第十六章 高效液相色谱法

1、1第第16章章 高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法high performance liquid chromatograph216-1 16-1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点1. 特点：高压、高效、高速、自动化特点：高压、高效、高速、自动化 与气相色谱比较：与气相色谱比较：n适合于分子量大、高沸点、热不稳定有机及生化试样，适合于分子量大、高沸点、热不稳定有机及生化试样， 离子型化合物和高聚物的分离分析。离子型化合物和高聚物的分离分析。n液体流动相参与分离过程，选择性高。液体流动相参与分离过程，选择性高。n固定相类型多，分析选择余地大。固定相类型多，分析选择余地大。n较低的柱温，有

2、利于色谱分离。较低的柱温，有利于色谱分离。n液体扩散性小，纵向扩散可忽略。液体扩散性小，纵向扩散可忽略。n试样易于制备及回收。试样易于制备及回收。n仪器复杂昂贵。仪器复杂昂贵。n液相色谱高柱效的原因液相色谱高柱效的原因: :以特殊方法用小粒径的填料（以特殊方法用小粒径的填料（3 35um5um球形）制备色谱柱球形）制备色谱柱nH=He+Hd+Hm+Hs+Hsm =A+B/u +Cmu+Csu+Csmu 由于溶质分子在溶剂中的扩散系数很小，纵向扩散由于溶质分子在溶剂中的扩散系数很小，纵向扩散可以忽略。可以忽略。 因此因此B B项可以略去。项可以略去。nH=A+（Cm+Cs+Csm）unA=2dA

3、=2dp pn 2.液相色谱中速率理论液相色谱中速率理论0.01 k0.01 k2 2 (1+ k(1+ k) )2 2 Cm =dp2 Dm 416-2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪流程及主要部件流程及主要部件流程流程组成系统：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测和记录系统组成系统：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测和记录系统516-2-1 高压输液系统高压输液系统（1） 高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：15015035035010105 5 PaPa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10 ) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙

4、腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环环己烷己烷 己烷己烷 煤油煤油( (最小最小) ) 溶剂强度溶剂强度指溶剂将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。溶剂指溶剂将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。溶剂强度与溶剂的极性有关。正向色谱中溶剂极性越大溶剂强度强度与溶剂的极性有关。正向色谱中溶剂极性越大溶剂强度越大。反相色谱反之。越大。反相色谱反之。 17（2 2）溶剂要与检测器匹配。）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸

5、收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。外截止波长要长。 对于折光率检测器，要求选择与组对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。（3 3）高纯度）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪伪峰峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50501OOnm1OOnm。（4 4）化

6、学稳定性好）化学稳定性好。避免与样品或固定相发生反应或聚合。避免与样品或固定相发生反应或聚合。（5 5）低粘度）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。（6 6） 试样在流动相中应有适宜的溶解度，试样在流动相中应有适宜的溶解度，若试样组分的若试样组分的分配比分配比K K值范围很广，则采

7、用梯度洗脱。值范围很广，则采用梯度洗脱。18一、液一、液- -固吸附色谱固吸附色谱二、液二、液- -液分配色谱液分配色谱三、化学键合相色谱三、化学键合相色谱四、离子交换色谱四、离子交换色谱五、排阻色谱五、排阻色谱六、亲和色谱六、亲和色谱( (AC)AC)主要分离类型与原理主要分离类型与原理1916-3 16-3 液液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography 固定相固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是使用的是5 51010mm的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂； 流动相流动相：各种不同极性的一

8、元或多元溶剂。：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性；有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；2016-4 16-4 液液-液分配色谱液分配色谱liquid- liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理基本

9、原理：组分在固定相和流动相上的分配组分在固定相和流动相上的分配； 流动相流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（动相的极性小于固定液的极性（正相正相 normal phasenormal phase），），流流动相的极性大于固定液的极性（动相的极性大于固定液的极性（反相反相 reverse phasereverse phase）。）。正正相与反相的出峰顺序相反；相与反相的出峰顺序相反； 固定相固定相：（1 1）全多孔型载体）全多孔型载体 （2 2）表面多孔型载体（薄壳型微珠担体）表面多孔型载体（薄壳型微珠担体） （3

10、3）固定液）固定液 极性：极性：，-氧二丙腈，聚乙二醇氧二丙腈，聚乙二醇 非极性：十八烷（非极性：十八烷（ODSODS），角鲨烷），角鲨烷 2116-5 16-5 化学键合相色谱化学键合相色谱bonded-phase chromatography1 1键合固定相类型键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基表面的硅醇基(Si(Si一一OH)OH)与有机分子成键与有机分子成键, ,即可得到各种性即可得到各种性能的固定相。一般可分三类能的固定相。一般可分三类（1 1）疏水基团疏水基团 如不同链长的烷烃（如不同链长的烷

11、烃（C C8 8和和C C1818）和苯基等）和苯基等（2 2）极性基团极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3 3）离子交换基团离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季铵如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐；盐； 作为阳离子交换作为阳离子交换 基团的磺酸等基团的磺酸等. .22C18硅胶填料结构2316-5 16-5 化学键合相色谱化学键合相色谱bonded-phase chromatography 2.2.化学键合固定相特点：化学键合固定相特点：（1 1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2 2）

12、寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；（3 3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4 4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5 5）有利于梯度洗脱；适用于分离容量因子）有利于梯度洗脱；适用于分离容量因子k k值范围宽的样品。值范围宽的样品。n存在着双重分离机制：存在着双重分离机制：( (键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理) )n高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；n低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主；243反相健合相色谱法反相健合

13、相色谱法 固定相：固定相：极性较小的键合固定相，如硅胶极性较小的键合固定相，如硅胶-C-C1818H H3737、硅胶、硅胶- -苯基等；苯基等；流动相：流动相：极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛- -水、水和无机水、水和无机盐的缓冲溶液等。盐的缓冲溶液等。多用于分离多环芳烃等低极性化合物；具有柱效高，能获多用于分离多环芳烃等低极性化合物；具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。得无拖尾色谱峰的优点。分离机理：分离机理：疏溶剂作用。把非极性的烷基键合相看作一层疏溶剂作用。把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛分子毛”，这

14、种，这种“分分子毛子毛”有较强的疏水特性。当用极性流动相来分离含有有较强的疏水特性。当用极性流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的非极性极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行作用。两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。为。25

15、4.4.正相键合相色谱法正相键合相色谱法 固定相固定相: :极性的有机基团，极性的有机基团，CNCN、NHNH2 2双羟基等（表双羟基等（表16-416-4）键合）键合在硅胶表面在硅胶表面；流动相流动相: :而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为分离极性化合物。极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为分离极性化合物。主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。不同类型的化合物。5.5.离子性键合相色谱法离子性键合相色谱法 固定相固定相: :

16、当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一种离子交换基团，如一SOSO3 3H H 一一CHCH2 2NHNH2 2、C00HC00H、一、一CHCH2 2N N（CHCH3 3）等；等； 流动相流动相: :一般采用缓冲溶液。一般采用缓冲溶液。 分离原理与离子交换色谱类同分离原理与离子交换色谱类同。2616-6 16-6 离子交换色谱离子交换色谱ion-exchange chromatography 流动相流动相：阴离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；：阴离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子交换树脂作固定相，采用酸

17、性水溶液；阳离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液； 基本原理基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：阳离子交换：R RSOSO3 3H +MH +M+ + = R = RSOSO3 3 M + H M + H + + 阴离子交换：阴离子交换：R RNRNR4 4OH +XOH +X- - = R = RNRNR4 4 X + OHX + OH- - 应用应用：

18、离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。27离子交换色谱离子交换色谱分离固定相分离固定相 结构类别：结构类别：（1 1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表薄壳玻璃珠为担体，表面涂约面涂约1%1%的离子交换树脂；的离子交换树脂；（2 2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）键合型（键合离子交换基团） 树脂类别（表树脂类别（表16-616-6）：）：（1 1） 阳离子交换树脂（强酸阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）性、弱酸性）（2 2） 阴离子交换树脂（强碱阴离子交换

19、树脂（强碱性、弱碱性）性、弱碱性）2816-7 16-7 排阻色谱色谱排阻色谱色谱size- exclusion chromatography 固定相固定相：凝胶凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)； 原理原理：按分子大小分离。按分子大小分离。小分子可以扩散（渗透）到凝小分子可以扩散（渗透）到凝胶空隙，由其中通过，出峰最胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；全部在死体积前出峰；

20、可对相对分子质量在可对相对分子质量在100-10100-105 5范范围内的化合物按质量分离围内的化合物按质量分离 29 空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。3016-8 16-8 亲和色谱亲和色谱(AC) Affinity chromatograph原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓具有一般反应