蛋白质组期末复习汇总

1、基因组，Genome，一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列，包括全套基因和间隔序列。基因组学（genomics），研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。蛋白质组 (proteome)：一个基因组(genome)内所有基因所表达的全部蛋白质。蛋白质组学 (proteomics):研究与基因组相对应的蛋白质组的学科，是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。有三项科学进展促进了蛋白质组学的诞生，改变了生物学研究的前景。(1) 在20世纪90年代，基因、表达序列标签 (EST) 和蛋白质序列数据库的发展；这些生物体的部分或全部序列信息，是非常重要的信息库，在许多情况下，我们都可以

2、免费获取，是我们最终从中获取对生物体系理解的信息库。(2) 引入易于操作的、基于浏览的生物信息学工具；利用这些工具可以从上述数据库中获取信息，现在可以在几秒钟内从完整的基因组内搜索到特定的核酸或蛋白质序列，从而可以使得我们通过电脑检测基因和基因产物的结构与功能，探索生命科学的奥妙。(3) 寡核苷酸阵列(microarray)。微阵含有一系列基因专一性寡核苷酸或cDNA序列，这些序列都有特定的方式结合在一块玻片或芯片上。我们可以将感兴趣的样品的DNA混合物荧光标记后与微阵（列）进行杂交，一次可探测几千个基因的表达，一个微阵可以代替几千个Northern blotting分析，可在做一次North

3、ern blotting的时间内完成。（通过使用双色荧光探针）蛋白质组学的研究特点：1. 同一性与多样性2. 有限与无限3. 静态与动态4. 时间与空间5. 孤立行为与相互作用6. 单一手段和多种技术7. 互补与互助1. 同一性与多样性同一性：在不同发育阶段，在不同种类组织或器官的细胞里，基因组也都是一样的；多样性：由于蛋白质是生物体生命活动的主要执行者，因此，对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的活动状态下，蛋白质组的构成就不同。2. 有限与无限有限：对一个生物体而言，其基因组中的核苷酸数量是确定的，无论是简单的生物体，还是复杂的生物体，都是一样的。无限：蛋白质的种类有多少则很难说得清，蛋白

4、质组中的的数量将远远大于基因组中的基因数量。，对于基因组中核酸序列的测定（基因研究）是有限的，而对于蛋白质组中的蛋白质种类的确定则是一种相对“无限的工作”。3. 静态与动态静态：一个生物体从出生到死亡，其基因组几乎都始终保持不变（凋亡、衰老除外），因而可以认为是静态的。动态：蛋白质组中的蛋白质的构成也是在不断地变化着。为便于说明，把生命活动中的蛋白质可大致分为两类： 比较稳定的：如负责各种结构组成的蛋白质； 变 化 的：随细胞的生命活动和状态发生量或质的变化的蛋白质，如负责信号转导或细胞活动调控的蛋白质。4. 时间与空间基因组：DNA通常位于核内，且保持稳定，因而我们在测定DNA序列时是不受时

5、空影响的。蛋白质组：蛋白质组研究中，不仅要考虑时间因素，还需考虑空间因素，这是因为：(1) 不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，其功能与空间定位密切相关；要完全了解蛋白质的功能，就必须要知道蛋白质所处的空间位置。(2) 许多蛋白质在细胞里不是静止不动的，他们在细胞里通常通过在不同的亚细胞环境里的运动发挥作用，如在细胞的信号转导和转录调控也常依赖于蛋白质在空间位置的变化和运动。5. 孤立行为与相互作用孤立行为：在基因组中基因表达的各种mRNA是彼此孤立的，互不干扰。相互作用：蛋白质则正好相反，彼此间存在着广泛的相互作用，蛋白质的功能的实现离不开蛋白质与蛋白质或蛋白质与其他的生物大分子之间的相互作用

6、，6. 单一手段和多种技术单一手段: 由于基因组的均一性和简单性，使得使用一种单一的技术（DNA测序）就能够胜任基因组研究任务；多种技术: 在蛋白质组研究中，所需技术就远远不止一种，并且技术难度也远大于基因组研究技术。蛋白质组研究技术可简单地分为三大类：(1) 蛋白质组的分级分离技术; (2) 蛋白质鉴定技术; (3) 数据库技术及其分析软件的使用7. 互补与互助蛋白质组学研究与基因组学研究互相补充又互相帮助；通过蛋白质组分析，可减低基因注释中的出错率，推测和确定ORF的全长；通过基因组分析，可预测未知蛋白，从而为细胞功能研究打下基础；双杂交技术、phage-display技术等是以基因组数据

7、和技术为基础；在MS测定蛋白质中，离不开对已知基因组中的基因数据的比较。蛋白质组分析流程蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。2-DE 技术是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。双向凝胶电泳(2D-PAGE)双向凝胶电泳的基本原理:先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。第一向进行等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性，根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的p

8、H 梯度介质区域内。第二向是将在 IPG 胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到 SDS-PAGE凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量 (MW) 大小与第一向相垂直的分离。沿垂直的方向进行 SDS-PAGE 电泳，按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。样品制备:基本遵循以下6条原则：(1) 样品缓冲液中离子浓度的控制；(2) 溶解包括疏水蛋白在内的所有蛋白质，且制备方法应具可重现性；(3) 防止聚焦过程中已溶解蛋白质的聚焦和析出；(4) 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）；(5) 去除或完全降解核酸及其他干扰分子；(6) 尽

9、量去除高丰度或不相关的蛋白质，提高低丰度蛋白的浓度，使其达到检测要求。样品的溶解样品的溶解是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一，溶解的目标：(1) 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；(2) 溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；(3) 溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。增加样品溶解性的手段(1) 变性剂(2) 表面活性剂(3) 还原剂(4) 起载体作用的两性电解质样品中核酸的去除:对电泳的影响：增加样品粘度、

10、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质 (SCA) 同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。双向凝胶电泳技术流程IPG重泡涨及样品加样第一向等电聚焦第二向SDS-PAGE检测问题及解决办法质谱法 (mass spectrometry, MS)：是在高真空系统中将样品分子离解成带电的离子，并通过对生成离子的质量和强度的测定，而进行样品成分和结构分析的方法。 质谱学 (mass spectroscopy)：研究质谱法及样品在质谱测定中的电离方式、鉴别规律以及质谱图特征的科学称为质谱学。MS系统质谱分析

11、方法就是将待测样品在离子源中转化为离子，利用离子在电磁场中运动的性质，将其按质荷比 (m/e) 大小排列出质谱图，然后通过对质谱图的解释对其进行定性、定量分析。这样的分析仪器就称为质谱仪。系统：进样系统进样系统亦称为样品导入系统，是能把样品转化成被质谱仪分析的装置。离子源/离子化系统把样品分子或原子电离成离子（正离子或负离子，常为正离子），并能将这些离子聚焦成一定几何形状和一定能量的离子束的装置。质量分析器 (mass analyzer)质量分析器或质量分离/分析系统是将离子源加速出来的不同质荷比的离子进行单一分离，并实现同质荷比(m/e)离子良好聚焦的装置。检测器/离子检测系统其作用是接受、

12、检测质量分析器分离后的不同m/e比的离子束。有三种不同类型的检测器。MS的特点：(1) 应用范围广(2) 灵敏度高，样品用量少(3) 分析速度快MS用途：(1) 测定相对分子质量由高分辨质谱获得分子离子峰的质量数，可测出精确的相对分子质量。(2) 鉴定化合物如果事先可估计出样品的结构，用同一装置、同样操作条件测定标准样品及未知样品，比较其谱图即可进行定性鉴定。(3) 推测未知物的结构从分子离子和碎片离子获得的信息可推测分子结构。(4) 推测分子中Cl、Br等的原子数同位素含量比较多的元素(Cl、Br et al.)，可通过同位素强度及其分布特征推算出这些原子的数目。(5) 色-质联用，可用于多

13、组分的定性和定量采用“选择离子检测(selected ion-monitoring, SIM)”技术可获得非常高的灵敏度和选择性，是目前痕量有机分析最有效的手段之一。质谱技术为什么要迟至20世纪80年代才进入生物大分子领域呢？阻碍质谱技术进入生物大分子领域的主要障碍是当时采用的电子轰击 (electron impact, EI) 离子化装置的电离能量太强，而生物大分子的结构复杂且热不稳定，EI不适于生物大分子分析。直到20世纪80年代，电喷雾离子化和基质辅助激光解吸离子化技术的出现才使质谱技术真正进入生物大分子领域，物质谱的软电离方式：电喷雾离子化(electrospray ionizatio

14、n, ESI) ESI是一种软电离方式，它是在“离子蒸发”的原理基础上发展起来的一种离子化方法。离子蒸发是指离子从液相发射到气相的过程。待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口，在喷口高电压作用下，形成带电荷的微滴，随着微滴中的挥发性溶剂的蒸发，微滴表面的电荷密度随半径减少而增加，当达到某一临界点后，样品将以离子方式从液滴表面蒸发，进入气相，这一过程即实现了样品的离子化。由于没有直接的外界能量作用于样品分子，因而这种方式对分子结构破坏较少，是一种典型的“软电离”方式基质辅助激光解吸离子化 (matrix-assisted laser desorption ionization, MA

15、LDI)MALDI是将样品分子均匀地包埋在固体基质中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，并携带部分样品分子进入气相，然后将一部分能量传递给样品分子，最后使其离子化。 MALDI的最大特点是：离子电荷通常为1个或2个，而不像ESI为多电荷。对于分子量较大的样品而言不会形成复杂的多电荷图，因而对图谱的解析就比较清楚。 由于MALDI的进样是固相方式，不像ESI的液相进样方式容易受到溶液性质的影响，因而对杂质的耐性较好。由于通常在制备生物样品时，往往会在生物样品中引入一些缓冲液或去垢剂（如尿素、SDS等），这时采用MALDI会有较好的结果。(3) ESI和MALDI的比较 离子化方式可在线联用的方式离子

16、电荷形式 对杂质容忍程度ESI 液相 多电荷 直接进样时差MALDI 固相 一般为1或2个电荷 较好串联质谱(tandem MS, MS/MS) 串联质谱是指将多个质谱分析仪相连，分离母离子进行碰撞解离，并检测子离子。碰撞诱导解离 (collision induced dissociation, CID) CID仅指离子解离成碎片的过程。染色法 (1) 传统染色法考马斯亮蓝染色（考染）和银染法。考染的优点是较灵敏、可以达g级检测水平、具线性动力学范围、非常适合定量、易于使用并且与MS兼容性非常好；缺点是g级检测水平使其无法检测一些低丰度蛋白质，这也成为蛋白质组学的研究瓶颈。银染的优点是比考染灵

17、敏约100倍，检测限度可达到ng级水平，得到广泛应用；缺点是其并非完全符合线性动力学（仅在100150ng范围内符合），从而导致蛋白质差异显示的准确性不够，给后续分析及鉴定带来一定的困难；另外，在实际操作中使用的Ag及戊二醛影响胶内蛋白质的酶解，降低了蛋白质质谱分析的氨基酸序列覆盖率。现在发展了改进的无戊二醛银染法和H2O2脱色法，提高了银染成功率，降低了不利因素带来的影响。(2) 荧光染色法优点：染色多种多样，灵敏度高（与银染相同），克服了银染的一些缺点。染料与蛋白质共价结合，减少了对酶解及质谱分析的影响，极大地提高了氨基酸的序列覆盖率，同时具有较宽广的线性动力学范围 (22,000ng)，

18、这使得低丰度蛋白质的检测和蛋白质的精确定量更为准确、简便。 缺点：需要使用昂贵的仪器、试剂，这延缓了推广速度。肽质量指纹图谱 (peptide mass fingerprint, PMF) 每个蛋白质经过酶解后成为长短不一的肽段，同一时间获取所有肽段分子质量而形成一个肽段分子质量图谱，这一图谱对蛋白质反应是专一而特异的，因此称为PMF。蛋白质定量分析策略当前蛋白质组研究中比较成熟和可信的定量策略与方法主要有两种，一是基于双向凝胶电泳技术的染料染色法，二是基于质谱检测技术的化学标记法；不过，新的研究方法也在不断涌现，如近年发展起来的利用质谱数据进行的无标记定量方法等。不同染色方法的比较表1 不同

19、染色方法的比较染色方法 灵敏度(pg) 线性范围 与质谱兼容性 试剂耗费 对软硬件要求考马斯亮蓝染色105 g + + +银染 200 100-150 ng + + + 荧光染色400 2-2000 ng + + +荧光标记250 2-2000 ng + + +化学标记定量法以质谱检测技术为基础的化学标记定量方法有多种，归纳起来主要有两类，一种是体内标记，另一种是体外标记。体内标记细胞在含稳定性同位素的介质中生长，稳定性同位素被结合进蛋白质，从而充当了蛋白质定量的内部标准。15N体内代谢标记用富含15N的介质来培养酵母、细菌或哺乳动物细胞，15N被掺入合成的蛋白质中，从而充当定量的内部标准，这

20、是一种普遍标记的方法。对必需氨基酸进行稳定性同位素标记的体内标记法(SILAC)通过体内标记进行定量蛋白质分析还有一种策略就是在培养介质中加入稳定性同位素标记的必需氨基酸，这主要用于对高等动物细胞中蛋白质的定量以及鉴定。体内标记方法的优缺点相对于体外标记，体内标记方法具有一定的优势，主要表现在：它省去了标记化学反应和分离纯化等步骤，减少了样品的损失，有利于对低丰度蛋白质的高灵敏度检测。但是，体内标记也存在一些缺点，表现在： 它不能对组织来源的蛋白质进行分析； 培养细胞在富含稳定性同位素的介质中生长，这些介质可能会参与细胞的繁殖和其他生物进程，由此改变蛋白质的表达水平； 这种方法受到同位素材料成

21、本的限制，不太可能对整个动物体进行标记； 对于未知序列的肽段，大多数的体内标记方法都无法确定标记物与肽段之间量的关系，从而使得我们难以确认同一肽段在质谱图上成对出现的不同同位素的标记形式。体外标记 【-NH2、-COOH、-SH】氨基 (-NH2) 标记在肽段的N-端和Lys残基的侧链上都有-NH2基团，容易跟含有酰(xin)氧基的分子（如琥珀酸酐、N-乙酰氧琥珀酰亚胺等）发生酰基化反应，从而对肽段进行标记。羧基 (-COOH) 标记肽段的C-端和肽链上的天冬氨酸 (Asp) 和谷氨酸 (Glu) 残基侧链上的羧基 (-COOH) 也可以用于标记，这种标记方法主要通过两条路线来完成。巯基 (-

22、SH) 标记策略 (ICAT)在组成蛋白质的所有氨基酸残基中，没有哪一个能比半胱氨酸 (Cys) 残基上的-SH基团更具有标记反应的特异性。ICAT标记方法的步骤:1. 将来自一种状态下的细胞的蛋白质混合物分离纯化后用D0试剂标记蛋白质侧链上的Cys残基；将来自另一状态下的同种细胞的蛋白质混合物分离纯化后用D8试剂标记；2. 将两种样品混合在一起，用trypsin酶切，产生多肽片段，包括标记的和未标记的；3. 样品经SCX-RPLC两维色谱分离，除去消化酶、去垢剂、还原剂和ICAT试剂；4. 混合物经过抗生物素和色谱柱分离，得到只含有同位素标记的多肽混合物；5. 将分离得到的标记多肽混合物再用

23、RP-lC-MS分离和鉴定。ICAT策略的优点:1. 若一种蛋白质酶切产生至少一个Cys残基的肽段的话，就可以对其进行鉴别和定量。含有Cys残基的肽段越多，结果对照得出的结论就越准确；2. 鉴定的肽段中肯定都会有至少一个Cys，因此在进行数据库搜索时就增加了一个有效的约束条件；3. 肽段根据标记情况有选择性地得到了富集，从而减少了下游质谱分析的复杂程度；4. 分离出来的标记多肽可直接与后面的RP-µLC-MS分析系统在线偶联操作；5. 可直接对混合样品进行分析；6. 可对低丰度蛋白质直接捕获和快速定性、定量鉴定，尤其是对膜蛋白等疏水性蛋白质；7. 可快速找出功能性蛋白质；8. 无需繁

24、冗的双向凝胶电泳分析分离；9. ICAT软件及质谱技术平台系统可用于全自动快速鉴定蛋白质。ICAT策略的缺陷：1. 不能获得不含Cys的肽段，同时翻译后修饰的检出率较低，而酵母细胞中约有10%左右的蛋白质肽链上没有Cys残基，因而得不到鉴定；2. ICAT试剂的分子质量为500Da左右，相对肽段而言较大，增加了数据库检索算法的复杂性，对于较小片段的修饰可能会影响数据库搜索；3. 耗时太长，数据存储消耗在表达量没有改变的蛋白质上，而这些蛋白质可能与研究的问题没有太大的关联；4. 相对于双向凝胶电泳技术，该方法有高分子量偏性。ICAT策略的改进措施：1. 采用了固相氨基酸同位素标记试剂来代替ICA

25、T试剂；2. 采用多维LC-MS/MS分析系统，把鉴定和定量分开；3. 双向凝胶电泳技术与ICAT技术互补结合测定蛋白质在两样品中的相对含量 4. 磷酸化蛋白质同位素标记亲和标签(Phosphoprotein isotope-coded Affinity Tags, PhIAT) 技术。体内标记方法的优缺点相对于体外标记，体内标记方法具有一定的优势，主要表现在：它省去了标记化学反应和分离纯化等步骤，减少了样品的损失，有利于对低丰度蛋白质的高灵敏度检测。但是，体内标记也存在一些缺点，表现在： 它不能对组织来源的蛋白质进行分析； 培养细胞在富含稳定性同位素的介质中生长，这些介质可能会参与细胞的繁殖

26、和其他生物进程，由此改变蛋白质的表达水平； 这种方法受到同位素材料成本的限制，不太可能对整个动物体进行标记； 对于未知序列的肽段，大多数的体内标记方法都无法确定标记物与肽段之间量的关系，从而使得我们难以确认同一肽段在质谱图上成对出现的不同同位素的标记形式。蛋白质芯片蛋白质芯片是一种在高密度的方格上含有各种微量纯化的蛋白质，并能够高通量地测定这些蛋白质的生物活性，以及蛋白质与生物大分子之间的相互作用。蛋白质组研究中的翻译后修饰蛋白质磷酸化蛋白质可逆磷酸化在调节信号转导过程中有重要作用，是细胞生命活动的调控中心。磷酸化反应是泛指把磷酸基团通过酶促反应转移到其它化合物上的过程。蛋白质的磷酸化则是指由

27、蛋白激酶催化的把ATP或GTP 位的磷酸基转移到底物蛋白质的氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白磷酸酶催化的，称为蛋白质的脱磷酸化。蛋白质磷酸化过程中的质量与结构变化蛋白质磷酸化分析的困难（不足或特点）分析蛋白质的磷酸化是困难的，尽管现代质谱技术的发展非常迅猛，但是磷酸化分析所面临的难点仍然存在，具体有以下几点：(1) 磷酸化蛋白质在细胞内的蛋白质中是相对较低丰度的；(2) 即使我们找到一种磷酸化蛋白质，也不能排除有该蛋白质的其它磷酸化形式存在，在体内磷酸化与其像是一座山（静态），不如像是一条河（动态）；(3) 细胞内有许多磷酸酯酶，在进行样品处理时，这些酶很容易将磷酸基团脱掉，因而加入磷酸

28、酯酶抑制剂是很必要的；(4) 磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段，因为其化学性质的负电性，在质谱技术中面临着难以质子化的困难；(5) 磷酸化肽段在质谱图中还往往受到非磷酸化肽段信号的强烈抑制，这一点在MALDI质谱中尤为明显。磷酸化蛋白质组研究的具体策略如下：磷酸化蛋白质的富集策略由于磷酸化蛋白质丰度低，而且分析检测磷酸化肽段存在困难，使得富集技术（策略）在磷酸化蛋白质组中的研究显得十分重要、必要。富集的策略应用在磷酸化蛋白质组研究中，有两种不同的应用阶段，包括富集磷酸化蛋白质和富集磷酸化肽段。磷酸化蛋白质的富集1 磷酸化蛋白质抗体这是目前富集磷酸化蛋白质的主要手段，而磷酸化蛋白质的抗体主要分成两

29、种：一种是丝氨酸磷酸化蛋白质和苏氨酸磷酸化蛋白质的抗体，另一种是酪氨酸磷酸化蛋白质的抗体。2 化学修饰在富集磷酸化蛋白质中，也可采用化学方法进行修饰，改变磷酸基团的化学性质，然后特异性地分离纯化，就可以定量地分析这些磷酸化蛋白质。 第一种化学修饰方法该种化学修饰的基础是利用磷酸基团脱去后的消除反应，通过加减反应，共价连接新的化学修饰基团。这种化学方法的优点是：所有的反应都在同一个反应体系中进行，没有很多的反应步骤，反应的产率有一定的保证。但这种方法也有明显的缺点：就是对酪氨酸的磷酸化无能为力。第二种化学修饰方法是对第一种方法的合理补充，它可以应用于对酪氨酸磷酸化的修饰。这种方法在保护肽段的氨基

30、和羧基端的基础上，对磷酸基团进行化学修饰，然后用具特异性化学表面的微球进行纯化。很明显，这种方法的化学基础复杂，其核心是对磷酸基团的修饰，以便使有特异性化学表面的玻璃珠结合纯化。该方法的缺点：步骤太多、产率相对较低。磷酸化肽段的富集策略：固定金属螯合亲和层析在磷酸化蛋白质组研究中应用的抗体只是对磷酸化蛋白质有效，对磷酸化肽段进行富集使用较多是固定金属螯合亲和层析(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)法。磷酸基团亲和取代将磷酸化肽段上的磷酸基团用另一种亲和基团取代，再用亲和提取的方法从混合物中分离富集磷酸肽，是近几年出现的一种新技术。主

31、要有两种取代方式：一种是使磷酸基团在碱性条件下发生-消除反应生成双键，再用巯基乙醇通过加成反应取代磷酸基团的位置，最后通过交联剂在巯基上连接生物素，并用亲和素色谱柱分离，这种方法只适合于磷酸化丝氨酸和苏氨酸的取代；另一种是通过化学反应在磷酸基团上连接一个半胱胺基团(cysteamine)，修饰后的磷酸肽用固相化的碘乙酰凝胶亲和提取，这种方法适合对各种磷酸化氨基酸的取代。这两种磷酸基团的亲和取代方法都需要进行化学反应，为了避免副反应的影响，都需要对蛋白质中的一些活性基团进行保护，整个反应体系比较复杂。磷酸化蛋白质/肽段富集策略的优缺点以抗体为基础的对磷酸化蛋白质的富集策略有效但很昂贵，现阶段酪氨

32、酸磷酸化蛋白质的抗体比丝氨酸、苏氨酸的要有效些，对于大多数国内实验室而言，也是同样有效的，但受财力所限使用困难；而以色谱方法为基础的对磷酸化肽段的富集策略(IMAC)，同样是有效的，甚至于在有化学修饰辅助下更加有效，而重要的是试验花费与前者相比微不足道，因而会有更好的应用前景。磷酸化蛋白质组学中的定量问题主要方法：同位素标记在磷酸化定量中的应用，该方法有2种类型。稳定性同位素标记磷酸化研究的同位素标记策略是：在细胞系的培养基中加入稳定性同位素（主要是15N），与在普通培养基中生长的细胞进行比较而得到定量的结果。这种实验方法的具体操作是将在两种不同培养基中培养的细胞等量混合，裂解细胞后分离所感兴

33、趣的蛋白质，经酶解并由质谱检测分析。这种试验方法的设计非常巧妙，让人发现同位素标记技术与质谱技术的结合产生的“化学反应”式的效果，这种方法将蛋白质的鉴定与磷酸化的定量同时完成，而且还可以了解磷酸化的程度，一举多得。但这种思路也有其缺陷： 15N同位素标记的培养基的获得有一定的困难； 这种方法只能应用于培养细胞，对其他生物样本有困难，标记的效率和均一性也是一个问题； 质谱分析前需要对蛋白质进行分离，而低丰度蛋白质能否实现有效分离，值得怀疑，以及分离酶解后是否能找到感兴趣的磷酸化肽段也并非完全由实验者的意愿决定。同位素标记的亲和试剂同位素标记的亲和试剂与磷酸化肽段在磷酸化位点结合，从而给磷酸化肽段

34、加上亲和尾部，引入质量数的差异，以便在质谱分析时根据信号的强度进行定量。这种定量思路比前者要直接一些，更重要的是，要想合成实验所用的PhIAT试剂，这对于生物学实验室是有难度的，而购买商品化的试剂又比较昂贵。但是从ICAT方法在蛋白质组学中的一般定量的应用来看，PhICAT应该有良好的前景。糖基化蛋白质组研究蛋白质糖基化是蛋白质翻译后的一种重要的加工过程，它是指蛋白质与葡萄糖（醛基糖）之间发生的非酶反应而生成糖化蛋白的过程，即指在肽链生物合成的同时或合成后在酶的催化下糖链被接到肽链上的特定糖基化位点的过程。蛋白质糖基化研究的基本目标是： 寻找编码糖蛋白的基因，即基因组信号； 寻找糖基化位点，即糖基化位点信息； 解析糖链及糖基化肽段的结构，即结构信息； 研究糖基化的功能，即功能信息。生物信息流糖基化蛋白质研究的必要性(1) 蛋白质糖基化存在于细胞生命活动的各个方面(2) 糖基化蛋白质在病理中的作用由于糖在HIV或其它致病源与血细胞结合过程中扮演重要的角色，它成为免疫与控制和治疗癌症的最主要的线索之一。(3) 多样性具有足够多的多样性是作为任何信息分子的基础，而糖链比核酸和蛋白质在结构上更具有可变性。(4) 在分子进化中的作用聚糖中许多令人感兴趣的方面可能反映了生物与它们的分子的进化作用。如 多糖中少数稳定构成单位的自然选择； 甲醛聚糖反