优质课土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、科学家是从水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶。 Taq细菌是美国科学家鲁克在一个热泉中发现有选择作用该培养基中是以尿素为唯一氮源，只有能够利用尿素的微生物才能够生长（只有合成脲酶的微生物，才能分解尿素） 。经过培养，能选择出分解尿素的微生物在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。注意：平板划线法只能纯化该种微生物，并不能用来准确统计样品中活菌的树数目，但是稀释涂布平板法既能纯化该种微生物，又能用来准备统计数目 第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。 第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，

2、其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值实验启示在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。注意事项注意事项设置重复组，增强实验的说服力与准确性。设置重复组，增强实验的说服力与准确性。为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板的平板进行计数。进行计数。当菌落数目稳定时，才能进行计数，否则，会因培养时当菌落数目稳定时，才能进行计数，否则，会因培

3、养时间不足而导致遗漏菌落的数目。间不足而导致遗漏菌落的数目。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。（因此统计结果一果一般用菌落数而不是活菌数来表示。（因此统计结果一般用菌落数而不用活菌数来表示）般用菌落数而不用活菌数来表示） 思考：想一想，如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？ 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好统计三个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算（三）设计对照是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证

4、明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。从肥沃、酸碱度接近从肥沃、酸碱度接近中性中性的湿润土壤中取样。先的湿润土壤中取样。先铲去表层土铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌灭菌。二二、实验设计实验设计（二）、制备培养基 制备牛肉膏蛋白胨培养基制备牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一和以

5、尿素为唯一氮源的氮源的选择培养基（可以是土壤取样前完成）选择培养基（可以是土壤取样前完成）为什么要制备牛肉膏蛋白胨培养基呢？ 将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显养基上生长的菌落数目应明显多于多于选择培养基上选择培养基上的数目，因此，的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了照，用来判断选择培养基是否起到了选择选择作用。作用。（三）、样品的梯度稀释 测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选由

6、于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为稀释倍数为103107。 每个稀释度下需要每个稀释度下需要3个个选择培养基，选择培养基，1个牛肉膏蛋白个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要胨培养基，因此共需要15个选择培养基，个选择培养基，5个牛肉膏个牛肉膏蛋白胨培养基。蛋白胨培养基。 思考：思考： 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的稀释范围相同吗？（四）、取样

7、涂布（稀释涂布培养法）实验前要对培养皿作好标记。注明培养基实验前要对培养皿作好标记。注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等度等。（六）、细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在当菌落数目稳定时，选取菌落数在3030300300的平板进行计的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对数。在同一稀释度下，至少对3 3个平板进行重复计数个平板进行重复计数，然后求，然后求出出平均值平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。数目。 总结：分离土壤中分解尿素的细菌实验设计流程总结：分离土壤中分解尿素的

8、细菌实验设计流程1本实验的流程：土壤取样本实验的流程：土壤取样样品梯度稀释样品梯度稀释取样涂布取样涂布微生物的培养微生物的培养观察并记录结果观察并记录结果细菌计数细菌计数注意事项注意事项(1)要设置重复实验。主要目的是排除实验中人为因素要设置重复实验。主要目的是排除实验中人为因素对实验结果的影响，增强实验结果说服力和准确性。对实验结果的影响，增强实验结果说服力和准确性。统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个个平板作重复组。平板作重复组。(2)要设置对照实验：主要目的是排除实验组中非测试要设置对照实验：主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结

9、果的影响，提高实验结果的可信度。因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。判断培养基是否有杂菌污染，需将未接种的相同培判断培养基是否有杂菌污染，需将未接种的相同培养基同条件下同时进行培养。养基同条件下同时进行培养。判断该培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋判断该培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基接种相同样品后同条件下同时培养。白胨培养基接种相同样品后同条件下同时培养。1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。本实验使用的平板和试管较多。为了避免混

10、淆，最好在使用前就做好标记。例如，注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三、操作提示四、结果分析与评价1、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，则说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30300的平板。在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？ 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数五、课题延伸1. 对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助生物化学的