进入实验室重点学习问题

1、1、 什么是HLA？ 主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）编码的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA），是 不同个体间 进行 器官 或 组织、细胞移植 时发生排斥反应的主要成分，这种代表个体特异性的同种抗原又称组织相容性抗原(histocompatibility)或移植抗原(transplantation antigen)。 2、 什么是 HLA 抗体？供者特异性的HLA抗体3、 为什么要检测HLA抗体？ 抗体检测是移植前或者移植后检测受者体内是否有供者特异性的HLA抗体，如果有那么预示着一旦移植

2、受者体内会产生排异的反应，为临床抗排异治疗提供帮助。（检测患者体内 HLA 抗体水平，确认是否具有供者特异性抗体，直接从HLA 抗体层面评估术后排异风险）4、 为什么要做HLA配型？ ？国内外大量的临床研究结果表明，受者和供者之间HLA相容程度越高，也就是受者和供者之间HLA-A、B、DR六个抗原中相同的抗原数越多，排斥反应的发生率就越低，移植成功率和移植器官长期存活率就越高。反之，就越容易发生排斥反应，从而降低移植成功率和移植物存活率。？（根据供、患者 HLA 基因分型的结果，选择与受者HLA基因型匹配的供者，间接评估 HLA 供者特异性抗体导致的排异风险）5、 LMX 试剂的英文全称是什么

3、？为什么要做这个检测？试剂的规格是什么？ LIFECODES LifeScreen Deluxe（初筛）用于筛查是否有HLA抗体，以及筛查阳性样本中 HLA 抗体的确定。（3） 6、 LSA 试剂的英文全称是什么？为什么要做这个检测？试剂的规格是什么？（1）LIFECODES Single Antigen (LSA), Class I and Class II（2）设计等位基因水平重组的 I 类和 II 类特异性抗原，用于确定特异的 HLA 抗体。（3）7、 LMX、LSA 的试剂组成是什么？ 试剂盒组成-Positive Control Serum （阳性对照血清）-Negative Con

4、trol Serum （阴性对照血清）-Wash Buffer 1x （洗液）-Anti-IgG PE 10x （偶联PE的二抗）-Anitgen Containing Bead Set （包被抗原的检测珠）8、 如果要LIFECODES 的HLA 抗体检测试剂开展实验，都需要什么设备才能开展？ 需要辅助试剂和耗材是什么？ 试剂盒： 微珠、WB、阴阳性对照血清、二抗9、 使用LMX、LSA检测HLA抗体，需要多长时间？10、 LIFECODES SSO Typing Kit 是什么试剂？做什么使用？LIFECODES Rapid SSO Typing kits（中低分辨率分型试剂/有高分辨分型

5、试剂）LIFECODES SSO产品应用1.用于器官（肾、胰腺、心脏、肺等）移植前HLA I类和II类的基因分型检测2.疾病关联分析3.群体遗传研究分析4.药物过敏研究11、 LIFECODES SSO Typing Kit 试剂的规格是什么？SA-PER-PhycoerythrinConjugatedStreptavidin（SA-PE），1mg/ml(LIFECODESCatNo.628511)PCR反应管0.2ml8联管（LIFECODESCat.No.888640，CostarCat.No.6542）杂交板0.2ml96孔板（LIFECODESCat.No.888630，CostarC

6、at.No.650912、LIFECODES SSO Typing Kit 这个试剂盒的检测流程是什么？检测需要多长时间？ （1）扩增：只需将DNA和Taq酶加入 master mix杂交：不需洗板Luminex 收集数据Match IT!DNA 数据分析检测报告（2）13、HLA基因分型有几种方法？这几种方法有什么区别？（包括检测时间、所需要设备、操作流程、结果分辨率等等）一、OLERUP SSP Typing kits 低分辨率分型试剂 有高分辨分型试剂检测时间：操作简便，扩增时间1.5小时，适用少量样本的快速分型所需要设备：ABI9600/9700、朗基、伯乐等试剂盒组成：96孔扩增板（

7、引物包被于管底）、MasterMix、封板膜、读板纸操作流程：DNA提取PCR扩增扩增产物电泳数据分析检测报告 SSP高分特点优点1.快速，操作简便。2.有时可以分辨其它基因分型方法甚至是SBT方法出现的模棱两可结果。缺点高分辨SSP试剂因孔多出错的机率更多，并且同组等位基因间的差异有时仅差一条带型，在任何操作环节出问题均会导致结果不准确，因此要求的扩增反应条件更严格、更精确产品应用：1.移植诊断（HLA配型，临床多用于初筛。） 2.HLA与移植免疫相关的疾病或特殊疾病的研究 3.特定区域HLA多态性分布的研究本产品配备功能强大的SCORE软件，为实验人员提供可靠的分型结果结果分辨率：低分辨率

8、分型试剂 有高分辨分型试剂二、LIFECODES Rapid SSO Typing kits样本要求： 1.血液样本： 非肝素抗凝血，放化疗前后7天内不得采血，白细胞数1*109个/L。2.DNA要求： 浓度：30-100ng/ul 纯度：OD260/280=1.6-2.0？检测时间：？所需要设备：PCR仪器（非下列的PCR不建议使用）SA-PE ，PCR 反应管杂交板操作流程：扩增：只需将DNA和Taq酶加入 master mix杂交：不需洗板Luminex 收集数据Match IT!DNA 数据分析检测报告？结果分辨率： 中低分辨率分型试剂 有高分辨分型试剂产品特点：1多聚酶链反应序列特异

9、性寡聚核苷酸探针(PCR-sequence-specific oligonucleotide probes, PCR-SSOP)2 独特的探针设计最大程度上减少模棱两可结果的产生。3 试剂盒中Master Mix 包含了Primer，dNTPs 和 PCR Buffer，简化了操作步骤，减少了实验耗材。省略了离心和洗涤步骤，减少加样错误产生的机会；分析软件可以自动导入。4 Luminex 输出的原始数据。该产品系列的分辨率比传统的SSO有显著的提高，并有中国CWD的标识功能，在CWD过滤条件下，可以达到30% 以上的高分辨率结果三、GENDX SBT Typing kits 1.SBT Typ

10、ing kits（一代测序） 高分辨率分型试剂，存在等位基因模棱两可的情况。样本要求1.血液样本： 非肝素抗凝血，放化疗前后7天内不得采血，白细胞数1*109个/L。2.DNA要求： 浓度：15-30ng/ul 纯度：OD260/280=1.6-2.0SBT的全称是Sequencing Based Typing，通过PCR扩增目的基因片段，再进行核酸序列测定，从而判断HLA等位基因的方法。检测时间：整个检测流程需 要4-5个工作日所需要设备：操作流程：DNA提取 PCR扩增扩增产物酶切纯化测序反应 测序产物纯化上机数据分析，检测报告结果分辨率：产品特点：产品特点1.各相关外显子均在单孔内PCR

11、扩增。2.组特异性引物，可解决模棱两可等位基因。3.可确定新等位基因、罕见型等位基因等。4.涵盖当前WHO已公布的HLA I类、II类全部等位基因。5.操作简单，通量高。6.扩增测序引物均是干粉，方便保存及运输产品应用1.可用于中华骨髓库高分辨分型2.可用于临床移植的高分辨分型3.适用于HLA科研项目及研究遗传变异4.可用于与移植免疫相关的疾病或特殊疾病的研究 HLA-B*27， HLA-B*57:01，HLA-B*58:012.NGS Typing kits（二代测序）高分辨率分型试剂，全基因测序，近100%高分。检测时间：实验操作时间:1-2小时所需要设备：操作流程：扩增目标基因目标基因片

12、断降解末端连接Adaptor二次单克隆扩增序列分析数据分析结果分辨率：产品特点：所谓下一代测序方法, （Next-GenerationSequencing ）是相对于一代测序Sanger法而言，包括大量基于不同技术的方法. 尽管从模板文库制备、片段扩增到测序, 这些方法所采用的技术与生物化学相当多样, 但是都采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术阵列上的 DNA 样本可以被同时并行分析. 此外, 测序是利用 DNA 聚合酶或连接酶以及引物对模板进行一系列的延伸, 通过显微设备观察并记录连续测序循环中的光学信号实现的。在一般性描述中, 下一代测序技术的几个关键特点是显而易见的: 第一, 通过有序或

13、者无序的阵列配置可以实现大规模的并行化, 以提供高程度的信息密度. 理论上, 只有光的衍射极限会限制并行化的提高(即用来检测独立光学事件的半波长). 这极大地提高了总的测序数据产出通量; 第二, 不采用电泳,设备易于微型化. 相对于第 1 代测序技术, 样本和试剂的消耗量得以降低.检测通量大，384tests/次，可广泛应用于骨髓库 测序平台 方法 测序长度 通量一代测序 3130/3130XL、 Sanger法 1000bp 低 3500、3730/3730XL 二代测序 Roche 454 焦磷酸测序 400bp 较高Illumina Hiseq/Miseq 边合成边测序 2*250bp

14、高 14、HLA 抗体检测的试剂有几种？这几种试剂之间的区别和联系是什么？15、为什么要进行KIR检测？KIR检测的方法？使用的试剂？操作流程？检测时间？ (1)移植物中的造血干细胞中的NK细胞表面上的KIR抑制性受体与患者病理性的白细胞抗原结合，并发生错配的话，造血干细胞分化出来的NK细胞可以辅助的杀伤患者体内的白细胞。 （1）KIR基因检测的目的主要是看供者细胞对于患者肿瘤细胞的杀伤作用，从而从另一方面确定更优的供者选择。所使用试剂来自于immucor公司。 （2）KIR检测的方法一：LIFECODES KIR SSO Typing Kit 二：Olerup SSP KIR Genotyp

15、ing （3）使用试剂一：LIFECODES KIR SSO Typing Kit 规格：20 Test /盒 （实际可以做40test）试剂盒成分： K1 Master Mix （K1 扩增反应体系）- K2 Master Mix （K2 扩增反应体系） - Probe Mix （杂交反应珠）- Dilution Solution （稀释液）非试剂盒提供：- SA-PER-Phycoerythrin Conjugated Streptavidin（SA-PE）1mg/mL- PCR 反应管0.2 mL 8联管- 杂交板0.2 mL 96孔板 必须设备： LuminexPCR仪器（非下列的PC

16、R不建议使用）名称 模式（速率）GenAmp PCR System 9700 9600 mode (3.5/sec)VeritiTM 96-Well Thermal Cycler 9700 MAX mode (3.9/sec)Eppendorf Mastercycler Nexus SAFE mode，MAX ramp (3.0/sec)Bio-Red C1000 TouchThermal Cycler 双48孔快速模块 MAX mode (4.0/sec)LangenMG96+ 标准模式 (2.0 3.0/sec)LangenA100 标准模式 （5.0/sec）环境要求1、要求必须区分前区

17、和后区，前区用于制备扩增反应体系，后区用于扩增产物实验区。2、后区、PCR反应室以及Luminex仪器室室内温度要求恒定，2226之间，不可过高不可过低。3、要求前区有通风橱向室外排风，或者有可保持与外界通风效果良好的窗户等。4、实验室要整洁、独立，不可与其它血液以及核酸实验有明显交叉。二：Olerup SSP KIR Genotyping Olerup KIR 分型试剂规格：12 Test /盒试剂盒成分： Master Mix （扩增反应体系） PCR 反应板 （每孔预装反应引物） 封板膜- 说明书 Worksheet 非试剂盒提供：Taq 酶。 必须设备：电泳系统+凝胶成像PCR仪器（不

18、局限于以下系列）名称 模式（速率）GenAmp PCR System 9700 9600 mode (3.5/sec)VeritiTM 96-Well Thermal Cycler 9700 MAX mode (3.9/sec)Eppendorf Mastercycler Nexus SAFE mode，MAX ramp (3.0/sec)Bio-Red C1000 TouchThermal Cycler 双48孔快速模块 MAX mode (4.0/sec)LangenMG96+ 标准模式 (2.0 3.0/sec)LangenA100 标准模式 （5.0/sec） 环境要求： 要求区分前区

19、和后区，前区用于制备扩增反应体系，后区用于扩增产物电泳检验。（3/4）操作流程：一：LIFECODES KIR SSO Typing Kit 检测步骤：步骤一：扩增 只需将DNA和Taq酶加入 master mix 2.5h步骤二：杂交 不需洗板 20min步骤三：Luminex 收集数据 30s / 孔二：Olerup SSP KIR Genotyping 检测步骤：步骤一：扩增 只需将DNA和Taq酶加入 master mix 1.5h步骤二：电泳 20min步骤三：软件或读板纸 分析结果 16、STR是检测什么？微嵌合是检测什么？（1）微卫星DNA又称短串联重复序列(STR) 、简单重复序列(SSR)，指DNA基因组中小于10