生物分离工程02

1、生物分离工程生物分离工程细胞分离与破碎细胞分离与破碎总体学习目的和要求总体学习目的和要求 通过本章学习，要求掌握解通过本章学习，要求掌握解细胞分离细胞分离和和目标产物目标产物的释放的的释放的原理原理和方法，熟和方法，熟知各种方法的知各种方法的优缺点优缺点和应用范围。和应用范围。 目录目录n重力沉降重力沉降n离心沉降离心沉降n细胞破碎与胞内物释放细胞破碎与胞内物释放细胞分离学习要点细胞分离学习要点n识记：识记：重力沉降、离心沉降和过滤的概念。重力沉降、离心沉降和过滤的概念。n理解：理解：重力沉降、离心分离与过滤原理、理重力沉降、离心分离与过滤原理、理论；掌握论；掌握StokesStokes沉降公

2、式沉降公式 。n应用：应用：常用离心方法及优缺点；利用掌握的常用离心方法及优缺点；利用掌握的提高分离效率的方法分析决实际问题提高分离效率的方法分析决实际问题 细胞分离重力沉降定义细胞分离重力沉降定义 重力沉降是传统化工过程中常用的从含有重力沉降是传统化工过程中常用的从含有固体颗粒的流体中将颗粒分离出来的操作。固体颗粒的流体中将颗粒分离出来的操作。 重力沉降重力沉降是利用流体与颗粒间的密度差，是利用流体与颗粒间的密度差，在重力的作用下使颗粒与流体之间产生在重力的作用下使颗粒与流体之间产生相对运动，从而实现两者的分离。相对运动，从而实现两者的分离。 在生物分离过程中，定义中颗粒为细胞、在生物分离过

3、程中，定义中颗粒为细胞、细胞碎片等有形物细胞碎片等有形物千姿百态的微生物世界千姿百态的微生物世界Bacterial morphology diagramHigh-density cell culture细胞分离重力沉降理论细胞分离重力沉降理论n理论假设理论假设n细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理；细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理；n颗粒在无限稀释的溶液中进行沉降，颗粒颗粒在无限稀释的溶液中进行沉降，颗粒之间无相互干扰之间无相互干扰 n受力分析受力分析 球形颗粒重力球形颗粒重力fg 液体的浮力液体的浮力fb 颗粒运动方向相反的阻力颗粒运动方向相反的阻力 fs细胞分离重力沉降理论细胞分离重力沉降理论gd

4、fspg361gdfLpb3614222pgLSdvf重力：重力：浮力：浮力：阻力：阻力：细胞分离重力沉降理论细胞分离重力沉降理论当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和阻力当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和阻力达到平衡时，达到平衡时， bSgfffgdvpLLSg342则则细胞分离重力沉降理论细胞分离重力沉降理论1Re103当球形颗粒处于滞流区（当球形颗粒处于滞流区（ ）时）时 Re24gdvLLSpg182Stokes公式公式当球形颗粒处于过渡区（当球形颗粒处于过渡区（ ）时）时 310Re15 . 0Re105 . 06 . 0Re27. 0LLSpggdvAllen公式公式当球形颗粒处于

5、湍流区（当球形颗粒处于湍流区（ ）时）时53102Re1044. 05 . 074. 1LLSpggdvNewton公式公式千姿百态的微生物世界千姿百态的微生物世界Bacterial morphology diagramHigh-density cell culture球形颗粒？无限稀释溶液？无限稀释溶液？细胞分离重力沉降理论细胞分离重力沉降理论n模型校正模型校正n形态校正：颗粒的形状系数颗粒的形状系数n速度校正：空隙率函数空隙率函数 n提高重力沉降的途径提高重力沉降的途径n加入中性盐：双电层排斥电位降低双电层排斥电位降低n加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝图架桥作用形成大絮凝图n引入外力引

6、入外力PSAA)(F细胞分离重力沉降理论细胞分离重力沉降理论n模型校正模型校正 形态校正形态校正 速度校正速度校正n提高重力沉降的途径提高重力沉降的途径 加入中性盐；加入中性盐； 加入高分子絮凝剂加入高分子絮凝剂 引入外力引入外力细胞分离离心沉降定义细胞分离离心沉降定义离心沉降离心沉降是利用沉降设备使流体和颗粒旋是利用沉降设备使流体和颗粒旋转，在离心力的作用下，由于颗粒和流体转，在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度差，所以颗粒沿径向与流体产间存在密度差，所以颗粒沿径向与流体产生相对运动，从而使颗粒和流体分离。生相对运动，从而使颗粒和流体分离。 细胞分离离心沉降理论细胞分离离心沉降理论rd

7、vLLSPS2218)(离心沉降速度离心沉降速度 令：令：LLSPdS18)(2rSvS2gdvLLSpg182细胞分离离心分离方法细胞分离离心分离方法n差速离心分级差速离心分级n区带离心区带离心 差速区带离心差速区带离心 平衡区带离心平衡区带离心 差速离心分离差速离心分离 差速离心是以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离方法，应用某一特定颗粒沉淀的离心力在预定的离心时间内得到一部分颗粒沉淀及包含未沉淀颗粒的上清液。差速离心分离应用实例差速离心分离应用实例600g10 min15000g10 min100000g60 min300000g120 minnucleiMitochondrial

8、ysosomesPlasma membraneRiosomal subunitshomogenateFiltered homogenateSoluble part of cytoplasmSedimentation区带离心分离前提区带离心分离前提 在离心管内的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同浓度（密度）的梯度介质（蔗糖等），按照浓度从大到小的原则，依次层层加入。加入离心管中的梯度介质经高速离心或静置后可形成连续的密度梯度。 操作过程操作过程区带离心种类区带离心种类n差速区带离心(速度区带离心）n平衡区带离心（等密度离心）差差速速区区带带离离心心差速区带离心差速区带离心n基于颗粒的大小、形状

9、的分离n梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的最大密度n离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等n动态离心分离方法平平衡衡区区带带离离心心平衡区带离心平衡区带离心n梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度n离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等n平衡离心分离方法梯度液的种类和应用梯度液的种类和应用细胞分离区带离心异同细胞分离区带离心异同区带离心种类区带离心种类差速区带离心差速区带离心平衡区带离心平衡区带离心共同点共同点事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度梯度介质梯度介质常用蔗糖常用蔗糖常用氯化铯常用氯化铯密度梯度密度梯度最大的

10、密度梯度低于最大密最大的密度梯度低于最大密度的沉降样品度的沉降样品最大的密度梯度大于最大密最大的密度梯度大于最大密度的沉降样品度的沉降样品区带形成条件区带形成条件根据各个组分沉降系数的差根据各个组分沉降系数的差别，形成各自的区带别，形成各自的区带根据各组分密度差形成区带根据各组分密度差形成区带离心条件离心条件在最前的沉降物质达到管底在最前的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度前停止，短时间，低速度使各组分沉降到其平衡的密使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度度区，长时间，高速度 细胞分离离心设备分类细胞分离离心设备分类分类方法分类方法名称名称处理量处理量实验室用离心机，工业用离心机实验

11、室用离心机，工业用离心机温度温度常温离心机、冷冻离心机常温离心机、冷冻离心机转速转速低速离心机、高速离心机、超速离心机低速离心机、高速离心机、超速离心机转子结构转子结构管式、碟式管式、碟式细胞分离常用离心设备细胞分离常用离心设备Solids-ejecting disk bowl centrifuge of pilot size for sterilizable contained installation Nozzle machine with pressurized solids discharge for yeast and bacteria separation 细胞分离常用离心设备细胞

12、分离常用离心设备Decanter centrifuge Multichamber bowl, vertical cut 细胞分离管式离心设备细胞分离管式离心设备A disposable cell separation insert PowerfugeTM one-chamber with scraper细胞分离碟片离心设备细胞分离碟片离心设备(a) Solids-retaining disk bowl, (b) Radial solids-ejecting disk bowl, top feed. (c) Radial solids-ejecting disk bowl, hermetic f

13、eed.(d) Axial solids-ejecting disk bowl. (e) Nozzle bowl with pressurized solids discharge. (f) Nozzle bowl with peripheral discharge nozzles.细胞分离离心设备比较细胞分离离心设备比较管式离心机管式离心机优点优点结构简单，转速和离心力较大结构简单，转速和离心力较大缺点缺点沉降面积小、处理能力低；沉降面积小、处理能力低；碟式离心机碟式离心机优点优点转子中存在隔板以增大沉降面积，处理能力大转子中存在隔板以增大沉降面积，处理能力大缺点缺点结构复杂、转速较低；结构

14、复杂、转速较低；细胞分离离心机处理能力细胞分离离心机处理能力粒子在径向上的沉降速度粒子在径向上的沉降速度 grvdtdrvgs2轴向移动速度轴向移动速度 2122rrQdtdzuz完全沉降的边界条件完全沉降的边界条件 0z1rr Lz 2rr 1222122lnrrgrrLvQg细胞分离离心机处理能力细胞分离离心机处理能力影响因素影响因素 处理样品的特性，如密度、粒径等处理样品的特性，如密度、粒径等 溶液的特性，如密度、粘度等溶液的特性，如密度、粘度等 离心机机械结构，如离心机机械结构，如r1和和r2 操作条件，操作条件， 细胞分离过滤定义细胞分离过滤定义过滤是利用多孔性介质（如滤布）截留过滤

15、是利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。离的方法。 过滤本身是一种膜分离技术。在分离细胞、菌体或过滤本身是一种膜分离技术。在分离细胞、菌体或它们的碎片过程中除了沉降分离方法外，过滤技术也是它们的碎片过程中除了沉降分离方法外，过滤技术也是一种常备的分离方法。一种常备的分离方法。细胞分离过滤过程受力分析细胞分离过滤过程受力分析推动力：推动力：过滤操作以压力差为主要推动力；过滤操作以压力差为主要推动力； 阻阻 力：力：过滤过程的阻力来自多孔性过滤介过滤过程的阻力来自多孔性过滤介 质和介质表面不断堆积形成的滤饼质和介质表面不断堆积形成

16、的滤饼 细胞分离过滤速率细胞分离过滤速率cmLRRpAdtdQRm表示介质的阻力；表示介质的阻力；Rc表示滤饼的阻力；表示滤饼的阻力；L为滤液的粘度为滤液的粘度 细胞分离恒压过滤方程细胞分离恒压过滤方程Ruth恒压过滤方程恒压过滤方程 020ttKQQ其中，其中，K为为Ruth恒压过滤系数，表示为恒压过滤系数，表示为SLLSccpAK122细胞分离细胞分离提高过滤速度的途径提高过滤速度的途径n采用絮凝或凝聚的方法预处理改变料液采用絮凝或凝聚的方法预处理改变料液的性质，降低滤饼阻力的性质，降低滤饼阻力n加入助滤剂以改变滤饼的压缩性指数，加入助滤剂以改变滤饼的压缩性指数，提高过滤速度提高过滤速度

17、胞内产物释放胞内产物释放学习要点学习要点n理解：理解：各种细胞破碎方法原理、优缺点各种细胞破碎方法原理、优缺点及其适用范围。及其适用范围。 n应用：应用：采用不同的细胞破碎方法对不同采用不同的细胞破碎方法对不同细胞进行不同程度的破碎。细胞进行不同程度的破碎。 胞内产物释放胞内产物释放细胞结构（真核细胞与原核细胞）细胞结构（真核细胞与原核细胞）动物细胞动物细胞没有细胞壁，只有由脂质和蛋白质组成的细胞膜没有细胞壁，只有由脂质和蛋白质组成的细胞膜植物细胞植物细胞细胞膜外有一层坚固的细胞壁细胞膜外有一层坚固的细胞壁酵母细胞酵母细胞细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成，更加难以破碎细胞壁由葡聚糖、甘露聚

18、糖和蛋白质构成，更加难以破碎真核细胞真核细胞原核细胞原核细胞革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌细胞壁由肽聚糖层组成，壁厚约细胞壁由肽聚糖层组成，壁厚约1550 nm，肽聚糖含量为肽聚糖含量为4090%，细胞壁较革兰氏阴性菌坚固。，细胞壁较革兰氏阴性菌坚固。革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌细胞壁在肽聚糖的外侧还有分别由（细胞壁在肽聚糖的外侧还有分别由（1）脂蛋白和（）脂蛋白和（2）磷脂和脂多）磷脂和脂多糖构成的两层外壁层，外壁层厚度越糖构成的两层外壁层，外壁层厚度越810 nm。胞内产物释放胞内产物释放细胞膜组成细胞膜组成（A）（B）胞内产物释放胞内产物释放影响产物释放的环境因素影响产物释放的环境因素n在复杂在复

19、杂培养基培养基中生长的大肠杆菌细胞其破碎较单中生长的大肠杆菌细胞其破碎较单一培养基中生长的大肠杆菌细胞更难；一培养基中生长的大肠杆菌细胞更难；n对数对数生长期生长期的细胞会表现得更加脆弱。的细胞会表现得更加脆弱。n从连续从连续培养过程培养过程中获得的、具有较高比生长速率中获得的、具有较高比生长速率的念珠菌的细胞壁更加脆弱，而摇瓶培养的念珠的念珠菌的细胞壁更加脆弱，而摇瓶培养的念珠菌体则有更加充裕的机会构建更加坚固的细胞壁。菌体则有更加充裕的机会构建更加坚固的细胞壁。n酵母细胞壁的厚度和破碎阻力随酵母细胞壁的厚度和破碎阻力随年龄年龄增长而增加增长而增加n经常在幼酵母细胞中出现的经常在幼酵母细胞中

20、出现的芽痕芽痕（Bud scars）可引起酵母细胞局部细胞壁强度的降低可引起酵母细胞局部细胞壁强度的降低 胞内产物释放胞内产物释放细胞破碎原理细胞破碎原理细胞细胞破碎破碎机械破碎机械破碎高压均浆法，珠磨法、撞击破碎、超声波高压均浆法，珠磨法、撞击破碎、超声波破碎破碎非机械破碎非机械破碎物理法物理法渗透压冲击、冻结渗透压冲击、冻结-融化、融化、（超声波）（超声波）化学法化学法酸碱处理、化学试剂处理酸碱处理、化学试剂处理生物法生物法酶溶、自溶、噬菌体酶溶、自溶、噬菌体胞内产物释放胞内产物释放机械破碎之高压匀浆机械破碎之高压匀浆细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀杆之间的环隙高速（可细胞悬浮液在高压的

21、作用下从阀座与阀杆之间的环隙高速（可达到达到450 m/s）喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。用下破碎。 胞内产物释放胞内产物释放机械破碎之珠磨机械破碎之珠磨珠磨机的破碎室内填充有珠磨机的破碎室内填充有8085（v/v）的玻璃（密度为的玻璃（密度为2.5 g/ml）或氧化锆（密度为或氧化锆（密度为6.0 g/ml）的微球（粒径约的微球（粒径约0.11.0 mm）。）。在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球与微球在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球与微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。胞受到研磨剪切和撞击而破碎。 胞内产物释放胞内产物释放机械破碎之撞击破碎机械破碎之撞击破碎撞击破