紫外光分光光度计

1、一、紫外分光光度计工作原理二、紫外分光光度计构造三、 紫外分光光度计检测DNA 质量的原理 四、 紫外分光光度计操作 紫外分光光度计基本工作原理是用一定频率的紫外、可见光照射被分析的有机物质，引起分子中价电子的跃迁，它将有选择地被吸收。得出的一组随吸收波长改变而变化的光谱，可以反映试样的特征。在紫外光的范围内，对于一个特定的波长，吸收的程度于试样中该成分的浓度成正比。因此可通过测定其吸收度来得出我们所需。 基本依据： 单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，即朗伯- 比尔定律，这是吸收光谱法定量的理论依据。即： A = ECL 式中 A 为吸

2、收度 ； E 为吸收系数，即单位浓度、单位液层厚度的吸收度数值； C 为溶液浓度； L 为液层厚度。 基本构造主要由光源、单色器、吸收池、检测器和显示器五大部分组成。光源光源 单色单色器器 样品样品池池 检测器检测器 显示器显示器 在整个紫外光区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 紫外区常为氢灯或氘灯，发射的连续波长范围是180-360 nm。 单色器是将光源辐射的复合光分成单色光的光学装置。它是分光光度计的心脏部分。单色器一般由狭缝、色散元件及透镜系统组成。关键是色散元件，最常见的色散元件是棱镜和光栅。狭缝：将单色器的散射光切割成单色光。直接关系到仪器的分辨

3、 率。狭缝越小，光的单色性越好。分为入射狭缝和出射狭缝。棱镜:玻璃3503200 nm，石英1854000 nm。光栅:波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便。543211.入射狭缝 2.准直透镜 3.棱镜 4.聚焦棱镜 5.出射狭缝 用于盛装试液的装置（或叫比色皿）吸收材料必须能够透过所测光谱范围的光。一般可见光区使用玻璃吸收池，紫外光使用石英吸收池。 规格有0.5、1.0、2.0、5.0cm 等。 在高精度的分析测定中（紫外光区尤其重要）比色皿要挑选配对，因为其材料的本身吸光特性以及比色皿的光程长度的精度等对分析结果都有影响。4. 4. 检测器检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变

4、成可测的电信号，常用的有光电管、光电倍增管、光电二极管、光电摄像管等。 要求灵敏度高、响应时间短、噪声水平低、稳定性好的优点。5. 5. 显示器显示器 将监测器输出的信号放大并显示出来的装置。常用的液晶数字指示窗口和计算控制显示。 核酸分子基本结构是由磷酸、戊糖和碱基组成，其中碱基具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值的波长为250270 nm。例如腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶的最大紫外线吸收值分别为260.5nm、267nm、264.5nm、259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会发生改变，但是核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这一特性为测定核酸质

5、量提供了基础。 而且，我们可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值。根据它们的比值来估算核酸纯度：核酸样品中最常有的其它吸光物质为蛋白质，由于蛋白质在280 nm处具有强吸收峰，因此测定A260/A280比率，可以判断DNA的纯度。纯化的DNA及RNA的A260/A280 比值应分别接近1.8 及2.0，当溶液中含有蛋白质时，会造成A260/A280 比值降低。 纯DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 仪器的使用操作规程1.准备工作1.1清洗比色皿：先在浓硫酸及重铬酸钾混合液中浸泡（要注意安全），浸泡一段时间后先用自来水洗净

6、混合液，再用蒸馏水冲洗。洗净后放入烘干箱干燥。1.2配制待测样品与空白对照。1.3打开光度计主机电源（预热10-15min）。1.4开启计算机电源。1.5 双击光度计图标，即启动仪器的控制程序。2.检测2.1 点击选项“应用”进入DNA检测界面。如图：2.2 设置参数：测量波长，校正系数。2.3 将有空白对照的比色皿放入样品槽。点击校零。2.4 校零结束后，将对照取出换上待测样品比色皿，点击“测量”开始测定。3. 检测完毕，检查数据是否符合所需，结果正确可以点击“导出”保存结果数据。4. 取出比色皿，将比色皿中的溶液到尽（将吸水纸铺于桌面，将比色皿倒置轻轻磕几下，以确保除净残留）然后用蒸馏水或

7、有机溶剂冲洗比色皿至干净放入烘干箱干燥，将仪器外盖盖好。5. 退出软件，关闭计算机；关闭仪器。1.测定时，需选用石英玻璃的比色皿（一般来说，紫外分光光度计的紫外区指200400nm，玻璃在300-500nm区，有非常强的吸收，会对被测样品造成干扰。必须用在紫外区无吸收的昂贵的石英比色皿。）2.测定时，如有溶液溢出或其它原因将样品槽弄脏，要尽可能及时清理干净（注意规范操作切勿损坏仪器）。每次测定玩必须清洗比色皿，才能加入第二样品，以保证准确性。 3. 如果数据波动较大，依次检查： 校零是否正确（重新校零） ； 参数设置是否正确（波长选择及校正系数设定）； 还有待测样品是否摇匀； 比色皿是否放在 正确位置！4.如果数据异常（如出现负值等）： 依次检查： 比色皿是否用错（测定紫外光时，要用石英比色皿！）； 比色皿规格是否选用正确（0.5ml)； 样品准备是否有误(如有误，重新准备样品）。或者样品是否存在问题（如：样品时间过久DNA缺失、样品检测前没有摇匀）5. 清洗比色皿时一定要注意安全（带上手套规范操作）。切记浸泡时间不可过长，否则损坏比色皿；