第十章电泳技术

1、第第 十十 章章电电 泳泳 技技 术术电泳电泳是荷电溶质（电解质）在是荷电溶质（电解质）在电场作用下发生定向泳动的现象。电场作用下发生定向泳动的现象。电泳分离电泳分离则是利用荷电溶质在则是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离电场中泳动速度的差别进行分离的方法。的方法。电泳为生化物质的分离提供了一个有电泳为生化物质的分离提供了一个有效的和多功能的方法。效的和多功能的方法。传统上，各类电泳仅用于常规的生化传统上，各类电泳仅用于常规的生化分析，直至上世纪分析，直至上世纪7070年代以后，各种以分年代以后，各种以分离回收为目的的电泳法发展很快，已达到离回收为目的的电泳法发展很快，已达到一定的分离

2、制备规模。一定的分离制备规模。 与超滤等膜分离法一样，电泳分离中不与超滤等膜分离法一样，电泳分离中不存在相平衡，是一种速度分离法。存在相平衡，是一种速度分离法。但与膜过滤相比，电泳操作的剪切作用但与膜过滤相比，电泳操作的剪切作用较小，可以使蛋白质等生物大分子保持较高较小，可以使蛋白质等生物大分子保持较高的生物活性。的生物活性。分辨率高和能够保持产物的生物活性这分辨率高和能够保持产物的生物活性这两个突出的优点使得电泳技术愈来愈受到人两个突出的优点使得电泳技术愈来愈受到人们的重视。们的重视。 10.1 电泳的理论基础电泳的理论基础当一个带有效电荷当一个带有效电荷Q的质点，在黏的质点，在黏性介质中性

3、介质中(液体或凝胶液体或凝胶)受到电场受到电场(电位电位梯度梯度)E正的作用恒速迁移时，质点在正的作用恒速迁移时，质点在受到一个驱动力受到一个驱动力(其值为其值为QE)的同时还的同时还受到一个与其相平衡的摩擦阻力受到一个与其相平衡的摩擦阻力f。 （10-1）fQE 在自由溶液中，摩擦阻力服从在自由溶液中，摩擦阻力服从Stokes定律：定律： （10-2）式中式中r为质点半径；为质点半径；v为质点的迁移为质点的迁移速度；速度；为介质黏度。为介质黏度。 rvf6合并上述两式，可求得质点合并上述两式，可求得质点的迁移速度的迁移速度v （10-3）rEQv6如果电量如果电量Q按照电子电量按照电子电量e

4、（=1.610-19C）乘上电荷数）乘上电荷数Z来来计算，则上式可写成：计算，则上式可写成： （10-4）reZEv6质点的质点的电泳迁移率电泳迁移率（电泳度）（电泳度）u被定义为在单位电位梯度（被定义为在单位电位梯度（E）的作用下，单位时间内质点所移的作用下，单位时间内质点所移动的距离（动的距离（d）：）： 或或 （10-5）tEdu Evu 所以可以得到所以可以得到 （10-6） 从上述公式可知，电泳迁移率与从上述公式可知，电泳迁移率与带电颗粒的净电荷量成正比，而与带电颗粒的净电荷量成正比，而与颗粒半径和介质黏度成反比。颗粒半径和介质黏度成反比。 rZerQu66对于两种离子型物质对于两种

5、离子型物质A和和B的混的混合物的分离来说。如果它们的迁移合物的分离来说。如果它们的迁移率由实验测得是率由实验测得是uA和和uB，根据迁移，根据迁移率的定义可知：率的定义可知： 和和 dA和和dB分别为各物质在电位梯度分别为各物质在电位梯度E下经过下经过t时间后所移动的距离。时间后所移动的距离。 tEduAAtEduBB由上式可得到：由上式可得到： （10-7） （10-8）上式表明，用实验最终所得的上式表明，用实验最终所得的（dA-dB），来确定），来确定A和和B两种物质两种物质的分离，电泳需要持续的时间的分离，电泳需要持续的时间t。 )(BABAuuEtdd)(BABAuuEddt10.2

6、影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素1颗粒的性质颗粒的性质 颗粒所带净电荷量越大，直径越颗粒所带净电荷量越大，直径越小或其形状越接近于球形，在电场小或其形状越接近于球形，在电场中的迁移率就越大。中的迁移率就越大。2电场强度电场强度 电场强度越高，带电颗粒的迁电场强度越高，带电颗粒的迁移速度越快。移速度越快。 常压电泳控制的电场强度为常压电泳控制的电场强度为2-2-10V/cm10V/cm。3溶液的性质溶液的性质 主要是指电极室缓冲溶液和目标主要是指电极室缓冲溶液和目标产物样品溶液的产物样品溶液的pHpH值、离子强度和黏值、离子强度和黏度等。度等。 溶液的溶液的pH值值 溶液的溶液的pHpH

7、值决定着电解质的解离程值决定着电解质的解离程度和其所带净电荷的量，对于氨基酸或度和其所带净电荷的量，对于氨基酸或蛋白质，溶液的蛋白质，溶液的pHpH值应远离其等电点，值应远离其等电点，使其净电荷量变大，迁移速度加快。使其净电荷量变大，迁移速度加快。 离子强度离子强度 组分的分离取决于缓冲液的离子组分的分离取决于缓冲液的离子强度，如果离子强度高，可获得良好强度，如果离子强度高，可获得良好的分离效果，但是电泳迁移率会降低，的分离效果，但是电泳迁移率会降低，所以溶液的离子强度一般维持在所以溶液的离子强度一般维持在0.050.050.1mo1/L0.1mo1/L范围内。范围内。溶液的黏度溶液的黏度 电

8、泳迁移率与溶液的黏度成反电泳迁移率与溶液的黏度成反比，所以黏度不能过大或过小。比，所以黏度不能过大或过小。4其它因素其它因素 焦耳效应焦耳效应 电泳过程中由于电流会产生热量，电泳过程中由于电流会产生热量，使温度增加。使温度增加。 温度增加，一是使电泳流动性增加，温度增加，一是使电泳流动性增加，二是使支持介质中缓冲液的溶剂蒸发，二是使支持介质中缓冲液的溶剂蒸发，从而促进或延缓电泳迁移，三是溶剂的从而促进或延缓电泳迁移，三是溶剂的损失会引起电解质浓度的增加，离子强损失会引起电解质浓度的增加，离子强度增加和支持介质导电率增加。度增加和支持介质导电率增加。 (2) 电渗电渗 电渗现象是一种在外加电压作

9、电渗现象是一种在外加电压作用下，和固体支持物接触的液体的用下，和固体支持物接触的液体的移动现象。移动现象。如果支持物质带有羧基、磺酸基、羟基如果支持物质带有羧基、磺酸基、羟基等功能团时，在一定的等功能团时，在一定的pHpH值溶液中，它们会值溶液中，它们会电离，使支持物带负电荷，与支持物相接触电离，使支持物带负电荷，与支持物相接触的溶液的溶液( (通常是水通常是水) )带正电荷，在电场的作用带正电荷，在电场的作用下，此溶液层会向负极移动。下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物带上正电荷，与支持物反之，若支持物带上正电荷，与支持物相接触的溶液就带上负电荷，溶液层会向正相接触的溶液就带上负电荷，溶

10、液层会向正极移动。极移动。电渗会对样品的迁移率造成影响。电渗会对样品的迁移率造成影响。如果电渗方向与样品的电泳迁移方向如果电渗方向与样品的电泳迁移方向一致，样品的表观迁移率就加快，如一致，样品的表观迁移率就加快，如果二者的方向不一致，样品的表观迁果二者的方向不一致，样品的表观迁移率就降低。移率就降低。(3) 吸附吸附 支持物吸附溶质，会延缓电泳分离。支持物吸附溶质，会延缓电泳分离。 在某些情况下，如果它们能选择性的在某些情况下，如果它们能选择性的吸附低电泳迁移率的组分，则可以提高吸附低电泳迁移率的组分，则可以提高分离的质量。分离的质量。(4) 分子筛分离分子筛分离 当采用凝胶如淀粉、聚丙烯酰胺

11、、葡聚糖当采用凝胶如淀粉、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶作支持物，在伸展的凝胶中，其空间属于凝胶作支持物，在伸展的凝胶中，其空间属于大分子尺寸，这样就表现出分子筛的效应。大分子尺寸，这样就表现出分子筛的效应。相应地，最小的分子透入凝胶结构中，由相应地，最小的分子透入凝胶结构中，由于它们沿着一条非常曲折且较长的路程移动，于它们沿着一条非常曲折且较长的路程移动，所以迁移被延缓。所以迁移被延缓。根据这一现象，可在样品组分分离时，调根据这一现象，可在样品组分分离时，调整诸如凝胶的聚合程度和浓度，孔的尺寸等因整诸如凝胶的聚合程度和浓度，孔的尺寸等因素，就能得到一个高的分辨率。素，就能得到一个高的分辨率。 (5)

12、 (5) 扩散扩散 扩散会影响分离的分辨率，这扩散会影响分离的分辨率，这是因为扩散可使几个分离的区带相是因为扩散可使几个分离的区带相互重叠。互重叠。(6) 缓冲液的性质缓冲液的性质 分离效果有时取决于所用缓冲液分离效果有时取决于所用缓冲液的性质。的性质。 例如，对于不带电荷的蔗糖可用例如，对于不带电荷的蔗糖可用硼酸缓冲液分离，形成络合的蔗糖硼酸缓冲液分离，形成络合的蔗糖硼酸盐离子。硼酸盐离子。 10.3 电泳的类型电泳的类型在任何电泳设备中，在任何电泳设备中，都有三个意义明确的都有三个意义明确的部件，阴极、阳极和部件，阴极、阳极和实现带电粒子分离的实现带电粒子分离的电泳室。电泳室。根据在电泳室

13、中使用的电解质系根据在电泳室中使用的电解质系统，可以对电泳作如下的分类：统，可以对电泳作如下的分类：自由界面电泳；自由界面电泳；自由溶液中的区带电泳；自由溶液中的区带电泳；在不同支持物上的区带电泳；在不同支持物上的区带电泳；在有机溶剂中的凝胶电泳；在有机溶剂中的凝胶电泳；亲和电泳；亲和电泳；等速电泳；等速电泳；等电聚焦；等电聚焦；免疫电泳。免疫电泳。 一自由界面电泳一自由界面电泳19371937年瑞典科学家年瑞典科学家TiseliusTiselius建立了建立了“移界电泳法移界电泳法(moving boundary EP)”(moving boundary EP)”，成功地将血清蛋白质分成清蛋

14、白、成功地将血清蛋白质分成清蛋白、11、22、和和球蛋白球蛋白5 5个主要成分，由于他个主要成分，由于他的突出贡献，的突出贡献，19481948年荣获诺贝尔奖金。年荣获诺贝尔奖金。在自由界面电泳中，样品被放置在在自由界面电泳中，样品被放置在U U型型电泳管的缓冲溶液中，然后外加电场。电泳管的缓冲溶液中，然后外加电场。 在几种组分的混合物中，由于不同离子在几种组分的混合物中，由于不同离子的电量、大小和形状的不同导致它们在缓冲的电量、大小和形状的不同导致它们在缓冲液中的移动速度不同，结果在整个管子中出液中的移动速度不同，结果在整个管子中出现了不同的分隔界面。现了不同的分隔界面。在一系列的分界范围中

15、，是以组分的浓在一系列的分界范围中，是以组分的浓度变化参差而排列的，这样的浓度梯度可用度变化参差而排列的，这样的浓度梯度可用一个适宜的光学系统进行测量。一个适宜的光学系统进行测量。 通过整个管子的连续量析技术，就可通过整个管子的连续量析技术，就可以确定不同界面的位置、数量以及区域的以确定不同界面的位置、数量以及区域的浓度，因此可用来测量电泳迁移率，进行浓度，因此可用来测量电泳迁移率，进行混合组分的分离和分析等。混合组分的分离和分析等。 自由界面电泳由于仪器装置复杂、价自由界面电泳由于仪器装置复杂、价格昂贵，因此只限于实验室规模操作。格昂贵，因此只限于实验室规模操作。二自由溶液中的区域电泳二自由

16、溶液中的区域电泳1微量电泳微量电泳微量电泳是一种基于单个粒微量电泳是一种基于单个粒子受到电场作用时会移动非常小子受到电场作用时会移动非常小的距离的事实来测量带电粒子迁的距离的事实来测量带电粒子迁移率的高度专业化方法。移率的高度专业化方法。 电泳迁移率可通过电泳迁移率可通过测量一个粒子走过一定测量一个粒子走过一定距离所需的时间来计算距离所需的时间来计算求得。所走的距离可从求得。所走的距离可从显微镜目镜的分度尺上显微镜目镜的分度尺上读出，可调节元件两端读出，可调节元件两端间的电位，使测量时间间的电位，使测量时间控制在控制在1010秒左右。秒左右。2自由流动电泳自由流动电泳 这是一种较大规模的分离带

17、电粒这是一种较大规模的分离带电粒子的方法，与其它电泳方法相比，可子的方法，与其它电泳方法相比，可溶物质的分辨溶物质的分辨( (例如蛋白质例如蛋白质) )非常差，非常差，它在细胞分离操作上的主要优点是能它在细胞分离操作上的主要优点是能很好地保持细胞的存活力。很好地保持细胞的存活力。电泳仪有一个分离槽，电泳仪有一个分离槽，分离的样品被缓冲溶液围分离的样品被缓冲溶液围着，在槽的顶端一小口中着，在槽的顶端一小口中注入样品，随着样品的移注入样品，随着样品的移动，不同的成分分离成单动，不同的成分分离成单个区带按不同的偏斜方向个区带按不同的偏斜方向经过分离槽，如果样品不经过分离槽，如果样品不断地从槽的上端泵

18、入，组断地从槽的上端泵入，组分沿一系列对角线方向移分沿一系列对角线方向移动，可在另一端不同部位动，可在另一端不同部位上收集到被分离的组分。上收集到被分离的组分。 3密度梯度区域电泳密度梯度区域电泳如果区域电泳是在简单缓冲液中如果区域电泳是在简单缓冲液中进行的，由于被分离区域的扩散和进行的，由于被分离区域的扩散和沉降，会发生分辨率的严重下降，沉降，会发生分辨率的严重下降，但利用密度梯度电泳时，这两种因但利用密度梯度电泳时，这两种因素产生的影响会大大降低。素产生的影响会大大降低。 密度梯度区域电泳几乎总是在密度梯度区域电泳几乎总是在垂直柱中进行，典型的蔗糖密度梯垂直柱中进行，典型的蔗糖密度梯度从度

19、从10105050左右，密度梯度越左右，密度梯度越陡斜，阻止对流和样品区带重力沉陡斜，阻止对流和样品区带重力沉降的稳定能力越大，所以，样品承降的稳定能力越大，所以，样品承载能力也越大。载能力也越大。 4葡聚糖凝胶柱上的区域电泳葡聚糖凝胶柱上的区域电泳多数情况下，样品组分被完全排斥在多数情况下，样品组分被完全排斥在葡聚糖凝胶珠体外，因此按大小分级分离葡聚糖凝胶珠体外，因此按大小分级分离没有发生，样品实质上在珠体外的溶剂相没有发生，样品实质上在珠体外的溶剂相中进行自由溶液电泳，葡聚糖凝胶的作用中进行自由溶液电泳，葡聚糖凝胶的作用只是用来阻止对流只是用来阻止对流( (由于缓冲液黏度不增加，由于缓冲液

20、黏度不增加，所以不会减少扩散所以不会减少扩散) ) 。三在不同支持物上的区带电泳三在不同支持物上的区带电泳应用支持介质的电泳称为应用支持介质的电泳称为区带电区带电泳泳，它表示在一个电场的作用下，在，它表示在一个电场的作用下，在某一种支持物上能将一个样品组成彻某一种支持物上能将一个样品组成彻底分离成若干条区带底分离成若干条区带( (组分组分) )的过程。的过程。 根据支持介质不同的分类根据支持介质不同的分类 纸电泳纸电泳( (滤纸、玻璃纤维滤纸、玻璃纤维) )； 醋酸纤维电泳；醋酸纤维电泳； 凝胶电泳凝胶电泳( (琼脂、琼脂糖、淀粉、聚丙烯琼脂、琼脂糖、淀粉、聚丙烯酰胺等酰胺等) )； 粉末电泳

21、粉末电泳( (淀粉、纤维素、葡聚糖凝胶、淀粉、纤维素、葡聚糖凝胶、聚氯乙烯、玻璃等聚氯乙烯、玻璃等) )。电泳槽的分室中充满着缓冲液，目的是保持电泳槽的分室中充满着缓冲液，目的是保持pHpH值在一定范围内，多组分离子性物料样品常值在一定范围内，多组分离子性物料样品常置于分室的中心区内。置于分室的中心区内。在一定的电场作用下，所有系统中的离子按在一定的电场作用下，所有系统中的离子按恒定的速度迁移，实现分离，其效果取决于实恒定的速度迁移，实现分离，其效果取决于实验条件和离子所带电荷的符号和大小。验条件和离子所带电荷的符号和大小。 1滤纸电泳滤纸电泳以滤纸作为带电质点溶液的支持物来以滤纸作为带电质点

22、溶液的支持物来进行的电泳称为进行的电泳称为( (滤滤) )纸电泳纸电泳。在化学成分分离鉴定中，纸电泳常常在化学成分分离鉴定中，纸电泳常常与其他层析方法配合使用以达到预期的效与其他层析方法配合使用以达到预期的效果。它除了用做常规分析方法外，还常用果。它除了用做常规分析方法外，还常用做对物质的带电特性进行试探性摸索。做对物质的带电特性进行试探性摸索。用醋酸纤维素条带或塑料薄膜做支持物来进用醋酸纤维素条带或塑料薄膜做支持物来进行的电泳。行的电泳。醋酸纤维是由纤维素的羟基经乙酰化而成。醋酸纤维是由纤维素的羟基经乙酰化而成。将之溶于丙酮等有机溶剂中，将之溶于丙酮等有机溶剂中， 即可涂布成均一即可涂布成均

23、一细密的微孔薄膜，厚度约以细密的微孔薄膜，厚度约以0.1-0.15mm0.1-0.15mm为宜。为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度而易碎。少应有的机械强度而易碎。目前，国内有醋酸纤维薄膜商品出售。目前，国内有醋酸纤维薄膜商品出售。 2 2醋酸纤维素电泳醋酸纤维素电泳醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有以下优点：醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有以下优点：(1)(1)分离效果好。对蛋白质样品吸附极少，无分离效果好。对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，

24、因而提高了定量测定的精确性。质染色带分离清晰，因而提高了定量测定的精确性。(2)(2)快速省时。由于亲水性较滤纸小，电渗作快速省时。由于亲水性较滤纸小，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳离速度快，电泳时间短，一般电泳45-60min45-60min即可，即可，加上染色、脱色，整个电泳完成仅需加上染色、脱色，整个电泳完成仅需90min90min左右。左右。(3)(3)灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需需2L2L血清，故常用于检测在病理情况下微量异常血清，故常用于检测在

25、病理情况下微量异常蛋白的改变。蛋白的改变。(4)(4)应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等用如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等用醋酸纤维素薄膜电泳能较好地分离。醋酸纤维素薄膜电泳能较好地分离。(5)(5)易保存，易定量。醋酸纤维素薄膜电泳染易保存，易定量。醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价由于醋酸纤维素薄膜电泳

26、操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、廉。目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其他糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其他生物大分子。生物大分子。 3琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳利用环氧丙烷与中性的琼脂糖进利用环氧丙烷与中性的琼脂糖进行聚合可得琼脂糖凝胶。行聚合可得琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶电泳分辨率高，分离琼脂糖凝胶电泳分辨率高，分离速度极快、机械强度大，加上操作条速度极快、机械强度大，加上操作条件方便和装置简单，所以琼脂糖凝胶件方便和装置简单，所以琼脂糖凝胶电泳应用面更广泛。电泳应用面更广泛。 由于凝胶是透明的，因此可与免

27、由于凝胶是透明的，因此可与免疫法技术结合进行免疫电泳和对流免疫法技术结合进行免疫电泳和对流免疫电泳。疫电泳。琼脂糖凝胶不吸收紫外线，给电琼脂糖凝胶不吸收紫外线，给电泳分离核苷酸同系物泳分离核苷酸同系物ATPATP、ADPADP、AMPAMP带带来方便，只要分离完毕，就可直接置来方便，只要分离完毕，就可直接置于紫外光密度扫描仪中定量测定。于紫外光密度扫描仪中定量测定。4淀粉电泳淀粉电泳是以天然淀粉为支持物进行的电泳。是以天然淀粉为支持物进行的电泳。作为天然产品，淀粉的组成是会变化作为天然产品，淀粉的组成是会变化的，直链和支链淀粉可能占有不同的比例，的，直链和支链淀粉可能占有不同的比例，从而影响它

28、的凝胶能力和分辨率。因此，从而影响它的凝胶能力和分辨率。因此，对每批原材料应进行预备实验，以确定淀对每批原材料应进行预备实验，以确定淀粉的最佳浓度。粉的最佳浓度。5聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳是目前以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳是目前分离分子的最好方法。分离分子的最好方法。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂联剂N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺在加速剂和催化剂甲叉双丙烯酰胺在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为以此凝胶为支持物的电泳称为

29、聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳胶电泳( (简称简称PAGE)PAGE)。PAGEPAGE分离是以物质的物理差别、分子大分离是以物质的物理差别、分子大小和净电荷为基础的，即分离除了利用物质小和净电荷为基础的，即分离除了利用物质所带电位的差别外，还具有分子筛的特殊作所带电位的差别外，还具有分子筛的特殊作用，这种性质为分开电泳率很相近的大分子用，这种性质为分开电泳率很相近的大分子提供了简单而有效的方法。提供了简单而有效的方法。 聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：(1)(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。(2)(2)化学性能稳

30、定，与被分离物不发生化学反应。化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。(3)(3)对对pHpH和温度变化较稳定。和温度变化较稳定。(4)(4)几乎无电渗作用，只要丙烯酰胺纯度高，操作条件一致，几乎无电渗作用，只要丙烯酰胺纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。则样品分离重复性好。(5)(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达1010-6-6g g。(6)(6)凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。(7)(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电

31、荷效应为一体，因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳电荷效应为一体，因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。等有更高的分辨率。PAGEPAGE的缺点是聚合反应必须用高的缺点是聚合反应必须用高纯度的试剂在没有空气的情况下进行，纯度的试剂在没有空气的情况下进行，此外丙烯酰胺毒性也很大。此外丙烯酰胺毒性也很大。 PAGEPAGE应用范围广，可用于蛋白质、应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，定量及少量的制备， 还可测定相对还可测定相对分子质量、等电点等。分子质量、等电点等。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的种类很聚丙烯酰胺凝胶电泳的种

32、类很多，有不连续凝胶电泳、制备凝胶多，有不连续凝胶电泳、制备凝胶电泳、电泳、SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳等。聚丙烯酰胺电泳等。 （1）不连续凝胶电泳）不连续凝胶电泳不连续凝胶电泳按支持物不连续凝胶电泳按支持物的形式可分为的形式可分为圆盘电泳圆盘电泳( (柱型柱型) )和和垂直板型电泳垂直板型电泳。所谓不连续是指凝胶的孔所谓不连续是指凝胶的孔大小、缓冲液成分及其大小、缓冲液成分及其pHpH值均值均为不连续的，并在电场中形成为不连续的，并在电场中形成电位梯度的不连续性，这样可电位梯度的不连续性，这样可使样品浓缩成一个极窄的起始使样品浓缩成一个极窄的起始区带以提高分辨率。区带以提高分辨率。 不连续

33、圆盘电泳主不连续圆盘电泳主要特点是在圆柱玻璃要特点是在圆柱玻璃管内有三种不连续的管内有三种不连续的凝胶，大孔径的样品凝胶，大孔径的样品胶、浓缩胶和小孔径胶、浓缩胶和小孔径的分离胶，并通过三的分离胶，并通过三种效应，浓缩效应、种效应，浓缩效应、分子筛效应和电荷效分子筛效应和电荷效应，使物质达到高效应，使物质达到高效的分离。的分离。 （2）制备凝胶电泳）制备凝胶电泳制备凝胶电泳有两种方法：制备凝胶电泳有两种方法：第一种方法，电泳在常规方法下操第一种方法，电泳在常规方法下操作，待凝胶上需分离组分分开后，分段作，待凝胶上需分离组分分开后，分段切开并萃取物质；切开并萃取物质；第二种方法，被分离组分在整个

34、凝第二种方法，被分离组分在整个凝胶柱上移动使分离区带从凝胶管下端流胶柱上移动使分离区带从凝胶管下端流出，同时用连续的冲洗缓冲液从外侧将出，同时用连续的冲洗缓冲液从外侧将各分离区带洗脱到分部收集器中。各分离区带洗脱到分部收集器中。（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其聚丙烯酰胺凝胶电泳，其主要用途是分离蛋白质和测定它的主要用途是分离蛋白质和测定它的相对分子质量。相对分子质量。 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理是阴离子去聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理是阴离子去污剂污剂SDSSDS（十二烷基磺酸钠）能以一定比例和蛋（十二烷基磺酸钠）能以一定比例和蛋

35、白质结合并使蛋白质分子带有大量的负电荷，白质结合并使蛋白质分子带有大量的负电荷，大大超过其原来所带电荷，从而使各天然蛋白大大超过其原来所带电荷，从而使各天然蛋白质分子间的电荷差别下降乃至消除。质分子间的电荷差别下降乃至消除。同时蛋白质的结构也在同时蛋白质的结构也在SDSSDS作用下变得松散，作用下变得松散，形状趋于一致，排除了电泳过程中电荷的影响，形状趋于一致，排除了电泳过程中电荷的影响，使使SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，蛋白质迁移率聚丙烯酰胺凝胶电泳时，蛋白质迁移率的差异仅是相对分子质量的函数。的差异仅是相对分子质量的函数。 （10-9） 式中式中M为相对分子质量；为相对分子质量；A为为常数；常数；K为斜率；为斜率；Rm为迁移率。为迁移率。mKRAMlg由于蛋白质结合由于蛋白质结合SDSSDS的量与蛋白质的的量与蛋白质的种类有关，并受溶液种类有关，并受溶液pHpH值、离子强度和值、离子强度和缓冲液组分的影响，这些因素使相对分缓冲液组分的