14、法 a. 连续划线分离法 b. 分区划线分离法（四）筛（四）筛 选选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。（五）毒性试验（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。优良菌种应具备的特征优良菌种应具备的特征对菌种的要求对菌种的要求 天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选育。

15、育。1.生产力：生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产 物的产量高，其它代谢产物少物的产量高，其它代谢产物少2.操作性：操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离培养条件简单，发酵易控制，产品易分离3.稳定性：稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化4.安全性：安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素优良菌种应具备的特征优良菌种应具备的特征 选择生产菌种应注意的因素1.原料方面：原料方面：广，转化率高；广，转化率高；2.产物方面：产物方面：目的产物含量高，副产

16、物少；目的产物含量高，副产物少；3.菌体方面：菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定4. 设备方面设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。：产泡沫少，适宜大罐生产。（培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强（培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）从自然界中分离筛选菌种的方法步骤从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 方法、地点、时间和周围环境记录方法、地点、时间和周围环境记录纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：1稀释分离法稀释分离法 2平板划线分离法平板划

17、线分离法 涂菌：涂菌： 划线分离：划线分离：分步划线法；一次划线法：分步划线法；一次划线法： 3组织分离法组织分离法 二、诱变剂和诱变处理 物理诱变剂：物理诱变剂： 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。 化学诱变剂：化学诱变剂： 如碱基类似物、烷化剂等。 ：化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。 1. 使用经济方便使用经济方便 2. 专一性专一性 不同药剂对不同植物、组织或细胞、染色体不同药剂对不同植物、组织或细胞、染色体节段、基因的诱变有一定专一性。节段、基因的诱变有一定专一性

18、。 3. 诱变机制与辐射育种不同诱变机制与辐射育种不同辐射诱变因高能射线造成，染色体结构变异辐射诱变因高能射线造成，染色体结构变异广泛广泛化学诱变是化学药剂与遗传物质发生生化反化学诱变是化学药剂与遗传物质发生生化反应，结果多是基因的点突变，所以更为适用应，结果多是基因的点突变，所以更为适用。 注意：致癌剂三、诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理筛选保藏2.制备细胞悬液要求：要求： 菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长； 细胞分散且为单细胞，以避免细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（表型迟延现象（phenotypic lagphen

19、otypic lag）; ;方法：方法： 玻璃珠打散玻璃珠打散10-15min; 10-15min; 加加.3%.3%吐温吐温8080（表面活性剂）（表面活性剂） 用无菌脱脂棉过滤。用无菌脱脂棉过滤。 制备：制备： 物理诱变剂物理诱变剂生理盐水（生理盐水（0.85%NaCl) 0.85%NaCl) 化学诱变剂化学诱变剂缓冲液缓冲液 浓度：浓度： 细菌、放线菌细菌、放线菌 10108 8个个/ml /ml 霉菌、酵母菌霉菌、酵母菌 10106 6个个/ml/ml指某一突变在指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，复制和细胞分裂后，才在表型上显示出才在表型上显示出来，造成不纯的菌来，造成不纯的菌落。落

20、。分离性迟延现象分离性迟延现象生理性迟延现象生理性迟延现象why3.诱变处理：诱变剂的作用：诱变剂的作用： 提高突变的频率 扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动剂量的表示法：剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在7080%）l选择诱变剂的种类：选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高

21、效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。l简便有效的诱变方法：简便有效的诱变方法：紫外线紫外线的照射最为方便。 化学诱变剂化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反应的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种。 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速

22、筛出大量的筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。透明圈法：透明圈法：混浊底物被分解后形成透明圈。如混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。可溶性淀粉、碳酸钙等。变色圈法：变色圈法：直接用显色剂或指示剂。直接用显色剂或指示剂。生长圈法：生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养条物作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈。成生长圈。抑制圈法抑制圈法

23、：琼脂块培养法。：琼脂块培养法。 1 1、复印技术、复印技术 2 2、大通量筛选（琼脂块法）、大通量筛选（琼脂块法）孢子菌悬液诱变剂琼脂平皿29度，3d6mm打孔器取出放入另一平皿温度，4-5d生物鉴定板17-18h复筛：则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。第一轮：第一轮：一个出发菌株一个出发菌株选出选出200个菌株个菌株选出选出50株株选出选出5株株诱变处理初筛（每瓶一株）复筛（每瓶四株）第二轮：第二轮：5个出发菌株个出发菌株 选出选出50株株

24、 选出选出5株株40株株40株株40株株40株株40株株诱变处理初筛复筛（每瓶一株）（每瓶四株）紫外线的诱变育种紫外线的诱变育种 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。例子例子： 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下

25、进行。 (二)操作步骤 1将细菌培养液以3000rmin离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。 2将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达107个ml左右，作为待处理菌悬液。 3取24m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。 4取未照射的制备菌液和照射

26、菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120rmin振荡培养46h。 6取中间培养液稀释分离、培养。 7挑取菌落进行筛选。亚硝基胍诱变曲霉菌亚硝基胍诱变曲霉菌 N甲基N-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸， 直 接 作 用 于 细 胞 内 的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。 (二)操作步骤 1单孢子悬液制备 取斜面，加入6ml 0.1molL pH6.

27、o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个ml，此为待处理孢子悬液。 2MNNG溶液的制备 用分析天平称取2mg，加入2ml 0.1molL pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。3诱变处理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30 3天后计数。 4死亡率计算 将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离， 30下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。 5挑取菌落进行糖化酶及蛋白

28、酶产量筛选第四节第四节 基因育种基因育种 定义：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达， 或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另个细胞的方法。一、步骤一、步骤、获得待克隆的、获得待克隆的DNA片段（基因）；片段（基因）；、目的基因与载体在体外连接；、目的基因与载体在体外连接；、重组、重组DNA分子导入宿主细胞；分子导入宿主细胞；、筛选、鉴定阳性重组子；、筛选、鉴定阳性重组子；、重组子的扩增与或表达。、重组子的扩增与或表达。 （一）载体（一）载体（

29、Vector）的选择）的选择种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。选择标准：选择标准：、能在适当的宿主细胞中复制；、能在适当的宿主细胞中复制；、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点） 以便外源以便外源DNADNA插入；插入；、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNADNA与与 宿主宿主DNADNA便于分离；便于分离；、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动、对于表达型载体还应具有与宿主

30、细胞相适应的启动 子、增强子、加尾信号等基因表达元件。子、增强子、加尾信号等基因表达元件。二、载体系统二、载体系统 是存在于细是存在于细菌染色体外的小菌染色体外的小型环状双链型环状双链DNADNA分子分子, ,大小约为大小约为数千碱基对。常数千碱基对。常有有1 31 3个抗药个抗药性基因，以利于性基因，以利于筛选。筛选。(二二)质粒载体（质粒载体（Plasmid）抗生素标记： tetrampr r常用质粒载体： pBR322质粒载体质粒载体pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori

31、(4.36 kb)(4.36 kb) pBR322质粒是由质粒是由3个不同来源的部分组成个不同来源的部分组成的的:含有氨卡青霉素抗性基因（含有氨卡青霉素抗性基因（ampr)、四、四环素抗性基因环素抗性基因(tetr)和和DNA复制起点复制起点(ori)。 pBR322质粒载体较小质粒载体较小,其长度为其长度为4363bp。不仅易于纯化，而且即使携带上一段较大不仅易于纯化，而且即使携带上一段较大（6-8kb）的外源）的外源DNA片段，操作起来仍片段，操作起来仍较为便利。较为便利。 pBR322质粒载体具有两种抗生素抗性基因以质粒载体具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号，方便选择。例如，用

32、作转化子的选择记号，方便选择。例如，将外源将外源DNA克隆在克隆在Bam H I位点上，将这样位点上，将这样的重组质粒转化到野生型大肠杆菌细胞中，的重组质粒转化到野生型大肠杆菌细胞中，并涂布在含有氨卡青霉素的选择性培养基平并涂布在含有氨卡青霉素的选择性培养基平板上，那么存活下来的菌落都将具有板上，那么存活下来的菌落都将具有Ampr的的表型，它们也必定是获得了编码有这种抗性表型，它们也必定是获得了编码有这种抗性基因的转化子。基因的转化子。 具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积细胞中可累积10003000个拷贝，为重组体个拷贝，为重组体DNA的制

33、备提供了极大的方便。的制备提供了极大的方便。三、重组三、重组DNADNA中常用的工具酶中常用的工具酶 包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等.限制性内切酶限制性内切酶 切开DNA分子所需的酶：每一种酶都有其各自的作用位点。 常用限制性内切酶 种类及特性限制性内切酶的剪切方式限制性内切酶的剪切方式 粘性未端：切开后的两段粘性未端：切开后的两段DNADNA各留下一个各留下一个尾，这尾，这2 2个尾的核苷酸顺序完全一样，但个尾的核苷酸顺序完全一样，但是方向相反。它们之间是互补的，在适是方向相反。它们之间是互补的，在适当条件下可以再连接一起。当条件下可以再连接一起。其它工具酶其它

34、工具酶 聚合聚合酶酶T4 DNA 修补工具酶修补工具酶DNA聚合酶聚合酶I 末端加工酶末端加工酶S1核酸酶核酸酶 ， 碱性磷酸单脂酶碱性磷酸单脂酶 末端转移酶末端转移酶人工加人工加polyA 或或polyT 尾尾 反转录酶反转录酶四、目的基因的获取四、目的基因的获取一、通过建立基因文库分离靶基因基因文库包括两类：基因组文库：利用限制性内切酶。cDNA：用mRNA反转录成单链DNA，再经DNA聚合酶的作用产生双链DNA。可去除真核生物基因中不表达的内含子。二、化学合成法制备二、化学合成法制备DNADNA片段片段 从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，再依照

35、密码合成基因。它的遗传密码，再依照密码合成基因。三、聚合酶链反应法扩增基因片段三、聚合酶链反应法扩增基因片段 对于已知全部或部分核苷酸序列的基对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚合酶链反应（），因，可以通过聚合酶链反应（），以基因组以基因组DNADNA或或cDNAcDNA模板扩增得到目的基模板扩增得到目的基因片段。因片段。PCRPCR技术技术 根据需扩增片段的两端设计引物。根据需扩增片段的两端设计引物。 使使DNADNA解链（高温），引物结合于基因的解链（高温），引物结合于基因的两端（低温），在合适温度下开始合成两端（低温），在合适温度下开始合成（链延长）反应。（链延长）反应。 特点

36、：需要很少的特点：需要很少的DNADNA模板，且能直接从模板，且能直接从基因组中得到目的基因。基因组中得到目的基因。DNADNA扩增扩增PCRPCR反应反应 DNADNA分子的体外连接分子的体外连接 DNADNA片段的体外连接是重组片段的体外连接是重组DNADNA技术的技术的关键。关键。DNADNA连接是由连接是由DNADNA连接酶催化完成连接酶催化完成的。的。 DNA DNA连接酶催化两条双链连接酶催化两条双链DNADNA片段相邻片段相邻的的5 5- -磷酸和磷酸和3 3- -羟基间形成磷酸二酯键。羟基间形成磷酸二酯键。 在分子克隆中最有用的的在分子克隆中最有用的的DNADNA连接酶连接酶是

37、来自噬菌体的是来自噬菌体的DNA DNA 连接酶。连接酶。 T4 DNAT4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于：连接酶在分子克隆中主要用于：、连接具有同源互补粘性末端的片、连接具有同源互补粘性末端的片段；段；、连接双链、连接双链DNADNA分子间的平端；分子间的平端；、在双链平端的、在双链平端的DNADNA分子上添加合成的人分子上添加合成的人工接头或适配子。工接头或适配子。五、重组五、重组DNADNA导入宿主菌导入宿主菌 体外连接的重组体外连接的重组DNADNA分子必须导入分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性增殖和表达。根

38、据所采用的载体的性质，将重组质，将重组DNADNA分子导入受体可有不分子导入受体可有不同的方法。同的方法。重组重组DNADNA的鉴定的鉴定 遗传学方法遗传学方法五、载体宿主系统五、载体宿主系统 载体载体(vector)(vector)是携带外源是携带外源DNADNA进入宿主进入宿主细胞进行扩增和表达的细胞进行扩增和表达的DNADNA； 一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。构建的。宿主细胞必须符合以下条件宿主细胞必须符合以下条件、对载体的复制和扩增没有严格的限制；、对载体的复制和扩增没有严格的限制；、不存在特异的内切酶体系降解外源、不存在特异的内切酶体系降

39、解外源DNADNA；、在重组、在重组DNADNA增殖过程中，不会对它进行修饰；增殖过程中，不会对它进行修饰；、重组缺陷型，不会产生体内重组；、重组缺陷型，不会产生体内重组；、容易导入重组、容易导入重组DNADNA分子；分子；、符合重组、符合重组DNADNA操作的安全标准。操作的安全标准。l 聚聚-羟基丁酸酯羟基丁酸酯(Poly-hydroxybutyrate,PHB)是一种是一种深受国际生物工程界重视的新型高分子材料，它最重深受国际生物工程界重视的新型高分子材料，它最重要的特性是可生物降解性，因此可望为解决日益严重要的特性是可生物降解性，因此可望为解决日益严重的的“白色污染白色污染”问题带来希

40、望。问题带来希望。l 透明颤菌血红蛋白基因透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla Hemoglobin gene,vgb)位于位于1.4-kb的基因片段上，且此基因片段携带内的基因片段上，且此基因片段携带内启动子。启动子。 vgb基因产物，即透明颤菌血红蛋白基因产物，即透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin,VHb)，能够从分子水平上提高细，能够从分子水平上提高细胞自身对溶氧的利用能力，从而使细胞在贫氧环境中胞自身对溶氧的利用能力，从而使细胞在贫氧环境中存活，且可以提高目的产物的产量和收率。存活，且可以提高目的产物的产量和收率。 例子例子透明颤菌血红蛋白基因在

41、产透明颤菌血红蛋白基因在产PHBPHB重组重组大肠杆菌中的克隆表达大肠杆菌中的克隆表达 利用生物技术，对基因片段按照不同的利用生物技术，对基因片段按照不同的克隆策略进行基因重组，以构建具有可诱导克隆策略进行基因重组，以构建具有可诱导裂解破壁和高溶氧利用能力的裂解破壁和高溶氧利用能力的PHB高产重组高产重组大肠杆菌大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)，将同时从，将同时从发酵和分离两方面降低发酵和分离两方面降低PHB的生产成本，从的生产成本，从而使而使PHB的大规模推广和应用成为可能的大规模推广和应用成为可能透明颤菌血红蛋白基因在产透明颤菌血红蛋白基因在产PHBPHB重组重组

42、大肠杆菌中的克隆表达大肠杆菌中的克隆表达 质粒质粒pBR322-vgb的长度为的长度为5.76kb,vgb基因长度为基因长度为1.4kb，且，且该片段可用限制性核酸内切酶该片段可用限制性核酸内切酶Hind 和和Sal 从质粒上酶切下从质粒上酶切下来。酶切温度为来。酶切温度为37，时间为，时间为3h。酶切后的。酶切后的vgb片段用低熔点琼脂片段用低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化分离并回收。同糖凝胶电泳纯化分离并回收。同样，用样，用Hind 和和Sal 酶切质粒酶切质粒pTU14，其酶切位点位于多克隆，其酶切位点位于多克隆位点上。用位点上。用T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶将将vgb基因片段连接到酶切后

43、的质基因片段连接到酶切后的质粒载体粒载体pTU14上，得到携带氨苄上，得到携带氨苄青霉素抗性青霉素抗性(Apr)的新质粒的新质粒pTU14-vgb。 经过约经过约80h的补料培养，重组菌的补料培养，重组菌VG1(pTU14)的菌体浓度的菌体浓度可高达可高达25.9g/L，菌体细胞中的，菌体细胞中的PHB百分含量可高达百分含量可高达95%以以上，这是迄今为止报道的利用大肠杆菌生产上，这是迄今为止报道的利用大肠杆菌生产PHB过程的摇过程的摇瓶最高值。对补料培养瓶最高值。对补料培养45h后的重组菌进行超薄切片电镜照后的重组菌进行超薄切片电镜照相，进一步证实了相，进一步证实了PHB可以在菌体细胞中大量

44、积累可以在菌体细胞中大量积累(见图见图4)。第五节第五节 原生质体育种原生质体育种 原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。变育种等。 原生质体融合育种是基因重组的一种重要原生质体融合育种是基因重组的一种重要方法。方法。 原生质体融合作为一种新的基因重组手段原生质体融合作为一种新的基因重组手段是是19781978年第三届国际工业微生物遗传学讨年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。论会上提出来的。 一、原生质体融合育种的特点一、原生质体融合育种的特点( (一一) )杂交频率较

45、高：细胞壁去除后在高渗条件下杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。形成类似于球形的原生质体。( (二二) )受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。于不同种属间微生物的杂交。( (三三) )遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。过程。 ( (四四) )存在着两株以上亲株同时参与融合形成存在着两株以上亲株同时

46、参与融合形成融合子的可能性。融合子的可能性。（五（五) )有可能采用产量性状较高的菌株作融有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。合亲株。 ( (六六) )提高菌株产量的潜力较大。提高菌株产量的潜力较大。 ( (七七) )有助于建立工业微生物转化体系。有助于建立工业微生物转化体系。二、原生质体融合育种步骤二、原生质体融合育种步骤1 1标记菌株的筛选和稳定性验证。标记菌株的筛选和稳定性验证。2 2原生质体制备。原生质体制备。3 3等量原生质体加聚乙二醇促进融合。等量原生质体加聚乙二醇促进融合。4 4涂布于再生培养基，再生出菌落。涂布于再生培养基，再生出菌落。5 5选择性培养基上划线生长，分离验证

47、，选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。挑取融合子进一步试验、保藏。6 6生产性能筛选。生产性能筛选。原生质体融合基本过程示意图 细胞壁细胞壁细胞壁溶解细胞壁溶解细胞膜细胞膜营养细胞营养细胞原生质体原生质体原生质体融合原生质体融合融合细胞融合细胞原生质体融合原生质体融合原生质体形成原生质体形成细胞壁再生细胞壁再生原生质体名词名词原生质体融合基本过程示意图 三、原生质体融合育种的要点三、原生质体融合育种的要点（一）标记菌种的选择（一）标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或和抗药性菌育种，筛选出营养缺陷型或和

48、抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。株。这里最重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。确证融合的成功，可以采用多标记菌种。 ( (二二) )原生质体的制备原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。胞，它保持原细胞的一切活性。

49、在放线菌和细菌中，制备原生质体主要在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。或纤维素酶等。 影响原生质体制备的因素影响原生质体制备的因素1 1菌体的前处理菌体的前处理 为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。2 2菌体的培养时间菌体的培养时间 为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。期的菌体。3 3 酶浓度酶浓度 对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓