第十八章高效液相色谱法

1、一、教学内容一、教学内容1. 高效液相色谱的类型2. 固定相和流动相及其选择3. 高效液相色谱仪的组成和各部件的作用4. 定性和定量分析方法二、重点与难点二、重点与难点1. 高效液相色谱与气相色谱的异同点2. 高效液相色谱速率理论方程式在实验条件优化中的应用3. 固定相和流动相的选择4. 不同种类高效液相色谱分离的原理上的差异 三、教学目标三、教学目标了解高效液相色谱仪的组成熟练掌握高效液相色谱中的反相和正相色谱的分离原理和 实验条件3. 掌握化学键合相固定相和流动相及其选择4. 速率理论方程式在高效液相色谱法的应用5. 掌握高效液相色谱分离分析中的定性和定量方法 高效液相色谱法： 一种用液体

2、为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-12g （荧光检测）经典液相色谱法与高效液相色谱法的比较经典液相色谱法高效液相色谱法 常压或减压 填料颗粒大 柱效低 分析速度慢 色谱柱只用一次 不能在线检测 高压，4050MPa 填料颗粒小，250m 柱效高,4000060000块/m 分析速度快 色谱柱可重复多次使用 能在线检测气相色谱与高效液相色谱的比较 气相色谱高效液相色谱不能用于热

3、不稳定性物质的分析高温（程序升温）有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏的通用检测器（FID和TCD）流动相为气体，无毒运行和操作容易 可以用于热不稳定物质的分析 室温 没有较高灵敏的通用检测器 流动相有毒，可供选择范围宽 （梯度洗脱） 运行和操作比GC难一些 特点： 具有分离效率高 选择性好 分析速度快 检测灵敏度高 应用范围广 流动相选择范围宽 柱后流出组分不被破坏，易制备 第一节 高效液相色谱法的主要类型 及其固定相和流动相 一、主要类型一、主要类型 1.固定相的聚集状态固定相的聚集状态 液液色谱法（液液色谱法（LLC）和液固色谱法（）和液固色谱法（LSC） 2.分离机制：分离机制： 分配色谱

4、法分配色谱法 吸附色谱法吸附色谱法 离子交换色谱法离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（空间排阻色谱法（SEC）3.其他色谱类型其他色谱类型亲合色谱法（亲合色谱法（AC） 手性色谱法（手性色谱法（CC）胶束色谱法（胶束色谱法（MC） 电色谱法（电色谱法（EC）化学键合相色谱法化学键合相色谱法 固定相应符合下列要求：固定相应符合下列要求： 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。二、固定相二、固定相( (一一) )化学键合相色谱法化学键合相色谱法（键合相色谱法） 化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的色谱法。根据化学键合相与流动相极性的相对强弱根据

5、化学键合相与流动相极性的相对强弱 正相和反相键合相色谱法正相和反相键合相色谱法 l 化学化学键合相键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相 。1.键合反应硅氧烷（SiOSiC）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应 硅氧碳键型：硅氧碳键型： SiOC 化学键合相形成具备的条件化学键合相形成具备的条件 2.固定液应有与载体表面发生化学反应的官能团1.载体表面应有某种活性基团2.键合相的种类 （1）非极性键合相非极性键合相 ：非极性烃基，如C18C8C1与苯基等键合在硅胶表面； 用于反相色谱；ODS（2）极性键合相：）极性键合相：常用-NH2、-CN键合相（氰乙硅烷基Si(CH2)2

6、CN)键合硅胶 一般用于正相色谱 （3）离子交换键合相：）离子交换键合相：常用-SO3H、 -COOH、 、-R3NCl3.键合相的性质含碳量：含碳的百分数 覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例 封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。 4.键合相的特点 使用过程中不流失； 化学稳定性好； 柱效高，分离选择性好； 适于梯度洗脱； 载样量大 注意： 流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解； (也有适用宽pH范围的键合相)三、高效液相色谱法的流动相三、高效液相色谱法的流动相 对流动相的要求：1. 与固定相不发生化学反应。

7、2. 对试样有适宜的溶解度。使k在110范围内，3. 与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。4. 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈等可以降低柱压，提高柱效。 （一）流动相对分离的影响（一）流动相对分离的影响2211-4nkkR1. 溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2. 溶剂的选择性 不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 混合溶剂（二元或多元流动相）（二）流动相的强度和选择性（二）流动相的强度和选择性 多元混合溶剂的溶剂极性参数计算多元混合溶剂的溶剂极性参数计算 niiiPP1mix式中式

8、中i 为混合溶剂中各溶剂的体积百分数。为混合溶剂中各溶剂的体积百分数。 二元混合溶剂的则为二元混合溶剂的则为 PPPBAAAB 式中式中A， B分别为二元混合溶剂中溶剂分别为二元混合溶剂中溶剂A和溶剂和溶剂B的体积百分数。的体积百分数。溶剂的选择性溶剂的选择性 溶剂可分为八组而分别位于图中不同区。溶剂可分为八组而分别位于图中不同区。I组的组的xe值较大，值较大，属质子受体溶剂；属质子受体溶剂；VII组的组的xd值较大，属质子给于体溶剂；值较大，属质子给于体溶剂；V组的组的xn值较大，属偶极作用力溶剂。同组溶剂在分离中具有相似的选值较大，属偶极作用力溶剂。同组溶剂在分离中具有相似的选择性，不同组

9、差别较大。择性，不同组差别较大。溶剂的选择性溶剂的选择性多元混合溶剂的溶剂极性参数计算多元混合溶剂的溶剂极性参数计算 对于正相色谱，二元溶剂的极性参数对于正相色谱，二元溶剂的极性参数P 和组分的和组分的k值存在如下值存在如下关系：关系：2/ )(121210PPkk 式中分别为初始和调节后二元溶剂的极性参数。式中分别为初始和调节后二元溶剂的极性参数。k1、k2为组分为组分相应的容量因子。相应的容量因子。例例 在一反相色谱柱上，当流动相为在一反相色谱柱上，当流动相为30%甲醇和甲醇和70%水水(体积比体积比)时，某组分的保留时间为时，某组分的保留时间为25.6min，死时间为，死时间为0.35m

10、in，如何调节溶剂配比使组分容量因子为，如何调节溶剂配比使组分容量因子为5？解：初始值解：初始值1723503506251.k 78210700153001.P 2/ )7 . 8(2101 .725P27 . 816. 12P2 .10)1 (1 . 538. 6 = 0.75 即调整溶剂比例为即调整溶剂比例为75%甲醇和甲醇和25%水可使该组分的水可使该组分的k值为值为5。l 固定相固定相：极性键合相 如CN、NH2或二羟基键合硅胶流动相流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂l 适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物 分离机制？分离机制？ 分配：把有机键合层作为一个液膜看待，

11、溶质在两相的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用四、正相键合相色谱法四、正相键合相色谱法 组分的保留和分离组分的保留和分离 分离选择性决定于键合相的种类、流动相的分离选择性决定于键合相的种类、流动相的强度和试样的性质强度和试样的性质 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，减小，tR 减小。反之，减小。反之， k增大，增大，tR增大。增大。 极性强的组分极性强的组分k大，后洗脱出柱。大，后洗脱出柱。五、反相键合相色谱法五、反相键合相色谱法1. 固定相：非极性键合相固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（如十八烷基硅烷（C18，ODS）

12、、辛烷基（）、辛烷基（C8）键合硅胶）键合硅胶 流动相：流动相：水水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂 常用甲醇水、乙腈水等常用甲醇水、乙腈水等应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等 2. 保留机制：疏溶剂理论保留机制：疏溶剂理论溶质的保留主要是溶质分子与溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的极性溶剂分子间的排斥力排斥力，促，促使溶质分子与键合相的烃基发使溶质分子与键合相的烃基发生生疏水缔合疏水缔合。不是溶质分子与。不是溶质分子与键合相间的色散力。键合相间的色散力。3.保留行为的

13、主要影响因素保留行为的主要影响因素 （1）溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。（2）固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。 （3）流动相）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大越大 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加，使溶剂比例：水的比例增加，使k增大增大 中性盐的加入：使中性溶质的中性盐的加入：使中性溶质的k增大增大 pH：影响

14、弱酸、弱减的离解：影响弱酸、弱减的离解 流动相的流动相的pH降低，弱酸降低，弱酸k增大，增大，tR增大；弱碱增大；弱碱k变小。变小。1在正相色谱中，若适当增大流动相极性则（ ）。 A 样品的k降低，tR降低 B 样品的k增加，tR增加 C 相邻组分的增加 D 对基本无影响2用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇一水为流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好的办法是（ ）。 A 增加流动相中甲醇的比例 B 增加流动相中的水的比例 C 流动相中加人少量HAc D 流动相中加人少量的氨水用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作

15、用，使k变大。 离子抑制色谱法（离子抑制色谱法（ISC ） 适用于3pKa7的弱酸、7pKa8的弱碱 弱酸，降低流动相pH，k增大， tR增大 弱减，提高流动相pH，k增大，tR增大 把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（counter ion）生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。 六、反相离子对色谱法（六、反相离子对色谱法（PIC） 用于分离可离子化和离子型的化合物用于分离可离子化和离子型的化合物l 离子对模型离子对模型33+()+3s3(+固定相固定相+()+B)+B + H+BHRSO NaRSO + Na+BH RSO

16、RSO)BH离子对mB+AB AmA(smBAmmmsmsBAAABABBABEK流动相流动相通式通式影响容量因子的因素影响容量因子的因素 1. 离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大 2. 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大3. 固定相 、流动相性质（同一般RP-HPLC）。 第二节第二节 高效液相色谱法分离条件的选择高效液相色谱法分离条件的选择 （一）（一）HPLC中的速率理论中的速率理论 涡流扩散A=2dp 球形、小粒度、均匀（RSD5%）固定相， 匀浆高压填充，以降低A。纵向扩散=2Dm 可

17、以忽略。因为Dl很小，室温操作，且U大于U最佳，传质阻抗：固定相传质阻抗CS可以忽略 ，因df极小 流动相传质阻抗Cm m2PmmDdC要求： dp小，Dm大静态流动相传质阻抗： 由于部分流动相在固定相微孔内的滞留静态流动相传质阻抗系数Csm Csm dp2， Csm 1/Dm，而DmT/ 要求: 固定相dp2、 流动相都小H=A+Cmu+Csmu HPLC的实验条件应该是：小粒度、均匀的球形化学键合相；低粘度流动相，流速不宜过快；柱温适当。 （一）正相键合相色谱法的分离条件（一）正相键合相色谱法的分离条件 固定相：极性键合相如氰基、氨基键合相等流动相：烷烃加适量极性调节剂（二）反相键合相色谱

18、法的分离条件（二）反相键合相色谱法的分离条件固定相：非极性键合相如ODS流动相：以水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂 弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子抑制剂加入0.1%1%的醋酸盐、磷酸盐可减少残余硅醇基的作用 二、分离条件二、分离条件的选择的选择（三）反相离子对色谱法的分离条件（三）反相离子对色谱法的分离条件 固定相 尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相离子对试剂 离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反 流动相pH使试样组分与离子对试剂全部离子化有机溶剂及其浓度 同一般HPLC 第三节高效液相色谱仪进样器馏分收集器记录仪检测器流程（1）高压输液泵）高压输液泵输液泵应具备的性能：

19、输液泵应具备的性能： 流量精度高且稳定流量精度高且稳定 流量范围宽流量范围宽 能在高压下连续工作能在高压下连续工作 液缸容积小液缸容积小 密封性能好，耐腐蚀密封性能好，耐腐蚀 恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。 常用柱塞往复泵常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。双泵：为了克服流量的脉动。 有串联式和并联式有串联式和并联式输液泵操作注意事项：输液泵操作注意事项： 防止固体微粒进入泵体防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力不超过规定的最高压力 流动相

20、一般应该先脱气流动相一般应该先脱气 梯度淋洗（洗提、洗脱）梯度淋洗（洗提、洗脱） 分离过程中按一定程序连续改变载液中溶剂即流动相分离过程中按一定程序连续改变载液中溶剂即流动相的配比和极性以提高分离效果（类似的配比和极性以提高分离效果（类似GC中的程序升温）中的程序升温）高压梯度和低压梯度高压梯度和低压梯度高压梯度低压梯度二、分离和进样系统二、分离和进样系统 进样器进样阀（六通阀）、自动进样装置色谱柱色谱柱分析柱、制备柱分析柱、制备柱 性能评价性能评价 ：H、n、fs、k和和的重复性，或的重复性，或R。 柱效评价柱效评价1.1.硅胶柱：硅胶柱：样品：苯、萘、联苯及菲（己烷配制） 流动相：无水己烷

21、2. 反相色谱柱：反相色谱柱：样品：尿嘧啶、硝基苯、萘及芴 流动相：甲醇-水（85：15） 或乙腈-水（60：40）3. 正相色谱柱：正相色谱柱：样品：四氯乙烯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇 流动相：正庚烷 色谱柱再生色谱柱再生1.反相色谱柱： 先以甲醇-水（95：5）、甲醇、一氯甲烷为流动相依次冲洗，再以相反顺序依次洗脱。 2.正相色谱柱： 先以正己烷、异丙醇、一氯甲烷及甲醇为流动相依次冲洗，再以相反顺序依次洗脱。三、检测系统三、检测系统（一）检测器（一）检测器(detector)的主要性能的主要性能要求：要求： 灵敏度高（检测限低） 噪音低 线性范围宽 重复性好 适用范围广

22、（通用型、专属型） （二）紫外检测器（二）紫外检测器检测原理： 朗伯比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比 A=Cl 特点： 灵敏度较高（10-610-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。局限： 只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。 紫外检测器紫外检测器固定波长检测器 ：254nm可变波长检测器：光源：氘灯（和钨灯）， 200400（800）nm， 单色器，流通池（试样），光电管光路系统和紫外分光光度计相似 光电二极管阵列检测器 (photodiode array detector；P

23、DAD)：一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光 紫外检测器紫外检测器 光电二极管阵列检测器工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维光谱色谱图。用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量,判断峰纯度。 （三）荧光检测器（三）荧光检测器(FD)检测原理：化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的光，称为荧光 荧光强度 (F) 与激发光强度 (I0) 及荧光物质浓度 (C) 之间的关系为： F=2.3QKI0Cl Q为量子产率，K为荧光效率，为摩尔吸光系数，l为光径长度。 F=

24、KC 特点：选择性好，专属型检测器 灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10 g/ml）激发波长(ex)和发射波长(em)的选择第四节第四节 高效液相色谱分析方法高效液相色谱分析方法 l 定性分析方法定性分析方法l 定量分析方法：定量分析方法：l外标法、内标法外标法、内标法同同GC（自己看）（自己看）1. 计算在某色谱条件下，分析只含有二氯乙烷，二溴乙烷及四乙基铅三组分的样品，结果如下： 二氯乙烷 二溴乙烷 四乙基铅相对质量校正因子 1.00 1.65 1.75峰面积cm 2 1.50 1.01 2.82(1)试求各组分的百分含量。 上述色谱分析采用了何种定量方法? 该定量方法有何优点和局限性?

25、 2.已知物质A和B在一根30.00 cm长的柱上的保留时间分别为16.40 min和17.63 min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30 min。峰底宽度分别为1.11 min和1.21 min，计算：（1）柱的分离度；（2）柱的平均塔板数（3）达到1.5分离度所需的柱长度。二、二、 分离类型选择分离类型选择分析实例：分析实例：环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。 固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：示差折光检测器 稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析

26、 稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器血浆分析血浆分析2.已知物质A和B在一根30.00 cm长的柱上的保留时间分别为16.40 min和17.63 min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30 min。峰底宽度分别为1.11 min和1.21 min，计算：（1）柱的分离度；（2）柱的平均塔板数（3）达到1.5分离度所需的柱长度。主要内容1.化学键合相色谱法的原理： 反相键合相色谱法 反相离子对色谱法 正相键合相色谱法2.化学键合相色谱法的固定相、流动相3.化学键合相色谱法的分离条件4.高效液相色谱中的速率理论5.定量分析方法6.紫外、荧光检测器1HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（ ）。 A 柱前压力