生化21常用分子生物学技术的原理及应用

1、常用分子生物学技术常用分子生物学技术原理及其应用原理及其应用第第 1 节节分子印迹与杂交技术分子印迹与杂交技术一、核酸分子印迹与杂交技术一、核酸分子印迹与杂交技术核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 把不同来源而具有一定同源性的把不同来源而具有一定同源性的DNA分子放在同分子放在同一溶液中做变性处理一溶液中做变性处理 ，或把单链，或把单链DNA与与RNA放在一放在一起，在一定条件下，它们之间的同源区域可按碱基互起，在一定条件下，它们之间的同源区域可按碱基互补原则复性形成杂合双链补原则复性形成杂合双链(heteroduplex) ，这一过程，这一过

2、程称为杂交。称为杂交。 在杂交之前，通常用琼脂糖凝胶分离待在杂交之前，通常用琼脂糖凝胶分离待测的测的DNA分子，再将分离的分子，再将分离的DNA片段转移到片段转移到特定的支持物上。由于转移后各个特定的支持物上。由于转移后各个DNA片段片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置一在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置一样，故称为印迹（样，故称为印迹（ blotting）。）。 印迹（印迹（ blotting）（一）（一）Southern印迹杂交印迹杂交 Southern印迹杂交（印迹杂交（Southern blotting）是是指指DNA与与DNA分子之间的杂交。其基本过程分子之间的杂交。其基本过程

3、是将琼脂糖凝胶电泳分离的待测是将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性片段变性后，将凝胶中的后，将凝胶中的DNA分子转移到一定的固相支分子转移到一定的固相支持物上，然后用标记的探针检测待测的持物上，然后用标记的探针检测待测的DNA。 探针（探针（probe） 是指经过特殊标记的是指经过特殊标记的已知序列核苷酸片已知序列核苷酸片段段，可以用来检测某一特定核苷酸序列或基，可以用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的因序列的DNA或或RNA片段。片段。 探针的种类探针的种类 寡核苷酸寡核苷酸 基因组基因组DNA cDNA片段片段 RNA片段片段标记物标记物 放射性同位素放射性同位素 生物素生物素 荧光

4、染料荧光染料 Southern印迹杂交的基本步骤印迹杂交的基本步骤 u待测待测DNA样品的限制性内切酶消化样品的限制性内切酶消化 u酶切酶切DNA样品的电泳分离样品的电泳分离 u凝胶中凝胶中DNA的变性和的变性和Southern转移转移 u探针的制备探针的制备 uSouthern杂交杂交 u杂交结果的检测杂交结果的检测 M1 210SSC 转移缓冲液转移缓冲液Whatman滤纸滤纸凝胶凝胶Whatman滤纸滤纸纸巾纸巾玻璃板玻璃板重物重物支持物支持物500g1 2与探针同源杂交的与探针同源杂交的基因基因DNA片段片段基因组基因组DNADNA酶切片段酶切片段内切酶内切酶NC或尼龙膜或尼龙膜NC膜

5、或尼龙膜膜或尼龙膜 基因组基因组DNA的定性与定量分析。的定性与定量分析。 如对在基因组中特异基因的定位及检测等。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。重组质粒和噬菌体的分析。重组质粒和噬菌体的分析。Southert blotting用途用途（二）（二）Northern印迹杂交印迹杂交 利用类似于利用类似于Southern印迹杂交的技术来印迹杂交的技术来检测检测RNA称为称为Northern印迹杂交（印迹杂交（Northern blotting）。）。 Northern印迹杂交基本原理和过程与印迹杂交基本原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子是印迹基本相同，只是检测的分子是R

6、NA，可用来对组织或细胞中的，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定进行定性或定量分析。性或定量分析。 Northern印迹杂交的基本过程印迹杂交的基本过程 相同点：相同点：名称相对于名称相对于Southern blotting转移的是转移的是RNA转移前无需酶切转移前无需酶切转移效率较高转移效率较高变性方法变性方法不同点不同点原理均为毛细作用原理均为毛细作用 Northern blotting 用途用途 检测某一组织或细胞中已知的特异检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA 的表达水平。的表达水平。 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。二、蛋白质印迹技

7、术二、蛋白质印迹技术(Western blotting) 蛋白质印迹技术是根据蛋白质分子之间存在蛋白质印迹技术是根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固体支持物（其转移和固定于固体支持物（NC膜或其它膜）膜或其它膜）上，再用相应的蛋白质分子对其进行检测。最上，再用相应的蛋白质分子对其进行检测。最常用的蛋白质是抗体，因此被称为免疫印迹常用的蛋白质是抗体，因此被称为免疫印迹（immunoblotting）技术。）技术。 首先将混合蛋白质用首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小按分子大小分开，再将蛋白质转移到分开，再将蛋白质

8、转移到NC膜上，蛋白质膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。的位置可保持在胶中的原位上。与与DNA和和RNA印迹相似之处印迹相似之处n蛋白质的转移只有靠电转移蛋白质的转移只有靠电转移n蛋白质的检测以蛋白质的检测以抗体抗体作探针作探针n用碱性磷酸酶（用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，）标记第二抗体，底物显色底物显色来检测来检测蛋白区带的信号，底物亦可与蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂化学发光剂结合以提高敏感度。结合以提高敏感度。n或用同位素标记第二抗体，或用同位素标记第二抗体，放射自显影法放射自显影法检测蛋白区带的信号。检测蛋白区带的信号。与与DN

9、A和和RNA印迹不同之处印迹不同之处Western blotting应用应用 检测样品中的特异蛋白质的存在检测样品中的特异蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的定量分析细胞中特异蛋白质的定量分析 蛋白质分子的相互作用研究蛋白质分子的相互作用研究三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较Western blotting垂直槽垂直槽Northern blotting水平槽水平槽Southern blotting水平槽水平槽第第 2 节节 PCR技术的原理与应用技术的原理与应用（Polymerase Chain Reaction，PCR）聚合酶链反应聚合酶链反应 PCR技术是技术是1985年由美国科学家年由美国

10、科学家Kary B Mullis建立的建立的体外体外扩增基因片段的方法，它扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等易自动化等突出优点突出优点，是分子生物学技术中，是分子生物学技术中一项具有一项具有革命性的创举革命性的创举。 PCR方法被美国方法被美国Science杂志评为杂志评为1989年年的十大科技成就之一，而的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶聚合酶被被评选为象征评选为象征1989年的年的“年分子年分子”(the molecule of year)。5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle

11、 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、一、PCR技术的基本原理技术的基本原理Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万倍以上。万倍以上。n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCR体系基本组成成分体系基本组成成分二、二、PCR技术的主要特点技术的主要特点1.特异性强特异性强 2.灵敏度高灵敏度高 3.简便快速简便快速 4.对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低 2. 采用采用

12、PCR方法获得目的基因方法获得目的基因 引物选择：引物选择：特异引物、随机引物、简并引物特异引物、随机引物、简并引物 1. 采用采用RT-PCR方法扩增目的基因方法扩增目的基因三、三、PCR技术技术的主要用途的主要用途（一）目的基因的扩增与克隆（一）目的基因的扩增与克隆（二）基因的体外定点突变（二）基因的体外定点突变（三）基因突变分析（三）基因突变分析（四）（四） DNA和和RNA的微量分析的微量分析（五）（五） DNA序列测定序列测定三、三、PCR技术技术的主要用途的主要用途 (Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法)HO P O P O P O CH2OOOOHOHOHOA, C, G

13、or T13 OH5 双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸脱去脱去DNA链末端合成终止法链末端合成终止法Sanger 1958年和年和1980年两次获年两次获Nobel奖奖DNA链末端合成终止法链末端合成终止法DNA自动测序自动测序用用荧光替代放射性核素荧光替代放射性核素标记是实现标记是实现DNA序列分序列分析自动化的基础。析自动化的基础。用用不同荧光不同荧光分子标记分子标记4种种ddNTP，然后进行，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。电泳）分离。通过通过4种激光激发不同大小种激光激发不同大小DNA片段上的荧光片段上的荧光分

14、子使之发射出分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。 DNA自动测序结果自动测序结果四、几种重要的四、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术 (RT-PCR)（二）原位（二）原位PCR技术技术 (ISP)（三）实时（三）实时PCR技术技术 (real time PCR)RT-PCR技术技术AAnATTnT 55mRNA反转录酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3DNA poly IcDNA核酸酶S1双链cDNA35 35 5加热变性加入特

15、异性引物DNA聚合酶PCR扩增出大量的产物实时实时PCR技术技术原理原理第第 3 节节转基因技术转基因技术与基因剔除技术与基因剔除技术 是指将外源基因整合到动物细胞或是指将外源基因整合到动物细胞或植物细胞的基因组中并使外源基因在动植物细胞的基因组中并使外源基因在动物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的技术。技术。 基因的导入方式主要：基因的导入方式主要： 显微注射法显微注射法 胚胎干细胞法胚胎干细胞法 逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法 一、一、转基因技术转基因技术 即即体细胞克隆技术体细胞克隆技术，是用显微操作、，是用显微操作、电融合等方法将动物体细胞的细胞核电融

16、合等方法将动物体细胞的细胞核全部导入另一个个体的去除细胞核的全部导入另一个个体的去除细胞核的卵细胞内，使之发育成为个体。卵细胞内，使之发育成为个体。二、核转移技术二、核转移技术 核转移技术可使一个细胞变成一个核转移技术可使一个细胞变成一个个体，这样产生的个体所携带的遗传个体，这样产生的个体所携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质完全一物质与细胞核供体的遗传物质完全一样，是一种无性繁殖的过程，即样，是一种无性繁殖的过程，即克隆克隆(clone)。通过分子生物学的方法定向地敲除动通过分子生物学的方法定向地敲除动物体细胞内的某个基因的技术称为物体细胞内的某个基因的技术称为基因基因剔除剔除 (gene

17、knock-out)或或基因打靶基因打靶 (gene targeting)。三、基因剔除技术三、基因剔除技术四、基因转移和基因剔除在医学中的应用四、基因转移和基因剔除在医学中的应用（一）建立疾病动物模型（一）建立疾病动物模型（二）生物制药（二）生物制药（三）治疗性克隆和生产可用于人体器官（三）治疗性克隆和生产可用于人体器官 移植的动物器官移植的动物器官第第 4 节节 生生 物物 芯芯 片片 技技 术术DNA芯片芯片(DNA chip)、DNA阵列阵列(DNA array)cDNA芯片芯片(cDNA chip) 指将许多特定的指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片段片段作为探针，有规律地紧密

18、排列固定于单位作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。面积的支持物上。一、基因芯片一、基因芯片(gene chip) 将探针与荧光标记的待测样品分子将探针与荧光标记的待测样品分子进行杂交，通过检测系统检测杂交的荧进行杂交，通过检测系统检测杂交的荧光信号和强度，从而获取样品分子的数光信号和强度，从而获取样品分子的数量和序列信息。量和序列信息。 将高度密集排列的蛋白分子作为探将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和白，再经检测系

19、统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片 (protein chip)又称又称蛋白质阵列蛋白质阵列 (protein array)基本原理基本原理： 蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能特异性的相互识别和相互结合。如抗体与抗原特异性的相互识别和相互结合。如抗体与抗原或受体与配体之间的特异性结合。或受体与配体之间的特异性结合。最常用的探针：最常用的探针： 抗体，抗体与抗原结合的特异性最强。抗体，抗体与抗原结合的特异性最强。检测方法：检测方法： 标记检测法、直接检测法标记检测法、直接检测法第第5节节 蛋白质相互作用

20、研究技术蛋白质相互作用研究技术 1989年美国纽约州立大学的年美国纽约州立大学的Fields和和Song首先首先描述了酵母双杂交系统描述了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。 该系统的建立是基于对酵母转录因子该系统的建立是基于对酵母转录因子Gal4分子分子的研究。的研究。转录激活因子转录激活因子DNA结合结构域结合结构域(BD)(DNA binding domain) 转录激活结构域转录激活结构域(AD)(activation domain) 一、酵母双杂交系统一、酵母双杂交系统（一）酵母双杂交系统的基本原理（一）酵母双杂交系统的基本原理N端端C端端 这两个结构域

21、各具功能，互不影响这两个结构域各具功能，互不影响, , 单独存在时没有转录激活的功能，只有单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。特定基因表达的激活因子的功能。（二）酵母双杂交系统的应用（二）酵母双杂交系统的应用1. 分析已知蛋白质之间的相互作用及蛋白质分析已知蛋白质之间的相互作用及蛋白质 的功能结构域的功能结构域2. 筛选和发现新的蛋白质筛选和发现新的蛋白质 3. 筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之 间相互作用的影响间相互作用的影响 4. 绘制蛋白相互作用系统图谱绘制蛋白相互作用系统图谱基因组学与蛋白质组学基因组学与蛋白质组学 基因组学是研究生物体基因组的结基因组学是研究生物体基因组的结构、结构与功能的关系、以及基因之构、结构与功能的关