蛋白质研究的基本实验方法

1、蛋白质研究的基本实验方法南昌大学基础医学院生理教研室邹惟莹实验研究三个水平n整体水平：动物模型n细胞水平：形态、功能n分子水平：基因、蛋白质蛋白质的调控n基因序列的变化：ErbB2n染色质水平上基因活化的调节： 染色质的结构（对核酸酶的敏感程度增加） 组蛋白的甲基化（H3-K9 基因沉默，H3-K4 基因活化） 组蛋白的乙酰化 DNA的甲基化（5%C 甲基化 m5C； 5端CpG ）蛋白质的调控n转录水平的调控 顺式作用元件，反式作用因子（转录因子）n转录后的调控n翻译水平的调控n翻译后调控 磷酸化、糖基化、泛素化n定位蛋白质调控的研究nQualitative model (cyclins)n

2、Quantitative model (CDK)蛋白质研究的基本方法n免疫印迹（Western Blot）n免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）n染色质免疫共沉淀（ChIP）Western Blotn免疫印迹（蛋白质印迹） 是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。 是在凝胶电泳（高分辨率）和固相免疫测定技术（高特异性，高灵敏性）基础上发展而来。Western BlotWestern BlotnA. Sample preparationnB. ElectrophoresisnC. Transfer of proteins and staining (Western blot

3、ting)蛋白裂解液的制备n组织样品组织样品：取适量（约100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml 含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。n细胞样品细胞样品：每份样品取11061107 细胞，PBS 清洗细胞，去PBS，加0.1ml1ml 含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。蛋白裂解液的制备蛋白裂解液的制备nRIPA Buffer： 裂解液和细胞应充分接触，RIPA buffer足量。RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法但可用BCA法测定蛋白浓度。蛋白裂解液的制备n当

4、细胞破碎的时候，蛋白水解酶就会被释放出来或被激活。为了避免这些情况的出现，在样品制备时尽可能在低温下进行。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性，此时应当使用蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂。nWestern Blot 临用前可新鲜加入最终浓度为1mM的 PMSF（苯甲基磺酰氟）。nCo-IP 蛋白酶抑制剂：胃蛋白酶抑制剂(pepstantin)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、胰蛋白酶抑制剂(aprotinin)等；能够强烈抑制所有蛋白酶的活性（如丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶）。蛋白裂解液的制备n组织细胞裂解过程中释放大量内源性蛋白磷酸酶，以各种方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化

5、。nWestern Blot和免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、蛋白激酶活性测定，抑制磷酸化蛋白质去磷酸化，维护蛋白质的磷酸化状态。nNa3VO4、NaFn蛋白磷酸酶抑制剂蛋白磷酸酶抑制剂：特异性抑制某一种或几种蛋白磷酸酶活性。该混合物优化的组成使其可以强烈几乎所有重要的蛋白磷酸酶活性，包括蛋白丝/苏氨酸磷酸酶(PP1、PP2A、PP2B、PP2C)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等。蛋白质定量n直接紫外吸收法 含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸 280nm附近的紫外吸收峰 测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质 嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质干扰 适合于与色谱柱联用，达到实时监控，较

6、不准确n比色测定法蛋白质定量n比色测定法 在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。nBradford法 蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合 最大吸收峰从465nm变为595nm 在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比 不能含有太高浓度的去污剂，对样品的要求较高。蛋白质定量nLorry法 蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使肽键伸展，暴露出酪氨酸和色氨酸，在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种

7、蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。Lorry法进行了改良蛋白质定量nBicinchoninic acid (BCA )法 近来广为应用的蛋白定量方法。 原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与 Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比。 灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。 BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。蛋白质定量n绘制标准曲线 分别取一定体积的浓度为2mg/ml的标准BSA溶液，加PBS溶液至

8、20ul配成如下浓度梯度的BSA溶液:0m g/ml、0.015625mg/ml、0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0. 25 mg/ml、0.5 mg/ml、1mg/ml、2 mg/ml。样品(样品BSA溶液或蛋白质溶液)与PBS共25ul（0.1ml）加样，最后每孔均加200ul（2ml）工作液（BCA：Cu 50：1 嫩绿色）混匀，37 C孵育30 min, 冷却到室温后，酶标仪上562 nm处读数。Western Blot蛋白免疫印迹（Immunoblotting） n凝胶电泳（SDS -聚丙烯酰胺凝胶）n样品的印迹（蛋白质转移固相支持物：硝酸纤维

9、素膜（NC 膜）和PVDF 膜）n免疫学检测（用特异性的抗体检测所要研究的相应抗原）SDS-PAGESDS-PAGE原理原理n蛋白质中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷。n为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理(上样缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和-巯基乙醇的上样缓冲液。SDS-PAGEnSDS 即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na）：一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。n -巯基乙醇：强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。S

10、DS-PAGEn溴酚蓝染料：用于监控整个电泳过程。n蔗糖或甘油：增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。n高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷。SDS-PAGEn1xSample buffer: 60mM Tris-Cl pH 6.8 2% SDS（心脏，肌肉5%） 10% glycerol 0.01% Bromophenol blue 1.5% 2-mercaptoethanol SDS-PAGE SampleSDS-PAGEnpH 不连续和胶孔径大小不连续n电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层（孔

11、径大），pH8.8 的分离胶层在下层（孔径小），上槽为负极，下槽为正极。SDS-PAGEnPAGE 胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合，形成胶。SDS-PAGEn在浓缩胶运动中，Cl解离度大，Pro解离度居中，甘aaCOO解离度小，迁移顺序为（PH6.8）Cl Pro COO，一个Cl领路，COO推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。n由于胶联度小，孔径大，Pro受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。n当蛋白质进入分离胶时，此时Pro，Cl，甘aa 离子在PH8.8 的溶液中，Cl完全电离而很快到达正极，甘aa

12、电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。SDS-PAGEn由于Pro在电泳过程中，带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。SDS-PAGESDS-PAGEn催化剂：过硫酸铵（AP）在隔氧的状态下，最好现配现用，使用新鲜的。n加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。SDS-PAGESDS-PAGEn上样量：总蛋白量 20-50u

13、g（上样量过多使电泳条带变形）n70V，30min；110V，与待分离样品靶蛋白分子量相适应。SDS-PAGE Electrophoresis转膜（电转移）n印迹中常用的固相材料有NC 膜、尼龙膜、PVDF 等。nPVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。n有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa)。转膜nNC膜及滤纸的预处理： 剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1转移缓冲液平衡5分钟以上。（注意：必须保证NC膜始终完全浸于转移缓冲液中）nPVDF 膜的预处理： 剪裁与胶大小一致

14、的膜泡入甲醇中，约1-2 分钟。将其浸入1转移缓冲液平衡5分钟以上。转膜n缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素（或PVDF）膜上，膜可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。n有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成三明治形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素（或PVDF）膜上。转膜转膜n电流1mA-2mA/cm2，我们通常200mA-350mA，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间Western BlotWestern Blotn封闭（2h）：用蛋白溶液（如5的脱脂奶粉或BSA）处理以封闭硝酸纤维素（或PV

15、DF）膜上剩余的疏水结合位点。（先用0.2-0.5%丽春红预染）n一抗（过夜或2h）：只有待研究的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合，这样清洗去除未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。（反贴法）Western BlotWestern Blotn二抗（1h）：带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。n最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质的位置。eg：辣根过氧化物酶；碱性磷酸酶Western Blotn检测辣根过氧化物酶的方法n增

16、强化学发光法（ECL；2min） 辣根过氧化物酶在H2O2 存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。Western Blot 必需要内参！必需要内参！Western Blotn一、二抗的选择及比例n凝胶质量（气泡，脆）n电转方向，气泡，电流电压，温度nNC Tween200.3%n洗膜免疫共沉淀（co-IP）n免疫沉淀(IP) 利用抗原抗体特异性结合的特性，将抗原（靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。n免疫共沉淀(co-IP) 在体外探测2

17、个蛋白质分子之间是否存在特异性相互作用的一种方法。免疫共沉淀n原理 如果2个蛋白质分子能够发生特异性相互作用，当用一种蛋白质的抗体进行免疫沉淀，另一个蛋白质也会同时被沉淀下来。 抗原-抗体的免疫反应免疫共沉淀n抗体的选择 多克隆抗体：多位点结合，抗原抗体复合物 稳定；广泛，假阳性 单克隆抗体：单一结合特异性，相同靶蛋白 的不同修饰；非特异性少，交 叉反应免疫共沉淀n抗体固定（沉淀） 多聚糖凝胶颗粒Sepharose CL-4B 蛋白A或蛋白蛋白G 免疫共沉淀n当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argar