NatureofMutations

1、遗遗 传传 分分 析析发育生物学研究所发育生物学研究所吴晓晖吴晓晖 xiaohui_IV. 分析突变分析突变 突变对应了多少个基因？突变对应了多少个基因？ 每个基因分别是什么？每个基因分别是什么？ 基因突变导致哪些异常？基因突变导致哪些异常？ 各个基因怎样受到突变影响？各个基因怎样受到突变影响？ 各个基因的正常功能？各个基因的正常功能？ 各个基因的相互作用？各个基因的相互作用？ 有什么没被发现？有什么没被发现？突变表型分析突变表型分析 突变表型：一个生物体携带的基因突变表型：一个生物体携带的基因突变造成的各种表型变化突变造成的各种表型变化 野生表型：正常个体野生表型：正常个体(野生型野生型)的

2、表型的表型 自然野生群体缺乏一致表型自然野生群体缺乏一致表型乳腺癌患者的人种差异乳腺癌患者的人种差异 发生率发生率 (2005-2009) 白人：白人：122.1 x 10-6 黑人：黑人：116.9 x 10-6 死亡率死亡率/发生率发生率 (2005-2009) 白人：白人：0.18 黑人：黑人：0.27 65岁生存率岁生存率 (各各7,375名名) 白人：白人：68.8% 黑人：黑人：55.9% 治疗差异的差异：治疗差异的差异：0.81%CDC, MMWR, 2012Silber JH et al. JAMA, 2013用于遗传分析的野生型用于遗传分析的野生型 选择自交系为野生型选择自交

3、系为野生型 所有个体基因型一致所有个体基因型一致 所有位点均已纯合化所有位点均已纯合化 由野生型出发进行诱变筛选由野生型出发进行诱变筛选 实际使用中的限制实际使用中的限制 自交系不健康自交系不健康(小鼠小鼠) 多种充当野生型的自交系多种充当野生型的自交系(小鼠、斑马鱼、小鼠、斑马鱼、果蝇、酵母、拟南芥等果蝇、酵母、拟南芥等) 自交系存在遗传漂变自交系存在遗传漂变 (果蝇果蝇)遗传背景影响着表型遗传背景影响着表型Qiu J et al, Endocrinology 2001 142: 3421-5Ob突变引起突变引起C57BL/6J和和BALB/cJ小小鼠表现不同鼠表现不同与多个自交系回交以了解

4、基因功能与多个自交系回交以了解基因功能克服遗传背景的影响克服遗传背景的影响 诱变筛选获得的品系往往携带多个突变诱变筛选获得的品系往往携带多个突变 利用遗传定位检测各种表型是否定位一利用遗传定位检测各种表型是否定位一致致 Nusslein-Volhard和和Weischaus分别定位了分别定位了致死和胚胎发育图式表型致死和胚胎发育图式表型 通过连续回交获得携带单一突变的个体通过连续回交获得携带单一突变的个体 在反式杂合子中检测突变表型在反式杂合子中检测突变表型 Nusslein-Volhard和和Weischaus用反式杂合用反式杂合子确认了几乎所有突变表型子确认了几乎所有突变表型基因功能多效性

5、与表型基因功能多效性与表型 单个基因经常在不同生命活动中起作用单个基因经常在不同生命活动中起作用(pleiotropy) 一类表型可以掩盖另一类表型一类表型可以掩盖另一类表型 诱变筛选发现特定表型的突变体诱变筛选发现特定表型的突变体 突变体往往具有其他表型突变体往往具有其他表型原发表型与继发表型原发表型与继发表型 突变经常引起一系列因果相继的表突变经常引起一系列因果相继的表型变化型变化 筛选经常发现最终的表型缺陷筛选经常发现最终的表型缺陷 确定原发表型需要细致分析确定原发表型需要细致分析筛选刚毛发育突变体筛选刚毛发育突变体Rooke et al, 1996Epidermal precursor

6、sProneural GenesProneural cluster cellsNotch SignalingNeural precursors发现调控发现调控细胞命运的基因细胞命运的基因Artavanis-Tsakonas et al, 1997IV. 分析突变分析突变 突变对应了多少个基因？突变对应了多少个基因？ 每个基因分别是什么？每个基因分别是什么？ 基因突变导致哪些异常？基因突变导致哪些异常？ 各个基因怎样受到突变影响？各个基因怎样受到突变影响？ 各个基因的正常功能？各个基因的正常功能？ 各个基因的相互作用？各个基因的相互作用？ 有什么没被发现？有什么没被发现？突变对基因功能的影响突变

7、对基因功能的影响 丧失功能的突变丧失功能的突变 亚效突变亚效突变(Hypomorphs): 部分失活部分失活 无效突变无效突变(Amorphs): 完全失活完全失活 (null) 获得功能的突变获得功能的突变 超效突变超效突变(Hypermorph): 表型效应超过野生型基因表型效应超过野生型基因 (显性激活显性激活，dominant active) 反效突变反效突变(Antimorph): 作用和野生型基因相对抗作用和野生型基因相对抗 (显性失活，显性失活，dominant negative) 新效突变新效突变(Neomorphs): 产生野生型基因没有的新性产生野生型基因没有的新性状状表型

8、评估表型评估 显性与隐性显性与隐性等位基因与表型的共有特征等位基因与表型的共有特征对生命活动稳健性的影响对生命活动稳健性的影响 评估表型的强弱评估表型的强弱外显率外显率: : 具有表型的动物比例具有表型的动物比例表现度表现度: : 表型的严重程度表型的严重程度The Cell, 2nd ed, GM Cooper线虫产卵器发育线虫产卵器发育The Cell2nd edGM CooperRas 在产卵器诱导中的作用在产卵器诱导中的作用Vulval+acVulacMuvac正常状态正常状态Ras的调控的调控: : 被限制的被限制的 VPC 诱导诱导 形成一个产卵器形

9、成一个产卵器Ras失活失活: : 没有没有VPC 诱导诱导 没有产卵器形成没有产卵器形成(Vul)Ras 过度激活过度激活: : 所有所有 V VPCs 被诱导被诱导多个产卵器形成多个产卵器形成(Muv)失活突变失活突变 线虫线虫let-60 ras 完全失活完全失活 - - 早期致死早期致死 = = ras维持生命维持生命 部分失活部分失活 - - 没有产卵器没有产卵器 = = ras在产卵器诱导中起作用在产卵器诱导中起作用10050W.T.VulLethal产卵器正常发育所需最小基因剂量存活所需最小基因剂量完全失活突变完全失活突变 显示了最完整的基因功能显示了最完整的基因功能 容易推断出正

10、常的基因功能容易推断出正常的基因功能 在信号通路研究中更具说服力在信号通路研究中更具说服力 ( (上位分析上位分析) )区分部分失活与完全失活 分子水平分子水平分子损伤分子损伤基因表达基因表达 遗传水平遗传水平表型的严重程度表型的严重程度与基因缺失系的比较与基因缺失系的比较根据表型强弱评估基因失活程度 外显率外显率: : 具有表型的动物数量具有表型的动物数量例例: : let-60 ras品系品系% 致死的动物致死的动物n20211%n187657% 外显率外显率: : 具有表型的动物数量具有表型的动物数量例例: : let-60 ras品系品系% 致死的动物致死的动物n20211%n1876

11、57% 表现度表现度: : 表型的严重程度表型的严重程度例例: : dpy-20 collagen 野生型野生型部分失活部分失活完全失活完全失活根据表型强弱评估基因失活程度例例: : dpy-20 collagen 野生型野生型部分失活部分失活完全失活完全失活 多效性多效性: : 显示出新的表型显示出新的表型多效性越强表明基因的突变越强多效性越强表明基因的突变越强根据表型强弱评估基因失活程度 外显率外显率: : 具有表型的动物数量具有表型的动物数量例例: : let-60 ras品系品系% 致死的动物致死的动物n20211%n187657% 表现度表现度: : 表型的严重程度表型的严重程度与缺

12、失系比较与缺失系比较 缺失系相应的基因完全失活缺失系相应的基因完全失活 完全失活突变的表型应与缺失系表型相似完全失活突变的表型应与缺失系表型相似 缺失系表型不应比完全失活表型严重缺失系表型不应比完全失活表型严重 多种比较多种比较 Df/mut = mut/mut Df/mut(weak) = null/mut(weak)非互补筛选非互补筛选非互补筛选非互补筛选 筛选与已知品系筛选与已知品系“无法互补无法互补”的新品系的新品系 从部分失活突变分离新的完全失活突变从部分失活突变分离新的完全失活突变 不需要对表型进行假设不需要对表型进行假设 完全失活表型最有力的遗传学证据完全失活表型最有力的遗传学证

13、据Hypomorph/Df已知表型已知表型Hypomorph/null相同已知表型相同已知表型Hypomorph/+根据表型寻找完全失活突变根据表型寻找完全失活突变诱变剂诱变剂非互补筛选非互补筛选 dpy-20 dpy-20 完全失活突变完全失活突变第一步：检测第一步：检测hypomorph/Df 是否引起一个可以是否引起一个可以用于筛选的表型用于筛选的表型W.T. dpy-20 (hypo) dpy-20 (hypo) dpy-20 (hypo) Df筛选这个表型筛选这个表型第二步：筛选第二步：筛选 + + dpy-20(hypo) dpy-20(hypo)x最常见:dpy-20(hypo)

14、/+Non-Dpy少见:dpy-20(hypo)/dpy-20(NEW)Dpy诱变剂非互补筛选非互补筛选 dpy-20 完全失活突变完全失活突变第三步：分析第三步：分析 表型最强的突变可能是完全失活突变表型最强的突变可能是完全失活突变 即使完全失活突变有新表型也可以被分离即使完全失活突变有新表型也可以被分离 会得到表型相同的显性突变会得到表型相同的显性突变! !非互补筛选非互补筛选 dpy-20 完全失活突变完全失活突变失活突变通常是隐性的失活突变通常是隐性的10050+/+/nullVul 表型的临界值Let 表型的临界值VulLet% 正常功能例例: let-60 ras结论结论: : 通

15、常检测到表型的临界值小于正常水平的通常检测到表型的临界值小于正常水平的50%50%显性的失活突变显性的失活突变 单倍剂量不足单倍剂量不足(Haploinsufficiency) 正常剂量的正常剂量的50%已经小于临界值已经小于临界值 可用缺失系表型模拟可用缺失系表型模拟 常见于剂量敏感的基因常见于剂量敏感的基因 由多突变产生的表型由多突变产生的表型 由肿瘤抑制基因突变导致的癌症易感性由肿瘤抑制基因突变导致的癌症易感性Rb-/+ - Rb-/- W.T. - 肿瘤肿瘤 Rb- 携带者易因自发的第二点突变而患视网膜母细携带者易因自发的第二点突变而患视网膜母细胞瘤胞瘤 常染色体显性常染色体显性区分各

16、种获得功能的突变区分各种获得功能的突变 根据基因剂量区分根据基因剂量区分增加野生型拷贝增加野生型拷贝减少野生型拷贝减少野生型拷贝超效突变超效突变 增强增强减弱减弱新效突变新效突变不变不变不变不变反效突变反效突变减弱减弱增强增强 用染色体缺失减少野生型拷贝数用染色体缺失减少野生型拷贝数 用染色体重复增加野生型拷贝数用染色体重复增加野生型拷贝数功能获得突变的等位性功能获得突变的等位性 无法进行互补测试无法进行互补测试 根据相似表型与相同遗传定位判断根据相似表型与相同遗传定位判断 寻找分子证据寻找分子证据 回复显性突变，产生完全失活品系，检测等位性回复显性突变，产生完全失活品系，检测等位性 例例.

17、Let-60(n1046gf)n1046/ n104695% Muvn1046/null7% Muvn1046/(n1046 null) 7% Muv+/+Dosagenull/+lfnullDp/+gf/+野生型野生型突变表型突变表型突变表型突变表型IV. 分析突变分析突变 突变对应了多少个基因？突变对应了多少个基因？ 每个基因分别是什么？每个基因分别是什么？ 基因突变导致哪些异常？基因突变导致哪些异常？ 各个基因怎样受到突变影响？各个基因怎样受到突变影响？ 各个基因的正常功能？各个基因的正常功能？ 各个基因的相互作用？各个基因的相互作用？ 有什么没被发现？有什么没被发现？ 表达与活性表达与

18、活性 空间分辨率与时间分辨率空间分辨率与时间分辨率 动物、组织、细胞、细胞器水平动物、组织、细胞、细胞器水平 发育阶段或实时检测发育阶段或实时检测基因产物在何时何地起作用？基因产物在何时何地起作用？基因表达分析基因表达分析检测检测RNA Northern 反转录反转录PCR 原位杂交原位杂交 报告基因转录报告基因转录 微芯片微芯片 大规模大规模RNA测序测序检测蛋白质检测蛋白质 Western 免疫荧光免疫荧光 报告基因表达报告基因表达 蛋白组学蛋白组学空间分辨率与时间分辨率空间分辨率与时间分辨率基因捕捉基因捕捉: 为突变基因贴上标签为突变基因贴上标签真核基因表达真核基因表达增强子增强子SASASDSDpolyAAAAAA启动子启动子插入突变插入突变SASASDSDpolyA增强子增强子启动子启动子增强子捕捉增强子捕捉SASASDSDpolyAAAAAA 获得细胞或组织特异标记获得细胞或组织特异标记 基因编码区可能仍在远处基因编码区可能仍在远处 可能不存在相应基因可能不存在相应基因 必需依靠内源基因表达进行选择必需依靠内源基因表达进行选择报告基因报告基因增强子增强子启动子启动子SASASDSDpolyA 难以发现内含子较小的基因难以发现内含子较小的基因