基因工程的酶学基础

1、第二章第二章 基因工程的酶学基础基因工程的酶学基础Enzymes一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶是一类能够识别是一类能够识别双链双链DNA分子中的某种分子中的某种特定核苷酸序列特定核苷酸序列（48bp），并由此处），并由此处切割切割DNA双链双链的核酸的核酸内切酶内切酶。（Restriction endonuclease）2. 性质性质内切酶。内切酶。原核生物。原核生物。即在核酸分子链的即在核酸分子链的内部内部制造切口的酶。制造切口的酶。自我保护作用。自我保护作用。限制性内切酶将侵入细菌体内的限制性内切酶将侵入细菌体内的外外源源DNA切成小片断。切成小片断。（1）限制（）限制（Rest

2、riction）细菌自身的细菌自身的DNA碱基被碱基被甲基化酶甲基化酶甲基化甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。酶识别切割。（2）修饰（）修饰（Modification） Dam甲基化酶甲基化酶GATC 腺嘌呤腺嘌呤N6位置引入甲基位置引入甲基 Dcm甲基化酶甲基化酶CCAGG或或CCTGG序列在第二个序列在第二个C上上C5位置上引入甲基位置上引入甲基I 型限制性内切酶型限制性内切酶 目前鉴定出目前鉴定出三种不同类型三种不同类型的限制性内切酶。的限制性内切酶。首先由首先由M. Meselson和和R. Yuan在在1968年从年从大肠杆菌大肠杆

3、菌 B株株和和 K株株分离的。分离的。（1）识别位点序列）识别位点序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC如如 EcoB和和 EcoK。未甲基化修饰的特异序列。未甲基化修饰的特异序列。需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。（3）作用机理）作用机理在距离特异性识别位点约在距离特异性识别位点约10001500 bp处处随机随机切开一条切开一条单链单链。Recognize sitecut1-1.5kb首先由首先由H.O. Smith和和K.W. Wilcox在在1970年从流感嗜血菌中分离出来。年从流感嗜血菌中分离出来。 （1）识别位点序列）

4、识别位点序列未甲基化修饰未甲基化修饰的的双链双链DNA上的特殊靶序上的特殊靶序列（多数是回文序列）。列（多数是回文序列）。 与与DNA的来源无关。的来源无关。分离的第一个酶是分离的第一个酶是Hind 切开切开双链双链DNA。形成。形成粘性末端粘性末端（sticky end）或）或平齐末端平齐末端（blunt end）。如：）。如：识别位点处。识别位点处。含有几个核苷酸含有几个核苷酸单链单链的末端。的末端。分两种类型：分两种类型： 5端凸出（如端凸出（如EcoR I切点）切点）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCAG GACGTC 5

5、-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC 连接便利连接便利 i）不同的）不同的DNA双链：双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个）同一个DNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接通过两个相同的粘性末端可以连接成成环形分子环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。这比连接两个平齐末端容易的多。 补平成平齐末端补平成平齐末端凸出的凸出的3端端可以通过末端转移酶添加几可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或或TTT等）等）造成人工粘性末端。造成人工粘性末端。凸出的凸出的5末端末端可用可

6、用DNA多核苷酸激多核苷酸激酶进行酶进行32P标记。标记。粘性末端可以用粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐聚合酶补平成平齐末端。末端。识别位点的序列相同的限制性内切酶。识别位点的序列相同的限制性内切酶。 完全同裂酶：完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同。识别位点和切点完全相同。 如如Hind 和和Hsu I。识别位点相同，但切点不同。识别位点相同，但切点不同。 如如Xma I 和和 Sma I。识别的序列不同，但能切出相同的粘性末识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等等 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新同尾酶的粘性末端互相

7、结合后形成的新位点位点一般不能一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。？Sau 3A限制性内切酶的识别和酶切活性一般在限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、一定的温度、离子强度、pH等条件下才等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。表现最佳切割能力和位点的专一性。 如果改变反应条件就会影响酶的专一性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（和切割效率，称为星号（*）活性。）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。所以一般使用专一的反应缓冲液。 星号（星号（*）活性）活性EcoR I和和BamH I等都有等都有*活性。活性。在低盐、高在低盐、高pH（8）时可识别

8、和切割）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoR I：使用的时候要特别注意！使用的时候要特别注意！7在离它的在离它的不对称识别位点不对称识别位点一侧的一侧的特特定距离定距离处切割处切割DNA双链。双链。移动切割（移动切割（shifted cleavage):5 3 在完全肯定的位点切割在完全肯定的位点切割DNA，但反应，但反应需要需要ATP、 Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨腺苷蛋氨酸）。酸）。在基因工程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。特性特性I类内切酶类内切酶II类内切酶类内切酶III类内切酶类内切酶内切酶和甲基内切酶和甲基化酶分开化酶分开单一

9、成分单一成分Mg2+ 回文序列回文序列 （IIs型除外）型除外）位于寄主特位于寄主特异性位点或异性位点或其附近其附近能能不能不能寄主特异性寄主特异性位点位点能能是是十分有用十分有用1973年年H.O Smith和和D. Nathans提议的命提议的命名系统，命名原则如下：名系统，命名原则如下： 1.用用属名属名的第一个字母和的第一个字母和种名种名的头两个字母的头两个字母组成组成3个字母的略语表示个字母的略语表示寄主菌寄主菌的物种名。的物种名。大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）用）用Eco表示；表示； 流感嗜血菌（流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用）

10、用Hin表示。表示。4. 限制酶前面要带上限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上修饰酶前面要带上M（Modification）。）。（现已省略）。（现已省略）。2. 用一个右下标的大写字母表示用一个右下标的大写字母表示菌株或型菌株或型。如如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如（现在都写成平行，如EcoRI）。）。3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。的限制与修复系统，用罗马字母表示。如如EcoR I，EcoR V。DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、醇、SDS、ED

11、TA等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。 1. DNA的纯度的纯度 纯化纯化DNA 加大酶的用量加大酶的用量 延长保温时间延长保温时间 扩大反应体积（扩大反应体积（ 20 l）一般采取一般采取大肠杆菌一般有大肠杆菌一般有两种甲基化酶两种甲基化酶修饰质粒：修饰质粒：dam甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰GATC中的中的A）；）； dcm甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰CCA/TGG的的C）。）。基因工程中必须使用甲基化酶失活基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。突变的菌株。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是大多数是37 oC，少数要求，少数要求4

12、0-65 oC。是影响限制酶活性的重要因素。是影响限制酶活性的重要因素。（1）缓冲液的化学组成）缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl： 提供提供Mg2+ +和离子强度；和离子强度； Tris-HCl： 维持维持pH； 二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。1. 内切酶与识别序列的结合模式内切酶与识别序列的结合模式 1986年年J.A. McClarin等通过等通过X射线晶体射线晶体衍射发现衍射发现II类限制酶是以类限

13、制酶是以同型二聚体同型二聚体的的形式与靶序列结合。形式与靶序列结合。GAATTCCTTAAG内切酶在内切酶在DNA上的上的所有所有识别位点都被切识别位点都被切开。开。12 341234只有有限数量的酶切位点被切开。只有有限数量的酶切位点被切开。 通过缩短保温时间、降低反应温度或减通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。少酶的用量可达到局部消化的目的。12 3414大多数酶可用大多数酶可用65 oC温育温育5分钟失活。分钟失活。 或用或用乙醇乙醇沉淀沉淀DNA。从细菌从细菌DNA环化现象推测，必定存在一环化现象推测，必定存在一种能把两条种能把两条DNA双链连接到一起的酶

14、。双链连接到一起的酶。第第2节节 DNA 连接酶连接酶一、一、DNA连接酶（连接酶（ligase)的发现的发现DNA复制一定有断口。复制一定有断口。（1）大肠杆菌连接酶）大肠杆菌连接酶1. 两种两种DNA连接酶连接酶只能连接只能连接粘性末端粘性末端。（2）T4噬菌体的连接酶噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，不但能连接粘性末端， 还能连接还能连接齐平末端齐平末端。（1）必须是两条）必须是两条双链双链DNA。（2）DNA3端有游离的端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（P）。）。（3）需要）需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中：大肠杆菌中： NAD+

15、+1. ATP（NAD+ +)提供激活的提供激活的AMP。2. ATP与连接酶形成共价与连接酶形成共价“连接酶连接酶-AMP”复复合物，并释放出焦磷酸合物，并释放出焦磷酸PPi。3. AMP与连接酶的与连接酶的赖氨酸赖氨酸 -氨基氨基相连。相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ + +H3NAMPATPPPi4. AMP随后从连接酶的赖氨酸随后从连接酶的赖氨酸 -氨氨基转移到基转移到DNA一条链的一条链的5端端P上，形上，形成成“DNA-腺苷酸腺苷酸”复合物。复合物。-OH HO-P-AMP-OHO-P-AMP5. 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成对磷原子作亲核攻击，形成磷酸

16、二脂键，释放出磷酸二脂键，释放出AMP。连接酶反应的最佳温度是连接酶反应的最佳温度是37 C。1. 最佳温度最佳温度但在但在37下下粘性末端粘性末端的结合很不稳定。的结合很不稳定。2. 实用温度实用温度所以一般采用所以一般采用 416 C。增加插入片段与载体的接触机会，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。减少载体自我连接的现象。1. 插入片段与载体的浓度比例插入片段与载体的浓度比例 2. 反应温度反应温度12.5。1020倍。倍。一般一般1416一、基因工程中常用的一、基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶1.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 2. Klenow fragmen

17、t 3. T7 DNA聚合酶聚合酶 4. T4 DNA聚合酶聚合酶 5. 修饰过的修饰过的T7 DNA聚合酶聚合酶 6. 逆转录酶逆转录酶1. 共同特点共同特点把把dNTPs连续地加到引物的连续地加到引物的3OH端。端。2. 主要区别主要区别T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。而不从模板上掉下来。其它几种其它几种DNA聚合酶只能连续添加聚合酶只能连续添加10多多个个dNTPs就会从模板上解离下来。就会从模板上解离下来。持续合成能力和外切酶活性不同。持续合成能力和外切酶活性不同。1. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I主要用来制备带放射性

18、标记的主要用来制备带放射性标记的DNA探针。探针。（1）大肠杆菌）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 的性质的性质一条一条单链多肽单链多肽。 用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的端的部分。就成为部分。就成为Klenow fragment。 底物：底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ + 带有带有3OH游离端的引物游离端的引物 DNA模板模板（2）DNA聚合酶聚合酶I（Pol I）的反应条件）的反应条件-OH5 3 dNTPs标记标记能够同某种被研究的核酸序列特异能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分性结合的，带有标记的寡

19、聚核酸分子。子。（3）用）用DNA聚合酶聚合酶I 制备探针制备探针已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断显示位置显示位置与互补的待测序列杂交与互补的待测序列杂交标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断5 3 切口转移法切口转移法(nick translation )：a. 放射性同位素标记：放射性同位素标记：DNA聚合酶聚合酶I 同时具备同时具备53外切酶外切酶活活性和性和53的聚合酶的聚合酶活性（以及活性（以及35外外切酶活性）。切酶活性）。53外切酶活性从外切酶活性从DNA切口的切口的

20、下一段下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的的上一段上一段DNA的的3一侧补上一个新的核苷酸。一侧补上一个新的核苷酸。切口切口切口切口5 5 3 3 5 3 5 3 纯化的纯化的DNA片断片断DNase I 制制造单链切口造单链切口DNA Pol I 进进行切口转移行切口转移一种一种 -32P-dNTP和和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 32P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记从头至尾都被标记8具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活外切酶活性。（性。（失去了失去了53外切酶活

21、性外切酶活性）。）。（1）Klenow fragment的性质的性质DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶 3端补平端补平5 5 klenow补平限制性内切酶切后形成的补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端隐蔽端。在在3隐蔽端隐蔽端加上放射性标记的加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途）主要用途3隐蔽末端的隐蔽末端的DNA片断片断Klenow fragment补平补平根据末端的顺序选择根据末端的顺序选择一种一种 -32P-dNTPs末端标记的末端标记的DNA 限制性内切酶切限制性内切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3

22、3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I -32P-dATP -32P-dGTP25oC 1hmRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow5 3 3 5 5 3 引物引物（1） T4 DNA聚合酶的性质聚合酶的性质从从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由中分离纯化。由噬菌体基因噬菌体基因43编码。编码。有有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活外切酶活性（降解单链更快）。性（降解单链更快）。 来源

23、来源 酶活性酶活性当没有当没有dNTP时，时，T4DNA聚合酶行使聚合酶行使35外切酶功能，制造出外切酶功能，制造出3隐蔽端。隐蔽端。如果只有一种如果只有一种dNTP，则降解到该，则降解到该dNTP的位置。的位置。5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶聚合酶无无dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶有有dNTPs5 5 （2） T4 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途标记末端（取代合成法）标记末端（取代合成法）用用35外切酶活性作用于外切酶活性作用于所有末端形式所有末端形式的的3端端（平端、（平端、3隐蔽端、隐蔽端、5隐蔽端）制隐蔽端）制造出造出3隐蔽端。隐蔽端。 再利用它的再利用它的53

24、聚合酶活性补平，并加聚合酶活性补平，并加入放射性标记的入放射性标记的dNTP。 补平隐蔽末端补平隐蔽末端 DNA 3末端标记末端标记酶切中间酶切中间产生两个产生两个末端标记末端标记加入某种加入某种32P-dNTP和和dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶 （35外切）外切）DNA酶切片断酶切片断T4 DNA聚合酶聚合酶 （53聚合）聚合）5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 内切酶切内切酶切无无dNTPs制作简单、制作简单、 高比放射性、高比放射性、 放射自显影效果好。放射自显影效果好。优点：优点：缺点：缺点：半衰期短（半衰期短（32P只有只有14.3天）

25、、天）、 不易保存、不易保存、 对人体有害。对人体有害。 要求在专门实验室操作。要求在专门实验室操作。i）生物素标记：）生物素标记：生物素（生物素（biotin），又称维生素），又称维生素H、辅酶、辅酶R可以与可以与dNTP酰化结合成为生物素酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素生物素-1,4-dATP、生物素、生物素-1,1-dUTP等。等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素连接酶（也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。催化与蛋白质共价结合。纯化的纯化的DNA片断片断DNase I 制制造单链缺口造单链缺口DNA

26、 Pol I 进行进行缺口转移缺口转移生物素生物素-dTTP和和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 生物素生物素-dTTP生物素生物素-dTTP生物素生物素连接臂连接臂光敏基因光敏基因探针序列探针序列探针序列探针序列生物素生物素连接臂连接臂光敏基因光敏基因+光照光照抗生物素蛋白（抗生物素蛋白（avidin）：）：链霉抗生物素蛋白（链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：）：是一种是一种鸡鸡卵清蛋白。卵清蛋白。细菌细菌中中avidin的类似物。的类似物。能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：可以与可以与dNTP连

27、接成地高辛连接成地高辛-dUTP等，参等，参入入DNA合成过程。形成地高辛标记的合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。探针。生物素和地高辛标记的探针都有商品化生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒的试剂盒 (kit)。地高辛的结合物是地高辛的结合物是抗地高辛抗体抗地高辛抗体。常用的两种酶：常用的两种酶：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRPO） 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 （Alkaline Phosphatase, AP）催化一些特殊的反应，反应的过程中催化一些特殊的反应，反应的过程中发出发出荧光荧光（或生成（或生成有色的产物有色的产物）。）。酶的

28、作用：酶的作用：生物素生物素探针序列探针序列待测基因待测基因亲和素亲和素酶酶底物底物中间产物中间产物产物产物发光发光探针探针DNA用用生物素或地高辛生物素或地高辛标记。标记。亲和素或地高辛抗体与亲和素或地高辛抗体与酶酶偶联。偶联。酶酶催化一个催化一个发光或显色反应发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体亲和素或地高辛抗体与与生物素或地高辛结合生物素或地高辛结合。核酸核酸探针探针杂交筛选杂交筛选法的缺点是：法的缺点是：只检测是否有外源只检测是否有外源DNA插入，而不论插入，而不论该该DNA是否表达出是否表达出产物。产物。（1）来源）来源从从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出

29、来的，由两个亚基组成：出来的，由两个亚基组成： T7 T7基因基因5 5编码的大亚基：编码的大亚基：有有53聚合酶和聚合酶和35外切酶活性。外切酶活性。 大肠杆菌编码的小亚基：大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。硫氧还蛋白。 增加大亚基对增加大亚基对模板的亲和性模板的亲和性。（2）T7 DNA聚合酶的特点聚合酶的特点 持续合成能力强持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。互补链。 35外切酶活性高外切酶活性高单链和双链都能降解。单链和双链都能降解。 不受不受DNADNA二级结构的影响二级结构的影响其它其它DNA聚合酶受聚合酶受DNA二级结构的阻碍二级结构

30、的阻碍 进行末端标记进行末端标记 以大分子量以大分子量DNA为模板的合成为模板的合成如如M13 补平隐蔽末端补平隐蔽末端（3）T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途取代合成法标记取代合成法标记3末端。末端。与与T4 DNA聚合酶相同。聚合酶相同。合成合成补平补平3隐蔽末端；隐蔽末端； 水解水解修平修平3突出末端。突出末端。（1）T7DNA聚合酶的化学修饰聚合酶的化学修饰去除去除35外切酶活性，使外切酶活性，使DNA聚聚合能力和聚合速率提高了合能力和聚合速率提高了3倍。倍。（2）修饰后的）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途 DNA测序测序双脱氧法。双脱氧法。 标记标记DNA 3隐蔽末端隐

31、蔽末端 更有效地补平末端更有效地补平末端最普遍使用的是来源于最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母鸟类骨髓母细胞瘤病毒细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）：）：依赖依赖RNA的的DNA聚合酶（聚合酶（RNA指指导的导的DNA聚合酶）。聚合酶）。（1）来源）来源RNA肿瘤病毒。肿瘤病毒。（2）AMV的性质的性质由由 和和 两条多肽链组成。两条多肽链组成。 链链有反转录活性和有反转录活性和 RNaseH活性。活性。RNaseH： 链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。 以以53或或35方向特异地水解方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中

32、的杂交双链中的RNA链链。RNaseHRNA DNARNA DNA 链链RNA-DNA杂交双链中杂交双链中53DNA外外切酶活性。切酶活性。 合成合成cDNA以以oligo dT为引物（与为引物（与mRNA的的polyA尾巴互补结合）。尾巴互补结合）。AAAAATTTTT5 3 mRNA 5 cDNA 合成合成DNA探针探针用随机引物（用随机引物（random primer）或）或oligo dT做引物。做引物。随机引物：随机引物：随机顺序形成的寡聚随机顺序形成的寡聚DNA片断。片断。（理论上它能与各种序列的模板结合）（理论上它能与各种序列的模板结合） RT-PCR用的模板用的模板克隆某个基因

33、时，用其克隆某个基因时，用其mRNA反转录反转录出出cDNA第一链。第一链。一、末端脱氧核苷酸转移酶一、末端脱氧核苷酸转移酶1. 来源来源小牛胸腺。小牛胸腺。2. 组成组成大小两个亚基。大小两个亚基。3. 特性特性（1） 53DNA聚合酶活性聚合酶活性（terminal transferase） 不需要模板不需要模板！ 需要需要3OH、二甲胂酸缓冲液。、二甲胂酸缓冲液。 底物可以是单链底物可以是单链DNA、 是是3OH突出的双链突出的双链DNA、 平末端平末端在在Co2+ +代替代替Mg2+ +下也可以。下也可以。 随机添加的随机添加的dNTPs。 如果只有一种如果只有一种dNTP，就添加上，

34、就添加上同聚物同聚物。DNA 5 3 TTTdTTP ，末端转移酶，末端转移酶（1）同聚物加尾）同聚物加尾给给外源外源DNA片断片断和和载体载体分子分别加上分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。连接。外源外源DNADNA载体载体DNADNA5 3 5 3 CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶末端转移酶（2）再生酶切位点）再生酶切位点便于回收克隆片断。便于回收克隆片断。AAGCTT TTCGAA5 5 Hind酶切酶切A TTCGAAGCTT AKlenow补平补平AAGCT TTCGAAGCTT TCGAAAAGCATTT TTCGA

35、AGCTT TTTTCGAA末端转移酶末端转移酶dTTPAAAAAA外源外源DNA（3）非放射性标记）非放射性标记DNA片断的片断的3端端AAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAAAAAAAAHind位点位点Hind位点位点连接连接催化非放射性标记物参入催化非放射性标记物参入DNA片断的片断的3端。（生物素端。（生物素-11-dUTP等）等）1. 来源来源T4噬菌体的噬菌体的pseT基因编码。基因编码。 从从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2. 功能功能催化催化 磷酸从磷酸从ATP转给双

36、链或单链转给双链或单链DNA或或RNA的的5-OH端。端。不论不论5-OH端突出与否。端突出与否。5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 P-OH5 3 HO-P5 ATPT4多核苷酸激酶多核苷酸激酶如果如果ATP的的 磷酸带有磷酸带有32P标记，就会被转标记，就会被转移到移到DNA的的5端。端。但天然的但天然的DNA的的5端都是磷酸化的。端都是磷酸化的。DNA 5-OH端磷酸化、标记端磷酸化、标记DNA的的5端。端。5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 32P-OH5 3 HO-32P5 ( -32P)ATP多核苷酸激酶多核苷酸激酶3 P-OH5 3 HO-P5 碱性磷酸酶碱性磷酸酶（1）

37、正向反应（）正向反应（forward reaction）（2）交换反应标记法）交换反应标记法反应混合物中具有超量反应混合物中具有超量( -32P)ATP和和ADP时，多核苷酸激酶能催化时，多核苷酸激酶能催化( -32P)ATP的的 -32P与与DNA5端的磷酸端的磷酸交换交换。3 P-OH5 3 HO-P5 3 32P-OH5 3 HO-32P5 ( -32P)ATP、ADP多核苷酸激酶多核苷酸激酶反应效果不理想。反应效果不理想。1. 碱性磷酸酶种类碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。从大肠杆菌中分离出来。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸

38、酶）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶）小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。从小牛肠中纯化出来。具有抗热性。具有抗热性。SDS中加热中加热68oC可完全失活。可完全失活。催化脱掉催化脱掉DNA（或（或RNA）5端的磷酸端的磷酸根。根。3 P-OH5 3 HO-P5 5 3 HO-OH5 3 HO-OH碱性磷酸酶碱性磷酸酶（1）防止线性化的载体份子自我连接）防止线性化的载体份子自我连接单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTT TTCGAAHind酶切酶切A-OH

39、 TTCGA-PP-AGCTT HO-A碱性磷酸酶碱性磷酸酶5 5 5 A-OH TTCGA-OHHO-AGCTT HO-AOH与与OH不能形成磷酸二酯键，所以不不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。能自我连接。但同一酶切后的但同一酶切后的外源外源DNA的的5端有端有P，能与脱磷酸的载体能与脱磷酸的载体OH连接。连接。A TTCGA AGCTT AAGCTTA ATTCGA 连接酶连接酶-OH与与-OH连不住连不住其中每条链上都有一个其中每条链上都有一个nick，但转入细，但转入细菌后会被修复。菌后会被修复。3 P-AGCTTA-OH5 3 HO-ATTCGA-P5 外源外源DNA9是一类从多

40、核苷酸链的一头开始催化是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解降解核苷酸的酶。核苷酸的酶。一、单链一、单链DNA外切酶外切酶1. 大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）53外切外切识别识别5-OH2. 大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶（exo ）53、35外切外切识别识别3-OH、5-P1. 核酸外切酶核酸外切酶（exoexo ）35外切外切识别识别3-OH主要用途：主要用途：在在DNA双链的末端产生出单链区域。双链的末端产生出单链区域。5 5 5 5 exo 与与klenow配合进行配合进行3端标记端标记-OHHO-53外切。外切。主要用途：主要用途：使使DNA双链变成单链（短）。双链变成单链（短）。5 P-P 5 5 5 exo 成为测序模板。成为测序模板。识别识别5-P（但