第8章微生物菌种的筛选及鉴定

1、主 讲 惠 明 博士现代食品微生物学现代食品微生物学第8章 食品微生物菌种的筛选及鉴定本节要点本节要点 食品食品工业上典型的微生物菌种工业上典型的微生物菌种 微生物菌种的分离筛选及鉴定微生物菌种的分离筛选及鉴定 微生物菌种的发酵条件优化微生物菌种的发酵条件优化一、典型工业微生物菌种细菌：枯草杆菌，短杆菌，大肠杆菌酵母：酿酒酵母（啤酒，葡萄酒），酒精酵母，假丝酵母霉菌：黑曲霉，土曲霉，米曲霉，红曲霉，根霉，木霉，青霉放线菌：单孢菌其他：藻类 发酵工业常见常用的细菌发酵工业常见常用的细菌Leuconostoc mesenteroides 肠膜明串珠菌肠膜明串珠菌Pediococcus cerevi

2、siae 啤酒足细菌啤酒足细菌Bacillus subtilis 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌Acetobacter aceti 醋化醋杆菌醋化醋杆菌Lactobacillus delbrukii 德氏乳杆菌德氏乳杆菌Steptococcus lactis 乳链球菌乳链球菌Clostridium acetobutylcum 丙酮丁醇梭菌丙酮丁醇梭菌 Corynebacterum pekinese 北京棒杆菌北京棒杆菌Brevibacterium ammoniagenes 产氨短杆菌产氨短杆菌常见工业微生物及其产物o 细菌 短杆菌：谷氨酸、肌苷酸 枯草芽孢杆菌：淀粉酶、蛋白酶、核糖 大肠杆菌：酰胺酶

3、 节杆菌：强的松 梭状杆菌：丙酮、丁醇6工业上常用的放线菌及产物工业上常用的放线菌及产物o 链霉菌属 Streptomyces 生产抗生素、维生素、酶及酶抑制剂o 诺卡氏菌属 Nocardia 生产抗生素，石油脱蜡、烃类发酵， 处理含氰废水o 小单孢菌属 Micromonospora 庆大霉素，Rifamycin o 孢囊链霉菌属 Streptosporanium 多霉素o 酵母 酒精酵母：乙醇 甘油酵母：甘油 假丝酵母：环烷酸、SCP 啤酒酵母：细胞色素、辅酶、酵母片 类酵母：脂肪酶 阿氏假囊酵母：核黄素 脆壁酵母：乳糖酶常见工业微生物及其产物o 霉菌 黑曲霉：柠檬酸、蛋白酶、单宁酶、 糖化

4、酶 栖土曲霉：蛋白酶 根霉：糖化酶、甾体激素、 青霉：青霉素、葡萄糖氧化酶 木霉：纤维素酶 红曲霉：糖化霉、红曲色素常见工业微生物及其产物Saccharomyces cerevisiaeBEERBacillus subtilis B53NATTOq 工业上对生产菌种的基本要求q 从自然界中分离目的菌种的原则q 菌种选育的一般方法二、食品工业微生物菌种的来源112.1 对工业微生物菌种的基本要求能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造可操作性要强遗传性能要相对稳定不易感染杂菌或噬菌体产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关

5、）生产特性要符合工艺要求2.2 从自然界中分离筛选菌种从自然界中分离筛选菌种生产菌株来源生产菌株来源 1、索取或购买、索取或购买2、自己选育、自己选育 用原有菌株进行遗传改造进行育种用原有菌株进行遗传改造进行育种 诱变育种诱变育种/基因重组育种基因重组育种 向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育 从自然界中分离菌种从自然界中分离菌种 从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。 设计方案设计方案采样采样增殖培养增殖培养*平板分平板分离离

6、筛选（初筛、复筛）筛选（初筛、复筛）单株纯种分离单株纯种分离 性能考察（生产性能试验、毒性试验、性能考察（生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）菌种鉴定）从自然界中分离筛选菌种的一般步骤从自然界中分离筛选菌种的一般步骤2.2.1采样采样 从自然界种采集含目的菌的样品从自然界种采集含目的菌的样品1.环境条件对土样本中微生物分布的影响环境条件对土样本中微生物分布的影响（1）营养环境营养环境 高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土壤中：耐渗透压酵母，柠檬酸产生菌，氨基酸产生壤中：耐渗透压酵母，柠檬酸产生菌，氨基酸产生菌；菌； 富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉

7、酶产富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉酶产生菌；生菌； 森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌；森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌； 含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中：含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中：蛋白酶产生菌；蛋白酶产生菌； 油田土：石油分解菌油田土：石油分解菌 ；（2）水分水分 取离地表取离地表5-15cm的的土样土样 含水过多、过少都不理想含水过多、过少都不理想（3）温度：采样以秋季为好温度：采样以秋季为好（4）通风通风（5）酸碱度：）酸碱度： 细菌、放线菌：中性或偏碱；细菌、放线菌：中性或偏碱； 霉菌、酵母：偏酸霉菌、酵母：偏酸2. 采样方法采样方法（1）去除表层土去

8、除表层土（2）取取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中或逆料袋中3. 注意注意记录：时间，地点，环境情况等记录：时间，地点，环境情况等样品袋应封好口，防止水分失去样品袋应封好口，防止水分失去土样应在分离前破碎土样应在分离前破碎尽快分离尽快分离2.2.2增殖培养（富集培养）增殖培养（富集培养）适用适用：样品中目的菌数量不够多时：样品中目的菌数量不够多时目的目的：提高样品中目的菌的数量和比例：提高样品中目的菌的数量和比例原理原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制或非目的

9、菌的生长受到抑制1、 方法方法（1）控制营养成分控制营养成分 纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌 可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种 酒精废水，可以增殖废水利用菌酒精废水，可以增殖废水利用菌* 多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素（2）控制培养基控制培养基pH 细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸 但非目的菌的生长不能被完全抑制但非目的菌的生长不能被完全抑制（3）控制培养温度）控制培养温度 30左右培养，可培殖嗜温微生物左右

10、培养，可培殖嗜温微生物 5060培养，可培殖嗜热微生物，培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株筛选耐热菌株（4）热处理）热处理增殖芽孢细菌增殖芽孢细菌 样品悬浮液经样品悬浮液经80、10min处理，杀处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌芽孢细菌（5）添加抑制剂）添加抑制剂 10%苯酚数滴：抑制细菌、霉菌生长，增殖放苯酚数滴：抑制细菌、霉菌生长，增殖放线菌线菌 多粘菌素多粘菌素B：抑制抑制G-细菌细菌 青霉素：抑制青霉素：抑制G+细菌细菌 制霉菌素：抑制真菌制霉菌素：抑制真菌 放线菌酮：抑制真菌放线菌酮：抑制真菌 21实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选实

11、例：碱性纤维素酶产生菌的筛选采样（造纸厂）采样（造纸厂）8030min处理处理文献文献:产生菌为中性芽孢杆菌，产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075% 曲利本蓝曲利本蓝1% CMC（羧甲基纤维素），羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34d，选择有凹陷圈的菌落选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型2.2.3纯种分离纯种分离目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养纯培养1 纯种分离的一般方法纯种分离的一般方法稀释平板法稀释平板

12、法 倾注平板或涂布平板倾注平板或涂布平板划线法划线法稀释分离涂布平板稀释分离倾注平板划线分离（3）组织培养法）组织培养法 适用于分离高等真菌及植物病原菌适用于分离高等真菌及植物病原菌 高等真菌：如香菇高等真菌：如香菇切切1小块菌盖小块菌盖10%漂白粉消毒处理漂白粉消毒处理无菌水冲洗无菌水冲洗置琼脂平板上置琼脂平板上培养培养长出菌丝体长出菌丝体 注意：对蔓延性霉菌：注意：对蔓延性霉菌： 加加1%去氧胆酸钠去氧胆酸钠 察氏培养基：察氏培养基：0.01%蔗糖，蔗糖， 0.1%山梨糖山梨糖2、平皿反应快速检出法、平皿反应快速检出法定性或半定量定性或半定量（1）纸片培养显色法）纸片培养显色法 滤纸饱浸含

13、有指示剂的液体培养基滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基 用接种环接种用接种环接种 保湿恒温培养保湿恒温培养 据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量（2）透明圈法）透明圈法 根据琼脂培养上透明圈根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产菌落直径大小判别目的产物的产量物的产量 淀粉平板透明圈：淀粉酶淀粉平板透明圈：淀粉酶 碳酸钙平板透明圈：产酸碳酸钙平板透明圈：产酸 酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶 以大肠杆菌以大肠杆菌E. coli ATCC 80739为指示菌，为指示菌，对枯草芽孢杆菌对枯草芽孢杆菌R21-4进行紫外诱变，筛选

14、进行紫外诱变，筛选得到一株具有良好遗传稳定性的枯草芽孢杆得到一株具有良好遗传稳定性的枯草芽孢杆菌菌R21-15R21-15，抗菌蛋白的效价提高抗菌蛋白的效价提高58.49%58.49%。粗提蛋白对棉花黄、枯萎病菌的抑制作用粗提蛋白对棉花黄、枯萎病菌的抑制作用 （3）变色圈法）变色圈法 淀粉平板喷稀碘液淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶：透明圈，液化型淀粉酶 支链淀粉平板喷稀碘液支链淀粉平板喷稀碘液： 蓝色圈：异淀粉酶蓝色圈：异淀粉酶 无色圈：液化型淀粉酶无色圈：液化型淀粉酶 葡聚糖平板加刚果红葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶：葡聚糖酶 木聚糖平板加刚果红木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶：木聚糖酶（

15、4）生长圈法）生长圈法工具菌：工具菌： 营养缺陷型，不能合成的物质（生长因素）为目的营养缺陷型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积累的产物菌积累的产物 菌落形态明显不同于目的菌菌落形态明显不同于目的菌方法：方法：106107 工具菌与样品稀释液一起涂布至工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育（5）抑制圈）抑制圈 适用：抗生素产生菌的选育适用：抗生素产生菌的选育 工具菌：对目的抗生素敏感的微生物工具菌：对目的抗生素敏感的微生物 例：目的菌为产

16、生抗例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株细菌的抗生素的菌株 工具菌可使用金黄色葡萄球菌工具菌可使用金黄色葡萄球菌 方法方法 目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落 代谢物积累：用打孔器（代谢物积累：用打孔器（6MM）将菌落连同周围琼脂将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5d，使新产生抗生素积累于小琼脂块中使新产生抗生素积累于小琼脂块中 测定：取测定：取107工具菌涂布于琼脂培养基，将小琼脂块放工具菌涂布于琼脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗于上面培养

17、过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低生素，大小说明抗生素单位的高低琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序（6）菌落特征 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。以初步识别。35（7）从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素产物分子的结构定性分析（利用紫外扫描光谱、产物

18、分子的结构定性分析（利用紫外扫描光谱、核磁共振、核磁共振、CD谱、高压液相色谱、远红外分析、谱、高压液相色谱、远红外分析、X-射线衍射分析、穆斯堡尔谱等）射线衍射分析、穆斯堡尔谱等）产物的定量分析产物的定量分析3、厌氧性微生物的分离法、厌氧性微生物的分离法（1）去除培养基中的溶解氧，降低）去除培养基中的溶解氧，降低Eh（氧化氧化还原电位）还原电位） 煮沸法：将培养基置沸水中煮沸煮沸法：将培养基置沸水中煮沸15分钟，驱分钟，驱除其中的溶解氧，勿再摇动，除其中的溶解氧，勿再摇动，Eh可降至可降至0.1V 以下以下 培养基预还原：将培养基中加入还原性物质：培养基预还原：将培养基中加入还原性物质：半胱

19、氨酸，巯基化生物，半胱氨酸，巯基化生物，Na2S，抗坏血酸等抗坏血酸等降低降低Eh（2）创造无氧环境）创造无氧环境 物理除氧物理除氧 空气置换法：干燥器或厌氧培养罐空气置换法：干燥器或厌氧培养罐抽真空抽真空 76mmHg充入充入N2 （反复反复3次）次）充入充入CO2 10% +H2 10% + N2 80%化学除氧化学除氧 H2 + O2 H2O (钯作催化剂）钯作催化剂） GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反应产生学反应产生H2 和和CO2，H2与与O2反应生成水反应生成水厌氧指示剂厌氧指示剂（3）厌氧分离（培养）技术）厌氧分离（培养）技

20、术高层琼脂柱技术高层琼脂柱技术厌氧罐技术厌氧罐技术厌氧手套箱技术厌氧手套箱技术厌氧手套箱厌氧手套箱厌氧培养装置厌氧培养装置2.2.4 筛选筛选1、初筛初筛：通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行，：通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行，每株一瓶每株一瓶o 目的：淘汰目的：淘汰80%-90%的分离菌株中的低产菌的分离菌株中的低产菌（1）培养条件：主要通过查阅资料及需要而预）培养条件：主要通过查阅资料及需要而预先决定：如培养基组成，通风量（装液量，摇先决定：如培养基组成，通风量（装液量，摇瓶机转数），瓶机转数），pH、温度、培养时间等。温度、培养时间等。（2）分析测定：最好定量，如较困难时可采取）分析测定：最好

21、定量，如较困难时可采取半定量方法半定量方法2、复筛、复筛：每株：每株35瓶，可提前培养种子，使瓶，可提前培养种子，使接种量比较一致，接种量比较一致，35%接种量，接种量，o 培养条件可同初筛培养条件可同初筛o 分析测定：定量，注意副产物分析测定：定量，注意副产物 复筛可进行多次，逐步淘汰，留下复筛可进行多次，逐步淘汰，留下35株株甚至最好的甚至最好的1株株 初筛和复筛的比较 初 筛 复 筛种 子 斜面菌种 液体种子摇 瓶 每株 1 瓶 每株 3-5 瓶接 种 量 每瓶一环 35%取舍情况留下产量较高的 10- 20%的菌株每次保留 1020%，直至最后 35 株好氧培养好氧培养452.2.5

22、复筛高产菌株的分类鉴定o 菌体形态特征分析 菌体大小、排列、运动性、产芽孢（孢子）特征、产荚膜？鞭毛、菌丝分枝？染色特征o 生理生化特征分析 碳源、氮源、无机盐、生长因子、产酶反应、药物敏感性o 遗传特征鉴定 1、G+C（mol%)（差异5%可以认为不同种，10%可以认为不同属, 2、 16s rRNA的基因序列（同源性97%认为同种）46举例：产PGA芽孢杆菌的鉴定o 细胞形态特征 菌体大小 芽孢形状 芽孢着生位置 G+或G-等47生理生化特征502.2.6 培养工艺条件试验与生产试验培养工艺条件试验与生产试验1、摇瓶发酵条件、摇瓶发酵条件 培养基组成，初始培养基组成，初始pH，通风量（装液

23、量），通风量（装液量），接种量，培养温度接种量，培养温度2、小型台式发酵罐发酵工艺条件、小型台式发酵罐发酵工艺条件 溶解氧控制，溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，值控制，原料添加模式，消泡剂消泡剂51培养基配方的获得o 单因素试验o 多因素试验（正交试验）o 回归试验o 最佳配方的验证o 整个发酵条件的优化举例碳氮源对Bacillus subtilis发酵产PGA的影响 o 基本发酵培养基：L-Glu 20g/L，CTA 10g/L，NH4Cl 4g/L，MgSO47H2O 0.5g/L，FeCl36H2O 0.02g/L，K2HPO4 1g/L，CaCl22H2O 0.2g/L，MnSO

24、4H2O 0.05g/L, 蒸馏水配制，用NaOH调pH7.4，0.1MPa灭菌20min。o 基本发酵条件:采用300mL三角瓶，装液量50mL，无菌培养容器封口膜封口，摇瓶转速150rpm，种子液种龄24h，接种量4%，37振荡培养96h。 初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)枯草芽孢杆菌合成-PGA培养基优化的回归试验设计 o 对甘油及柠檬酸添加量的优化(正交组合设计) 选择因素:Z1甘油（g/L）,40120; Z2柠檬酸（g/L）,420 其它发酵条件为：Glu 20g/L，(NH4)2SO4 7g/L，K2HPO43H2O 0.7g/L，MgSO47H2O 0.5g/L，FeCl

25、36H2O 0.02g/L，CaCl2 0.25g/L，MnSO4H2O 0.3g/L，pH6.5，装液量50mL/300mL三角瓶，接种量4%(培养24h种子液)，摇瓶转速150r/min。取三水平，Z1：40，80，120; Z2：4，12，20。作变换：X1=（Z1-80）/40， X2=（Z2-12）/8o 试验方案及试验结果的分析下表 o 综合对碳源、氮源及无机离子的优化试验，得到优化发酵培养基（二）：o L-Glu 20g/L，CTA 9.864g/L，Glycerol 80.36g/L，(NH4)2SO4 7g/L，MgSO47H2O 0.5g/L，FeCl36H2O 0.022

26、4g/L，K2HPO4 0.8922g/L，CaCl2 0.0323g/L， MnSO4H2O 0.3g/L, 蒸馏水配置，用NaOH调pH6.5，0.1MPa灭菌20min。o 基本发酵条件：采用300mL三角瓶装液量50mL，种子液24h，接种量4%（v/v）,摇瓶转速150r/min，37振荡培养96h。摇瓶水平到反应器水平的优化配方摇瓶、反应器培养基研究的两个层次q 摇瓶培养基设计的第一步q 反应器最终的优化的基础配方例：青霉素发酵发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO4 0.8% 轻质碳酸钙1%发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8% 补加硫酸、前体等摇瓶发酵培养基和罐的基础培养基差别很大pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究发酵罐：反应器水平, 可以得出最 终优化的基 础配方69小结：微生物菌种的发掘程序微生