第五章微生物的生长和环境条件

1、 微生物培养的目的各有不同，有些是以大量增殖微生物菌体为目标（如单细胞蛋白或胞内产物），有些则是希望在微生物生长的同时，实现目标代谢产物的大量积累。由于培养目标的不同，在培养方法上也就存在许多差别。微生物的培养方法微生物的培养方法 从历史发展的角度来看，微生物培养技术的发展主从历史发展的角度来看，微生物培养技术的发展主要有以下特点：要有以下特点： 从少量培养发展到大规模培养；从少量培养发展到大规模培养； 从浅盘培养发展到厚层固体或深层（液体）培养；从浅盘培养发展到厚层固体或深层（液体）培养； 从以固体培养为主发展到以液体培养为主；从以固体培养为主发展到以液体培养为主； 从静止式液体培养发展到通

2、气搅拌式液体培养；从静止式液体培养发展到通气搅拌式液体培养； 从分批培养发展到连续培养以至多级连续培养；从分批培养发展到连续培养以至多级连续培养； 从游离的微生物细胞培养发展到利用固定化细胞从游离的微生物细胞培养发展到利用固定化细胞培养；培养； 从单一微生物培养发展到混合微生物培养；从单一微生物培养发展到混合微生物培养； 从利用野生菌种发展到利用变异菌株以及从利用野生菌种发展到利用变异菌株以及“工程工程菌菌”。一、投料方式一、投料方式1、分批培养、分批培养2、连续培养、连续培养3、补料分批培养、补料分批培养二、培养状态二、培养状态1、固体培养、固体培养2、液体培养、液体培养三、氧气三、氧气1、

3、厌氧、厌氧2、好氧、好氧四、菌种的数量四、菌种的数量1、纯种培养、纯种培养2、混菌培养、混菌培养根据微生物种类、培养目的和要求、规模和资金投根据微生物种类、培养目的和要求、规模和资金投入的不同可以有不同形式的培养装置。入的不同可以有不同形式的培养装置。一、投料方式一、投料方式 1、分批培养、分批培养 细菌、酵母、霉菌的生长曲线细菌、酵母、霉菌的生长曲线 一次性投料，一次性收获一次性投料，一次性收获延滞期延滞期 少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即进少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即进行繁殖，生长速度近于零。因此在开始一段时间行繁殖，生长速度近于零。因此在开始一段时间，细菌数几乎保持不变，

4、甚至稍有减少。这段时，细菌数几乎保持不变，甚至稍有减少。这段时间被称为延迟期，又称为迟缓期、调整期或滞留间被称为延迟期，又称为迟缓期、调整期或滞留适应期。适应期。（1 1）延滞期）延滞期出现原因出现原因（2）延滞延滞的特点的特点（3）影响）影响延滞延滞期限长短的因素期限长短的因素（4 4）缩短）缩短延滞延滞期的意义及方法期的意义及方法A A、微生物接种到一个新的环境，暂缺乏足够、微生物接种到一个新的环境，暂缺乏足够的能量和必需的生长因子；的能量和必需的生长因子；B B、“种子种子”老化（即处于非对数生长期）或老化（即处于非对数生长期）或未充分活化。未充分活化。C C、接种时造成的损伤、接种时造

5、成的损伤（1 1）延滞期）延滞期出现原因出现原因（2）延滞期延滞期的特点的特点 特点：特点： 1）生长速率常数为零；）生长速率常数为零； 2）细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状。）细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状。.细菌细菌数量不增加或增加很少，代谢活跃；数量不增加或增加很少，代谢活跃； 3）细胞内）细胞内RNA，尤其是，尤其是rRNA的含量很高，细胞的嗜的含量很高，细胞的嗜碱性强；碱性强； 4）合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和）合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加的合成加速，易产生各种诱导酶速，易产生各种诱导酶 5）对外界不良条件如）对外界不良条件如NaCl溶液、温度和抗

6、生素等理、溶液、温度和抗生素等理、理化因素反应敏感。理化因素反应敏感。 （3）影响延滞期时间长短的因素B、接种龄:以对数期接种龄的种子接种，延滞期短以对数期接种龄的种子接种，延滞期短C、接种量:发酵工业上通常采用种子：发酵发酵工业上通常采用种子：发酵培养基培养基=1：10D、培养基成分:一般要求发酵培养基的成分一般要求发酵培养基的成分或种子培养基的成分尽量接近，且应适当丰富些。或种子培养基的成分尽量接近，且应适当丰富些。A、菌种特性（4 4）缩短延滞期的意义及方法）缩短延滞期的意义及方法（1）意义：）意义： 可以缩短生产周期，提高设备利用率（2 2）缩短延滞期的方法）缩短延滞期的方法A、通过遗

7、传学方法改变种的遗传特性使迟缓期 缩短B、接种对数生长期的菌种，采用最适菌龄C、尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相 差太大D、加大接种量指数期指数期 对数期又称指数期。这一阶段突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。特点特点 1）生长速率常数）生长速率常数R最大代时最短，生长最大代时最短，生长速度最快；速度最快； 2）细胞稳定（平衡）生长：细胞内各种）细胞稳定（平衡）生长：细胞内各种物质按比例生长，菌体成分均匀；物质按比例生长，菌体成分均匀； 3）酶系活跃，代谢旺盛）酶系活跃，代谢旺盛 。稳定期稳定期（1 1）出现原因）出

8、现原因A A、营养的消耗、营养的消耗C C、引起、引起pHpH值值EHEH值的改变值的改变D D、有害代谢产物积累、有害代谢产物积累B B、营养物的比例失调、营养物的比例失调（2）特点：）特点：1）生长常数为零，新生）生长常数为零，新生=死亡，达到动态死亡，达到动态平衡；平衡；2）活菌数的总量达到最大值；）活菌数的总量达到最大值；3）胞内的储藏物开始形成（如肝糖粒、脂）胞内的储藏物开始形成（如肝糖粒、脂肪粒等）；肪粒等）；4）某些芽孢菌的芽孢开始形成；）某些芽孢菌的芽孢开始形成；5）某些细菌过量积累次级代谢产物，如抗）某些细菌过量积累次级代谢产物，如抗生素、维生素等。生素、维生素等。衰亡期衰亡

9、期特点：特点：1）细菌代谢活性降低；）细菌代谢活性降低；2）细菌衰老并出现自溶；）细菌衰老并出现自溶；3）产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶）产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。或抗生素等。4）菌体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬）菌体细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应2、连续培养、连续培养是在微生物的整个培养期间，通过一定的是在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续下去的一种培养

10、方法。长并能持续下去的一种培养方法。基本原则：在微生物培养过程中不断的补基本原则：在微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物。充营养物质和以同样的速率移出培养物。连续发酵的优点：连续发酵的优点：1、高效、高效2、产品质量较稳定、产品质量较稳定3、节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、气、电的负荷均衡合理。气、电的负荷均衡合理。缺点：缺点：1、菌种易退化、菌种易退化2、易污染杂菌、易污染杂菌3、营养物的利用率一般低于单批增大。、营养物的利用率一般低于单批增大。恒化器：恒化器：与恒浊器相反，是与恒浊器相反，是一种设法使培养液流速保一种设法

11、使培养液流速保持不变，并使微生物始终持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。连续培养装置。恒浊器：恒浊器：根据培养器内微生根据培养器内微生物的生长密度，并借光电物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高，速，以取得菌体密度高，生长速度恒定的微生物细生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。胞的连续培养器。恒浊器与恒化器的比较装置装置控制对象控制对象培养基培养基 培养基培养基流速流速生长生长速率速率产物产物应用范围应用范围恒浊器恒浊器 菌体密度菌体密度（内控制）（内控制）无

12、限制无限制生长因生长因子子不恒定不恒定 最高最高速率速率大量菌体大量菌体或与菌体或与菌体相平行的相平行的代谢产物代谢产物生产为主生产为主恒化器恒化器 培养基流培养基流速（外控速（外控制）制）有限制有限制生长因生长因子子恒定恒定低于低于最高最高速率速率不同生长不同生长速率的菌速率的菌体体实验室为实验室为主主固定化细胞连续培养 细胞固定化就是通过包埋法、微胶囊化、吸附法等手段，将微生物细胞限制在载体的内部或表面。 固定化细胞培养与游离细胞培养相比，有以下一些优势：固定化可提供较高的细胞密度；固定化减少了细胞的流失，使细胞可以反复利用；固定化可以提供对细胞有利的微环境；可以保护某些细胞免受剪切损伤；

13、 简化了下游的细胞分离步骤。固定化载体常常易碎，且固定的细胞容易脱落等原因的存在，固定化细胞培养器中的剪切力也不宜过高，一般采用填充柱、流动床或气升式反应器。机械搅拌式反应器只适用于载体牢固、不易脱落的固定化细胞。通常是将固定化细胞装在反应器内，一端流入培养基，另一端放出发酵液，而固定化微生物细胞始终停留在反应器内。3、补料分批发酵、补料分批发酵在生产实践中完全封闭式的分批培养或纯粹在生产实践中完全封闭式的分批培养或纯粹的连续培养较为少见，更多见的是两者的折中的连续培养较为少见，更多见的是两者的折中形式形式补料分批或流加发酵。补料分批或流加发酵。 补料发酵补料发酵是根据菌株生长和初始培养基的特

14、是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段点，在分批培养的某些阶段适当补加部分配料适当补加部分配料成分或碳源成分或碳源，以提高菌体或代谢产物的产率。，以提高菌体或代谢产物的产率。流加营养：水解糖（葡萄糖）、氨水流加营养：水解糖（葡萄糖）、氨水补料分批发酵的特点有：补料分批发酵的特点有： 1）可以减弱底物和代谢产物的抑制。）可以减弱底物和代谢产物的抑制。微生物的生长会受到微生物的生长会受到高浓度底物和逐步过量产生的代谢产物的抑制，若将初始底高浓度底物和逐步过量产生的代谢产物的抑制，若将初始底物浓度降低，就会限制菌体密度和产物浓度的提高。但采用物浓度降低，就会限制菌体密度和产物浓度的提

15、高。但采用间歇补料通过不断的流加限制性底物就可克服该缺点。可间歇补料通过不断的流加限制性底物就可克服该缺点。可以以避免葡萄糖效应避免葡萄糖效应对微生物生长和产物积累的影响。流加补对微生物生长和产物积累的影响。流加补料还可料还可稀释降低代谢产物的浓度稀释降低代谢产物的浓度，减轻其抑制生长作用。，减轻其抑制生长作用。 2）增加次级代谢产物的产量。）增加次级代谢产物的产量。次级代谢产物的合成常常在次级代谢产物的合成常常在生长平衡期才开始合成，与生长平衡期才开始合成，与稳定期的细胞密度稳定期的细胞密度和和延续时间延续时间密密切相关。但间歇发酵的平衡期比较短，因营养物质已大量消切相关。但间歇发酵的平衡期

16、比较短，因营养物质已大量消耗可同化量很少很快就进入衰亡期。通过补料可延长平耗可同化量很少很快就进入衰亡期。通过补料可延长平衡期增加次级代谢产物的产量。衡期增加次级代谢产物的产量。3） 可以提高发酵的细胞密度。可以提高发酵的细胞密度。补料发酵时不补料发酵时不断地向发酵罐补偿限制性底物，微生物始终能断地向发酵罐补偿限制性底物，微生物始终能获得充分的营养，菌体密度就可以增加，合理获得充分的营养，菌体密度就可以增加，合理改进发酵工艺细胞密度可以达到改进发酵工艺细胞密度可以达到10以上干以上干细胞，大大提高产率。细胞，大大提高产率。 4）可以恒定培养条件。）可以恒定培养条件。发酵过程中的培养环发酵过程中

17、的培养环境会随着代谢作用的进行而变化，如培养基的境会随着代谢作用的进行而变化，如培养基的pH值，这时可流加氨水或通氨来恒定值，这时可流加氨水或通氨来恒定pH值值还补充氮源。还补充氮源。 二、培养状态二、培养状态 1、固体培养、固体培养 2、液体培养、液体培养1 1、固体培养、固体培养 固体培养就是利用固体培养基进行微生物的繁殖。固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和保藏等方面发挥着重要作用。一些丝状真菌可以进行生产规模的固体发酵。实验室常见的固体培养实验室常见的固体培养试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面。用于菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。（1）用接种环挑取原始培养物后，在

18、固体培养基）用接种环挑取原始培养物后，在固体培养基表面表面划线接种划线接种（2）用涂布棒将少量的液体培养物）用涂布棒将少量的液体培养物涂布涂布在整个固在整个固体培养基表面体培养基表面（3）将少量液体培养物与融化后降温至）将少量液体培养物与融化后降温至5060度度的固体培养基的固体培养基混匀混匀，倒入培养皿中，浇注成平板，倒入培养皿中，浇注成平板。接种后的培养物直接放入培养箱中恒温培养。这些方法适用于好氧和兼性好氧微生物的培养。微好氧微生物采取穿刺培养微好氧微生物采取穿刺培养对厌氧菌培养必需创造更严格的无氧环境对厌氧菌培养必需创造更严格的无氧环境厌氧培养皿。厌氧罐，厌氧培养皿。厌氧罐，Hunga

19、te滚管技术滚管技术生产中常见的固体培养 在生产实践中，好氧真菌的固体培养方法都是将接种后的固体基质薄薄地摊铺在容器的表面，可使菌体获得充足的氧气，又可以将生长过程中产生的热量及时释放。 固体培养使用的基本培养基原料是小麦麸皮等。灭菌后待冷却到合适温度便可接种。固体培养基中的含水量控制在4080之间（典型的液体培养基含水量在95以上），细菌和酵母菌将无法忍受如此低水含量的环境，所以，固体培养被细菌或酵母菌污染的可能性大大降低。麸曲、食用菌、酱豆、米酒米曲霉固体培养生产日本酒曲米曲霉固体培养生产日本酒曲2.液体培养 液体培养就是将微生物接种到液体培养基中进行培养。由于大多数发酵微生物是好氧性的，

20、而且微生物只能利用溶解氧，所以，如何保证在培养液中有较高的溶解氧浓度至关重要。一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率。 实验室常见的液体培养实验室常见的液体培养 在实验室进行好氧菌液体培养的方法主要有四种。 （ 1）试管液体培养 此法的通气效果一般较差，仅适用于培养兼性好氧菌，以及进行微生物的各种生理生化试验。 （2）浅层液体培养 在三角烧瓶中装入浅层培养液，其通气量与装液量、棉塞通气程度密切相关。通气量对微生物的生长速度和生长量有很大关系，该方法一般也仅适于兼性好氧菌。 （3）摇瓶培养）摇瓶培养 盖盖812层纱布或用疏松的棉塞层纱布或用疏松的棉塞塞住以阻止塞住以阻止空气中

21、杂菌或杂质进入瓶内，而空气可以空气中杂菌或杂质进入瓶内，而空气可以透过纱布或棉塞供微生物呼吸之用。透过纱布或棉塞供微生物呼吸之用。 一般装液量为三角瓶的一般装液量为三角瓶的 10以下，如以下，如 250ml三角瓶装三角瓶装 1020ml培养液。培养液。 三角瓶内三角瓶内设置挡板或添加玻璃设置挡板或添加玻璃珠等。将摇珠等。将摇瓶放在摇床上以一定速度保温振荡培养，瓶放在摇床上以一定速度保温振荡培养，摇床有摇床有旋转式旋转式和和往复式往复式两类。两类。 摇瓶培养在实验室里被广泛用于微生摇瓶培养在实验室里被广泛用于微生物的生理生化试验、发酵和菌种筛选等，物的生理生化试验、发酵和菌种筛选等，也常在发酵工

22、业中用于种子培养。也常在发酵工业中用于种子培养。 （4）台式发酵罐）台式发酵罐 实验室用的发酵罐体积一般实验室用的发酵罐体积一般为几升到几十升。自动控制为几升到几十升。自动控制和记录装置如配置有和记录装置如配置有PH、溶解氧、温度和泡沫检测电溶解氧、温度和泡沫检测电极，有加热或冷却装置，有极，有加热或冷却装置，有补料、消泡和补料、消泡和PH调节用的调节用的酸或碱贮罐及其自动记录装酸或碱贮罐及其自动记录装置，大多由计算机控制。因置，大多由计算机控制。因为它的结构与生产用的大型为它的结构与生产用的大型发酵罐接近，所以，它是实发酵罐接近，所以，它是实验室验室模拟生产实践模拟生产实践的主要试的主要试验

23、工具验工具生产中常见的液体培养 液体培养生产效率高，适于机械化和自动化，所以它是当前微生物发酵工业的主要生产方式。液体培养有静置培养和通气培养两种类型：静置培养适于厌氧菌发酵，如酒精、丙酮一丁醇、乳酸等发酵；通气发酵适于好氧菌发酵，如抗生素、氨基酸、核苷酸等发酵。 （1）浅盘培养：容器中盛装浅层液体静立培养，没有通气搅拌设备，全靠液体表面与空气接触进行氧气交换，这是最为原始的液体培养形式，劳动强度大，生产效率低，易污染。早期的青霉素和柠檬酸发酵曾采用过浅盘培养。当时生产一千克青霉素就需要100万个容积为一升的培养瓶。（2 2）发酵罐深层培养）发酵罐深层培养 液体深层培养的主体设备是发酵罐。 发

24、酵罐可以为微生物提供丰富而均匀的营养，良好的通气搅拌，适宜的温度和酸碱度，并能防止杂菌污染。为此，发酵罐通常配备有培养基配制系统、蒸汽灭菌系统、空气压缩过滤系统和补料系统。其生产效率较高，易于控制，产品质量稳定，因而在发酵工业中被广泛应用。但是，深层培养耗费的动力较大，设备较为复杂，需要较大的投资。 大型发酵罐的发酵一般需分几级进行，使发酵的种子逐级扩大，以提高发酵罐的利用率并节约能源等。罐的级数一般是根据菌体繁殖速度以及发酵罐的容积而确定的：如谷氨酸发酵多采用二级培养；而生长较慢的青霉素和链霉素生产菌种一般需要三级培养。 大规模液体培养的厌氧菌：丙酮-丁醇发酵 丙酮-丁醇梭菌的生长可以分为两

25、个阶段： 前期较短，以产菌体为主，生长温度以37为宜； 后期较长，以产丙酮一丁醇为主，温度以33为宜。 这样的生产流程可连续运转一年以上，并达到比单级连续发酵高得多的生产效率。三、其他培养方法三、其他培养方法1、双菌或者多菌培养、双菌或者多菌培养 现代发酵工业以纯种发酵为主，而传统的固现代发酵工业以纯种发酵为主，而传统的固态白酒和酱油的发酵都是多菌培养发酵的结果态白酒和酱油的发酵都是多菌培养发酵的结果。在自然界微生物之间的共生与互生关系也是。在自然界微生物之间的共生与互生关系也是双菌与多菌共同生存的常例，这种关系反映了双菌与多菌共同生存的常例，这种关系反映了微生物存在着代谢微生物存在着代谢”接

26、力棒接力棒”的依赖状态，能的依赖状态，能相互改善生存条件。相互改善生存条件。 双菌发酵：双菌发酵：维生素维生素C的二步法的二步法采用采用欧文氏菌欧文氏菌和和棒状杆菌棒状杆菌进行串联发酵，先将厂葡进行串联发酵，先将厂葡萄糖转化成萄糖转化成2，5-二酮基葡萄糖酸再进一步转化产牛二酮基葡萄糖酸再进一步转化产牛2-酮某古龙酸。酮某古龙酸。以山梨醇作为发酵的主要原料，利用以山梨醇作为发酵的主要原料，利用生黑葡萄糖酸生黑葡萄糖酸杆菌杆菌或或弱氧醋酸杆菌弱氧醋酸杆菌先进行第先进行第 一步发酵，所生成的一步发酵，所生成的 山山梨糖梨糖80加热几分钟后再加入灭菌的辅料（玉米浆，加热几分钟后再加入灭菌的辅料（玉米

27、浆，尿素及无机盐等），开始第二步的混合菌株发酵。当尿素及无机盐等），开始第二步的混合菌株发酵。当作为伴生菌的芽孢杆菌开始形成芽孢时，产酸菌株开作为伴生菌的芽孢杆菌开始形成芽孢时，产酸菌株开始产酸。始产酸。 淀粉淀粉-酒精的双菌发酵酒精的双菌发酵用固定化的混合菌种将淀粉原料转化成乙醇。用固定化的混合菌种将淀粉原料转化成乙醇。用海藻酸钠包埋黑曲霉和运动发酵单胞菌，形用海藻酸钠包埋黑曲霉和运动发酵单胞菌，形成固定化细胞小球。黑曲霉好氧，故长在小球成固定化细胞小球。黑曲霉好氧，故长在小球表层，运动发酵单胞菌厌氧，生长在小球中间表层，运动发酵单胞菌厌氧，生长在小球中间。当淀粉液流过固定化细胞反应器时，表

28、层的。当淀粉液流过固定化细胞反应器时，表层的黑曲霉将淀粉分解成葡萄糖并进入小球内层，黑曲霉将淀粉分解成葡萄糖并进入小球内层，运动发酵单胞菌随即将葡萄糖转化成乙醇。运动发酵单胞菌随即将葡萄糖转化成乙醇。许多发酵是纯菌株无法实现的只有混合菌许多发酵是纯菌株无法实现的只有混合菌株才能完成所以采用混菌培养有可能获得株才能完成所以采用混菌培养有可能获得新型的或优质的发酵产品，有时比单菌培养新型的或优质的发酵产品，有时比单菌培养更快、更有效更简便当然混菌培养的反更快、更有效更简便当然混菌培养的反应机制较复杂。应机制较复杂。同步培养：同步培养：是一种培养方法，它能使群体中不同是一种培养方法，它能使群体中不同

29、步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。细胞。同步生长：同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，产同时进行分裂的生长方式称为一生长阶段，产同时进行分裂的生长方式称为同步生长。同步生长。同步细胞或同步培养物同步细胞或同步培养物：能过同步培养方法获得：能过同步培养方法获得的细胞称的细胞称。同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它一种理想的材料。和作为工业发酵的种子，它一种理想的材料。2 2、同步培养、同步培养机械筛选方法机械筛选方法（1）离心方法）离心方法（2）过滤分离法）过滤分离法（3）硝酸纤维素滤膜）硝酸纤维素滤膜法法环境条件控制技术环境条件控制技术（1）温度：）温度：通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可获得同步细胞。通过培养可获得同步细胞。（2）培养基成分控制：）培养基成分控制：将不同步的细菌在营养将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间，然后