时间分辨免疫荧光技术李超

1、时间分辨免疫荧光技术时间分辨免疫荧光技术演讲人：李超2015年2月3日国家精品课程网上资源的可用性研究/*主要内容主要内容n目前有哪些标记免疫学分析方法？目前有哪些标记免疫学分析方法？n什么是免疫荧光技术？什么是免疫荧光技术？n什么是时间分辨免疫荧光技术？什么是时间分辨免疫荧光技术？n时间分辨免疫荧光技术的优势是什么时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？n时间分辨免疫荧光技术可应用于哪些方面？时间分辨免疫荧光技术可应用于哪些方面？国家精品课程网上资源的可用性研究/*目前有哪些标记免疫学分析方法？目前有哪些标记免疫学分析方法？n 免疫荧光分析免疫荧光分析( (Coons, 1941Coons, 19

2、41) )n 放射免疫分析放射免疫分析(Berson(Berson和和Yalow, 1960)Yalow, 1960)n 酶联免疫分析酶联免疫分析 (Engvall, 1971)(Engvall, 1971)n 胶体金标记免疫分析胶体金标记免疫分析(Faulk(Faulk和和Taylor, 1971)Taylor, 1971)n 化学发光免疫分析化学发光免疫分析(Arakawa(Arakawa， 1977)1977)n 时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(Soini(Soini和和HemmilaHemmila，1979)1979)n 电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(Leland,

3、1990)(Leland, 1990)n 生物芯片生物芯片( (美国美国LuminexLuminex公司公司, 1997), 1997)国家精品课程网上资源的可用性研究/*什么是免疫荧光技术？什么是免疫荧光技术？ 基本原理：基本原理：u免疫荧光技术是将免疫荧光技术是将免疫学方法免疫学方法(抗原抗体特异结合抗原抗体特异结合)与与荧光标记荧光标记技术技术结合起来研究结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。的方法。u以以荧光素荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，免

4、疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检用于检测和鉴定未知的抗原测和鉴定未知的抗原。u在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在的部位。合物及其存在的部位。国家精品课程网上资源的可用性研究/*什么是时间分辨免疫荧光技术？什么是时间分辨免疫荧光技术？概念：概念： 时间分辨免疫荧光技术时间分辨免疫荧光技术指利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。国家精品课程

5、网上资源的可用性研究/*什么是时间分辨免疫荧光技术？什么是时间分辨免疫荧光技术？基本原理：基本原理：u用用三价稀土离子三价稀土离子及其及其螯合物螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质；酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质；u当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 （特特异性强、荧光光谱的异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长位移、寿命长），用时间分辨荧光分），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的析仪，测定免疫反

6、应最后产物的荧光强度荧光强度；u根据根据荧光强度荧光强度和和相对荧光强度相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的度，达到定量分析的目的国家精品课程网上资源的可用性研究/*什么是时间分辨免疫荧光技术？什么是时间分辨免疫荧光技术？例如：例如：u三价稀土离子包括有铕三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（，钐（Sm)，铽，铽 (Tb) ，镝，镝 (Dy)等，它们的荧光等，它们的荧光光谱具有特异性强光谱具有特异性强 Stokes位移大位移大寿命长的特点；寿命长的特点；u采用采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-E

7、u)为双功能螯合试剂，其为双功能螯合试剂，其一端螯合一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的，另一端可与蛋白质的-NH2 连接；连接；u在中性或接近中性在中性或接近中性pH 条件下，条件下，DTTA 与与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在具有足够的螯合稳定性，而在增强液增强液（呈酸性）作用下，（呈酸性）作用下，DTTA-Eu 又能将螯合的又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放迅速、彻底地释放出来并与增强液中的配体螯合出来并与增强液中的配体螯合进入胶束的疏水内核，使进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千荧光得以成千万倍地放大。万倍地放大。国家精品课程网上资源的可用性研究/*通过时间延迟，将特异性荧

8、光通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来与非特异性荧光分辨开来国家精品课程网上资源的可用性研究/*时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？精确度上的优势精确度上的优势: 放射免疫 （精度：10-12mol/L） 酶联免疫（精度：10-9 mol/L） 胶体金标记 （精度：10-15mol/L） 化学发光（精度：10-15mol/L） 电化学发光 （精度：10-17mol/L） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L） 生物芯片 （精度：10-18mol/L）国家精品课程网上资源的可用性研究/*技术上的先进性技术上的先进性特点特点特异性荧光与非特异性荧光分

9、离度高时间、光谱分辨时间、光谱分辨发射荧光与激发荧光分离度高零背景、高特异性解离、增强解离、增强荧光性大大提高稳定的荧光螯合物线性范围更宽重复性更好标记位点标记位点标记位点多对标记物结构及活性影响小无衰变受环境影响小高稳定性，高精确度试剂保存时间长标准曲线保留时间长标记方法标记方法单、双标记多标记同一试剂盒可同时测多个项目国家精品课程网上资源的可用性研究/*时间分辨免疫荧光分析相较于化学发光的优势时间分辨免疫荧光分析相较于化学发光的优势发光效率重复检测本底噪声灵敏级数 标记物标记位点标准曲线多标记科研开发时间分辨荧光时间分辨荧光化学发光化学发光95%可无数次零本底10-18原子可达20个/抗体

10、稳定达一年以上最多可达四标记有1%不可重复干扰大10-15大分子化合物1个/抗体稳定 2 到 4周无无国家精品课程网上资源的可用性研究/*时间分辨荧光和电化学发光比较的优势时间分辨荧光和电化学发光比较的优势 标记物 多标记技术 做科研 试剂种类 试剂价格Eu, Sm, Te, Dy有能58种临床,24种科研低钌无无 28种临床, 无科研试剂高时间分辨荧光时间分辨荧光电化学发光电化学发光国家精品课程网上资源的可用性研究/*时间分辨免疫荧光技术优点总结时间分辨免疫荧光技术优点总结u零本底、灵敏度高零本底、灵敏度高u线性范围宽线性范围宽u试剂有效期长试剂有效期长u标准曲线稳定性好标准曲线稳定性好u易

11、于自动化易于自动化u对环境及人体没有任何影响对环境及人体没有任何影响国家精品课程网上资源的可用性研究/*时间分辨免疫荧光技术的应用时间分辨免疫荧光技术的应用内分泌检测内分泌检测甲状腺功能检测甲状腺功能检测糖尿病指标检测糖尿病指标检测生长激素检测生长激素检测T3、T4、FT3、FT4 、TSH-U、TBG 、Ab 、TPO Ab胰岛素、胰岛素、C肽肽hGH（生长激素）（生长激素）意义：意义： 甲状腺疾病也是目前最常见最多发一种内分泌疾病，以上各项目的联合检测，为临床医生对病患者甲状腺功能的评价提供更基础、全面的依据 用于区分胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)和用于

12、胰岛素瘤的诊断 对诊断肢端肥大症是一项特异的方法国家精品课程网上资源的可用性研究/*时间分辨免疫荧光技术的应用时间分辨免疫荧光技术的应用 妇产科检查： hCG 绒毛膜促性腺激素绒毛膜促性腺激素 LH-Spec 黄体生成素黄体生成素(特异性特异性) FSH 促卵泡激素促卵泡激素 PRL 催乳素催乳素 E2 雌二醇雌二醇 Testo 睾酮睾酮 Prog 孕酮孕酮 SHBG 性激素结合球蛋白性激素结合球蛋白意义：意义： 检测这些激素的含量对于生殖生检测这些激素的含量对于生殖生理的研究、疾病的诊断、治疗、随理的研究、疾病的诊断、治疗、随访及计划生育工作的开展具有重要访及计划生育工作的开展具有重要的意义

13、。的意义。国家精品课程网上资源的可用性研究/* 肿瘤科检查：肿瘤科检查： AFP AFP 甲胎蛋白甲胎蛋白 PSA PSA 前列腺特异抗原前列腺特异抗原 B2-M Beta 2B2-M Beta 2微球蛋白微球蛋白 NSE NSE 神经元烯醇化酶神经元烯醇化酶 PAP PAP 前列腺酸性磷酸酶前列腺酸性磷酸酶 CEA CEA 癌胚抗原癌胚抗原 PSA Free/total PSA Free/total 前列腺特异抗原前列腺特异抗原/ /总量总量时间分辨免疫荧光技术的应用时间分辨免疫荧光技术的应用 肿瘤标志物是指示体内肿瘤存在肿瘤标志物是指示体内肿瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物并反映其一定

14、的生物特性的生化物质。通过测定其存在或含量，对于质。通过测定其存在或含量，对于肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导治疗，监测复发或转移及判断预后治疗，监测复发或转移及判断预后等。等。意义：意义：国家精品课程网上资源的可用性研究/*时间分辨免疫荧光技术的应用时间分辨免疫荧光技术的应用遗传疾病检查产前筛查产前筛查新生儿筛查新生儿筛查血液疾病检查贫血检查贫血检查白血病分型白血病分型免疫细胞分型免疫细胞分型细胞毒试验细胞毒试验传染病检查乙肝系列乙肝系列表面抗原表面抗原表面抗体表面抗体e抗原抗原e抗体抗体核心抗体核心抗体意义：意义： 预防患有严重遗传性疾病和先天畸形预防患有严重遗传