显微与电镜技术.

1、 生物显微技术与电镜技术目录第一篇 生物显微制片技术第一章 概论 第一节 制片的目的和任务第二节 生物制片的分类法第二章 生物显微制片的步骤和原理第一节 取材和固定第二节 洗涤和脱水第三节 透明和透明第四节 浸透及包埋第五节 切片第六节 贴片脱蜡与染色第七节 封固第三章 其它切片法第一节 冷冻切片法第二节 火棉胶制片法第二篇 显微照相术 第一章 显微镜第一节 显微镜的种类第二节 显微镜的光学原理第三节 显微镜的使用及其注意事项第四节 各种显微镜第二章 显微镜几种常用的附件第一节 游标尺的使用第二节 显微测微尺第三节 描绘器第四节 投影屏和投影目镜第五节 共览装置第三章 显微照相术第一节 不同类

2、型的显微照相装置及其功能第二节 显微照相对物镜、目镜及聚光镜的选择第三节 照相的程序第三篇 电子显微技术第一章 概论第二章 电子显微镜的原理和结构第一节 电子显微镜的原理第二节 电子显微镜的结构第三章 扫描电子显微镜第一节 扫描电镜的一些基本概念第二节 扫描电镜的原理及特点第四章 电镜生物样品的制备第一节 透射电镜生物样品的制备 -超薄切片的方法第二节 扫描电镜生物样品的制备附录一 制片技术实例 实验一 涂布法 实验二 石蜡切片法（一） 实验三 石蜡切片法（二）实验四 透射电子显微镜生物标本的制备方法实验五 扫描电子显微镜样品的制备方法第一篇 生物显微制片技术第一章 概论 第一节 制片的目的和

3、任务制片技术是生物科学必不可少的研究手段。人类生活在大自然中，虽很早就认识和研究自然界中形形色色的生物，但起初只限于在外部形态、种类以及生长发育等方面的研究，对于内部细微结构的奥秘，直到十七世纪中叶发明了显微镜后，才开始借助工具进行探索。当时限于工具的简陋及科学发展的水平，观察和研究的方法是十分简单的，到了址九世纪，由于工业革命促进了物理学和化学的发展，进而为显微技术革新的发展提供了丰富的知识和新技术装备，使显微技术产生了根本性的变化。制片技术就是在这样的基础上形成为一门新的学科，从而推动生物科学和日益发展。当然，生物科学迅速发展，也要求投影片技术的内容更加充实和完备，以达到各种观察和研究的目

4、的。由于各种材料的性质及观察研究的目的不同，要制成适合于显微镜下观察的薄片，并要显示出结构的正确的清晰，因而产生了多种制作生物制片的技术和方法。如平时观察细小透明的生物体或组织材料，可无需经切片手续，只需封在一滴水中就能在显微镜下进行观察；对易于分离的组织，可在载波片上涂上一层薄层，经染色或不染色做成涂片；大而复杂的材料，可以用刀或用切征机切成薄片；若要进一步研究其细微的结构，尚须经过若干制片步骤；为了显示组织间更加清晰的结构，还可进一步染色等等。总之，制片方法是极其繁多的，而且仍在不断地发展和充实。由于制片技术在生物科学的领域内占有重要的地位，因此已成为生物学工作必须掌握的一项技术，也是水产

5、养殖学科不可或缺的基本研究手段之一。本篇以石蜡制片技术为主线来阐述制片的基本方法和原理，在掌握基本方法和原理的基础上，其他生物制片法则可融会贯通，以便在工作中达到灵活应用的目的。 第二节生物制片的分类法 生物制片的种类，从不同的角度出发其分类是不一的，如从保存时间的长短可分为“临时制片”和“永久制片”两大类，而目的常根据其制片的方法来分，采用如下的分类方法：一、 活体观察将生物的个体或其一部分，就其原来的状态置于载波片上，加上一滴水和盖波片进行镜检，从而达到预定的检查目的。此法既简便而且又节省时间，并能观察到活体的情况，也不需要什么特殊的设备，但因此法未经过其他处理，常常因组织过厚，光线不易透

6、过，且活体材料又多为无色透明的，结果常难取得满意的效果，同时不易作长期的保存。二、 切片法即是利用锋利的刀具将材料切成薄片。简便的切片法即是利用刀片或剃刀将材料切成薄片后，置于载玻片上加盖进行活体观察；或经处理、染色等步骤做成制片，此法可制成临时制片，必要时亦可制成永久制片。该切片法在制片技术中甚为重要，因为无需特殊设备便能及时地观察到生活组织的内部结构。另处，有些研究有必要先作简单切片进行观察，才能决定材料是否符合目的和要求。完善的切片法如石蜡切片法，火棉胶切片法等，需要经过一系列的过程和各种药剂，染色剂处理，手续甚为复杂，而且要有一定的设备，这些方法由于经过了各种处理，使组织内所含万分发生

7、物理和化学的作用，而显示其差异，以便于观察和研究，同时可用长时间的保存。因此，切片法在生物显微片技术中占有极其重要的地位。三、 非切片法所谓非切片法，即是指不经切片手续，但其不同于活体观察法之点是：此法常经过药剂的处理，这样组织常被杀死后并经染色做成临时或永久制片。或包括：（1） 整体封藏法：用这种方法制片，一般是身体很小或自身为一薄片的低等动物，如无脊椎动物的水螅、草覆虫等。或脊椎动物胚胎材料：如鸡胚、蛙胚、猪胚等。也可取下某一动物体的某部分器官制成封片的，如昆虫的翅、鸟的羽毛、鱼的鳞片等等。这些材料取下后经固定、脱水、染色等手续就可封藏于玻片内而不需用切片机来切片。（2） 涂片法：主要是液

8、体或半流动的材料，不能切成薄片则可涂在玻片上，再经固定与染色等手续制成标本。如：血液、精液、尿、痰、粪便等，还有细胞学的检查，微生物及原生动物等也可用涂片法制片。（3） 磨片法：主要用于含有钙盐等矿物质等万分坚硬的材料，如脊椎动物的牙齿、坚骨、软体动物的介壳、珊瑚虫的骨骼等可不经切片制成磨片标本。（4） 分离法：为了要观察研究在组织或器官里的单个细胞或纤维的形状，必须设法使细胞与细胞的间质消除，细胞便各自分离开来，再经染色后制成切片的方法叫分离法。一般有二种方法： 浸渍分离法：是利用药品使细胞间质溶解，细胞便能自动分离开来，取出单个细胞经过染色、脱水、透明等处理封成片子。 撕碎法：材料经固定或

9、浸渍到一定的程度后用解剖针在解剖镜下撕开的方法，如观察单个的神经纤维即可用此种方法制片。（5） 压碎法：一些柔软的材料可夹在玻片或盖玻片间进行压碎或压开染色后进行观察。第二章生物显微制片的步骤和原理 前面已经提到生物显微制片的方法很多，其制片也繁简不一，为了叙述方便和便于学习，本章采用应用最广泛，过程复杂完善的制片方法石蜡制片法予以叙述。 从动物体取下材料开始，到制成切片标本为止，其间必须经过以下各个步骤：（1） 取材与固定：这是制片切片的第一步，首先必须把动物体的组织杀死，度设法把他原来的结构保存下来，以但观察研究，一般用化学药品把它固定，这种化学药品称为固定剂，它有杀死兼固定和硬化细胞组织

10、的作用。（2） 洗涤：组织经过一定的固定时间以后，内部渗入很多固定剂，必须及时地把渗入里面的固定剂洗支，否则固定剂作用过久会产生一些不良后果，如影响染色、产生结晶等，所以在固定以后必须用水冲洗干净。（3） 脱水：组织中含有大量水分，必须用一些有机溶剂，称为脱水剂的以驱除里面的水分，以利组织的保存和下一步的透明，浸蜡诸步骤的进行。因为透明剂和石蜡与水是不能相溶的，所以必须先脱支水分，方能进行以下步骤。（4） 透明：其目的是便于浸蜡包埋。因为石蜡不能与脱水剂混合，只能与透明剂混合，因此在脱水后组织里充满的脱水剂必须用透明剂所代替，这样才能使石蜡熔剂渗入。（5） 浸蜡：组织块在完全透明后，支持剂石蜡

11、等就容易透入，它的目的一方面使组织变硬有利于切片，另处也使组织块内各组分间的相互位置保持一定，基本上维持生活时的状况。石蜡的透入需要在一定的温度下才能进行。（6） 包埋：把透足石蜡的组织包埋在石蜡里，成为一定的开形状以便切片。（7） 切片：把包埋好的组织块用切片机进行切片，根据观察的要求确定切取的方向和厚度。（8） 贴片：用粘贴剂使切出的薄片平铺粘贴在载玻片上以便于染色和观察。一般常用甘油蛋白贴剂。（9） 脱蜡与染色：石蜡作为支持剂在切片和贴片后就完成了使命。为便于观察，须脱支石蜡并对切片进行染色，染色的其目的是使细胞或组织的各部分染上不同的颜色，产生不同的折射率以显示它不同的构造。染色方法有

12、多种可以根据要求不同而选择。（10） 封藏：切片染好以后用一种胶类物质称封藏剂的封好，以利于长期保存。以上为切片制作的一般步骤概述，其详细过程，原理将在以后各章节中叙述。 第一节取材和固定 当我们选择某种材料制成切片时，应立刻把材料加以处理，否则组织结构很快会发生萎缩，死亡或分解等变化。因此，材料在选定后，即需将动植物的组织迅速地予以杀死和固定下来，使它保持生活时之自然状态，而不至于在死亡前后，在形态及结构上发生变化。下面分别讨论有关这一过程的原理，性质和作用等问题。一、 杀死：在这里具有两层含义，其一是把用于取材的动物处死，取下需做切片的材料（包括外科病理手术或活检切除下的材料）。动物杀死的

13、方法很多，常根据动物大小，种别及观察目的而定。例如青蛙、小鼠等类较小的动物，可用断头法杀死，即用大号剪刀剪断颈部，迅速将动物倒提放血，如反射尚未消失可用金属探针插入脊髓管，破坏其脑脊髓。一些较大的动物例如天竺鼠、兔子、猫等可用空气栓塞法，用50亳升的注射器从耳静脉注射入空气，使动物心脏发生急性空气栓塞，循环障碍，痉挛而死。注入空气的量，视动物大小而定，一般情况下兔猫约注入2040毫升，狗需注入80150毫升。此法迅速方便，但各脏器淤血明显，脑和心可发生人为性病变（心内膜下淤血和脑部变质）。也可用扑杀法，即用木棒从头后部给予猛击，使其颈椎脱位，延髓急性损伤而死。或用麻醉或用窒息法：使动物闷在有乙

14、醚或氯仿的密闷容器内，使麻醉致死，或在容器中通入煤气，其发生急性煤气中毒而死亡。其中用乙醚麻醉致死的动物常有肺部充血，呼吸道分泌物增多的病变，煤气中毒致死的动物因一氯化碳可使红血蛋白转变碳氯血红蛋白，使动物内脏呈樱桃红色，影响对血液和骨骼的涂片染色（必须在组织固定后，用稀的过氧化氢液处理后再进行）。这些人为病变，在观察时必须注意分辨。 总之在杀死动物时，无论采用哪种方法，都要尽力避免使动物长时间陷于痛苦和濒临死亡状态，以免使动物的组织细胞各组分的结构发生变化，或引起病理假象。 杀死的第二层含义是指用一种或多种化学药品，很迅速地终结生物组织的生命而言。这一处理要求越快越好，尽量减少改变其生活状态

15、的可能性，所以要选择渗透力很强的化学药品来做为杀死剂，力求在很短的时间内迅速浸入到组织中的每一个细胞内，以避免在生命死亡之前后发生变化，这是选择杀死剂的一个重要原则。 固定：在杀死的基础上，把组织或细胞按生活的状态固下来，使在以后制片的任何过程中不发生变化。 杀死和固定两者之间的关系是极为密切的，是两个不同的步骤，但又是相互统一。相互作用的过程，我们常用的杀死剂，一般都兼作固定剂，在选配时就应加以考虑。 保存：材料经杀死，固定处理后，一般都马上做成切片保存。但有时若需要反固定的组织在较长的时间内保存下来，不至于发生溶解或其他的变化，我们常用即能固定又能兼作保存作用的固定剂，例如甲醛醋酸酒精固定

16、液，材料可长期保存于该溶液中几年或更长时间，也不会变坏。有的固定剂则不能兼作保存的作用，例如铬酸类的固定剂，在固定作用完成后必须更换保存液，否则材料会变坏。通常所用保存液为70%的酒精溶液，一般的材料在其中可保存较长的时间而不至变坏。二、 固定的理论为了使生物体组织或细胞的细微结构及其内含物完整固定起来，在制片的各个步骤中也不至发生变化，通常都是利用化学药品加以处理。到目前为止，还没有一种化学药品能达到十分完善的效果，使材料在固定后能完全保持它的原来生活状态。这点也不难理解，因为生命在死亡之前对外来的刺激有强烈的反应，因此，材料经过处理后，就或多或少会发生一些改变的。用化学药品来处理，实际上对

17、于生命来说是一种毒杀作用，要求一成不变是不可能的。但是人们可以寻找或发现符合理想的化学药品，来达到理想的目的。那未，什么算是理想的固定药剂呢？对此我们应先了解下述几个问题。（一） 固定作用的原理1、 化学作用：即凝结作用，例如细胞内的蛋白质，遇到洒精后即凝结成块状，并不在以后所用的任何药剂中变化或溶解。2、 物理变化：即沉淀作用，如油类和脂肪等遇到锇酸即发生黑色沉淀，但必须指出某种沉淀发生后又能溶解于水，这样就不能看作是固定。（二）、固定的目的和理想的固定剂我们要求达到固定的目的，可以归纳为下列四点：1、 迅速地杀死原生质，并保持原来的细微结构；2、 增加细胞结构及内含物的折光程度，使各部分结

18、构更为清晰，适于在显微镜下观察；3、 使材料适当的硬化而便于切片；4、 促进生物组织对于某些染色剂的媒染作用，因为固定剂可直接影响以后的染色，有的固定剂会阻碍或不利于某种染色剂的着色，而另一些固定剂则可以促进或有利于着色，在选用固定剂和染色剂时，若配合得好强得到良好的效果，配合得不好，则难以着色。因此，在选取用固定剂时，就应事先加以考虑以后将采用何种染色剂染色，否则会造成着色的困难或效果不佳。根据上述的要求，一种料理想的良好固定剂，应具备下列条件：1、 渗透力强：能迅速地渗透到生物组织或细胞的各个部分，立即杀死原生质并固定其细微的结构，使其不发生变化；2、 避免使组织或细胞发生收缩或膨胀；3、

19、 能增加着色能力和煤染能力；4、 固定剂又必须是是良好的保存剂（当然是有些组织的良好固定剂，不一定能作保存剂），材料经固定后能经久不坏；5、 使组织适应的变硬，并具有一定的坚韧性，而但于切片，但是，又不能使材料过于坚硬或变成松脆，而不利切片。 要达到上述各项的要求的条件，如用单纯的化学药品来处理，显然是难以达到。因有的药品渗透力很强，但容易引起收缩，如酒精是最常用的固定剂，它的渗透力很强，（95%酒精每小时渗透速度可达一毫米），但它的缺点是使原生质发生收缩，而醋酸则可产生相反的作用，使原生质膨胀。若两种药剂按适当的比例混合使用，则可相互抵消缺陷。所以，我们通常采用的固定剂，都是由两种或两种以上

20、的化学药品配合而成，谓之混合固定剂，目的在于相互制约，克服单纯固定剂所不能达到的效果。 目前所用的混合固定剂的种类是很多的，但是，尚没有一种可以完全适合各种生物组织的固定，就是同一器官或组织，其幼年和老年的结构、特性也不相同。因此，在选择固定液时，必须根据动、植物的种类不同的器官、年龄、特性以及制片者的经验和观察的目的而决定。 （三）、固定象（一） 酸性固定象：即是在酸性固定剂中可使细胞分裂期间的染色质、核仁、纺锤丝保存下来，细胞质固定成索状海绵质，核质和线粒体则被溶解。（二） 碱性固定象：在碱性固定剂中和酸性作用相反，使分裂期间的染色质和纺锤丝被溶解，而核质和线粒体被保存，细胞质固定成透明质

21、状态，植物细胞内液泡也可保存下来。 我们通常使用的固定剂，大多数是产生酸性固定象，只有少数的固定剂才产生碱性固定象。固定后所产生的结果与固定剂以及材料的种类有关。例如有时用酸性固定剂，对某些材料进行固定，也发现线粒体的存在。此外还与应用的脱水剂、透明剂亦有连带关系，如用波菌氏液固定，纯酒精脱水、二甲苯透明的结果，则和用叔丁醇为脱水剂的结果显然不同。 有的固定剂可以产生两种固定象。例如生铬酸钾在PH4。8时，同时可以保存染色质的线粒体。固定剂中若含有两种以上的化学药品时，其固定结果所产生的象，主要决定于此种混合液中的渗透力最强的一种。 在制片技术中，酸性固定剂较碱性固定剂应用的为多，而碱性固定剂

22、仅适用于研究细胞的内含物、线粒体等。 （四）、固定剂 （一）、单纯固定剂的种类、性质及其应用：1、 酒精酒精是常用的固定剂，依其水分的含量可分为两种：（1） 纯酒精：纯酒精的标准浓度为100%，是一种良好的杀死及固定剂，假如材料需要立即杀死与固定，纯酒清相当适用，但它的币能合原生质发生收缩，故很少单独作用，若应用时，固定的时间要短，一般不超过一小时，用纯酒精不但可以杀死和固定，而且还有脱水的作用、固定后只需要更换两次，将组织中的水分彻底除支，即可进行透明。（2） 95%酒精：它的标准浓度为95%96%，是普遍的杀死与固定剂，并可兼作保存剂，材料经固定后，不需进行冲洗，或换液等手续就可进行脱水，

23、所以平时应用很多，它的币也是能使原生质发生收缩。用95%酒精固定的时间，一般1530分钟为宜，较大的材料12小时即可。若固定时间过长，材料则变脆而易折断，难以切片，要长时间的保存，则必须加入等量的甘油而成酒精甘油混合液，材料保存其中可长久不坏，材料经95%酒精杀死后，一般常换入70%酒精作保存液。 酒精常与其他药品配合作用，但要注意它本身是一种还原剂，很容易被氧化成乙醛，甚至成为乙酸。因此，不宜与铬酸、重铬酸钾或锇酸等配合，而能与甲醛、冰醋酸或丙酸等配合使用，且固定效果良好。 酒精可使组织中的蛋白质发生沉淀，而且此种沉淀为不溶性的，它也可使核酸发生沉淀，但沉淀为可溶性的，此外，酒精又可以溶解脂

24、肪、磷酸脂、的以不宜用此二者的固定。2、 甲醛：甲醛通常叫福尔马林或蚁醛，是一种气体，市上出售的是溶于水的无色溶液，40%为其最高的饱和度（但由于吸水作用，常为38%的浓度）。制作切片时，通常都是以40%的浓度当作100%的浓度来配制固定液，但必须是化学酏的甲醛，一般商用的甲醛因含有杂质，品质不纯，因此不宜用来配制固定液。 甲醛可单独作为杀死和固定之用，有时可得到很好的效果，它的缺点是容易使材料发生收缩和固定过度的现象，因此，最好是与其他药品配合使用，可以大大增加其效果，如单独使用甲醛作固定时，其浓度一般为510%左右这宜。 甲醛为很好的硬化剂，惟其渗透力慢，如单独作用时可产生碱性固定象，而不

25、能沉淀蛋白质，它和酒精混合作用，可以阻止因酒精造成材料过度坚硬的缺点。甲醛对于脂肪既不保存也不破坏，对于磷脂则有保存的功用。 甲醛是一种强的还原剂，易于氧化成蚁酸，故不能与铬酸或锇酸等混合使用，此外，甲醛贮存过久则会变成蚁醛酸，可加入5%吡啶中和。3、 冰醋酸：纯的醋酸在低温的时候，即凝结成冰花状结晶，所以又叫冰醋酸。它是带有强烈刺激的无色液，通常用15%的浓度作为固定剂，而不单独作用。醋酸主要的功用是渗透很强，而且十分迅速，它能溶解脂肪，产生酸性的固定象，醋酸是一种良好的保存剂，除防腐之外，还可保存其中的蛋白质等，使它不至变质，另外它又是染色体很好的保存剂。醋酸能使组织细胞发生膨胀作用，可防

26、止其他药剂如酒精、甲醛、铬酸等容易引起收缩的缺点，可以有相互平衡作用，它还可与水或酒精任间混合成各种需要的固定液。4、 铬酸：铬酸为三氧化铬的水化物，是一种红棕色的结晶体，十分容易潮解，故平时盛放的容器必须严密封紧。由于铬酸为一强烈的氧化剂，因此不能与酒精或甲醛等还原剂得天独厚配合，混合配好后必须立即作用，否则失效。例如酪酸遇到酒精，很快地还原为氧化铬而失去固定的作用。 铬酸是一咱很好的固定剂，可以使蛋白质、核蛋白、核酸等产生良好的沉淀，而且所产生的沉淀不再溶解，它对于脂肪及脂类等没有作用。组织固定在铬酸中时，不能直接暴露在阳光下，否则会引起已固定的蛋白质分解。 铬酸在制片技术上广泛作用，尤其

27、在研究细胞学方面是必不可少的药剂，是许多杀死剂与固定剂的基本万分，它的缺点是容易使组织收缩，渗透力较弱，且能使组织发生过度硬化，的以它常与作用相反的其他药剂混合作用，克服上述的一些缺点，而得到良好的效果。 铬酸的饱和度可达62%或更高，通常配成210%的水溶液作为基液，应用时可随时稀释至所需的浓度，一般用0。51%的水溶液作为固定之用。用铬酸液固定时，用量要多些，固定后要用流水乇底冲洗干净。 用含有铬酸固定剂固定时，材料会出现棕黑色，有染色。为此，常常将切片浸入1%的高锰酸钾水溶液中进行漂白，约一分钟即可，再用水洗净，然后再浸入5%的草酸中约一分钟，用水洗净便可进行染色。5、 苦味酸：苦味酸又

28、名三硝基苯酚，是一种淡黄色具光泽的结晶，为一种强烈的爆炸药，干粉遇高温或撞击时易爆炸，因此常以过饱和的水溶液进行保存，它在水中的溶解度，根据室内温度而有所变化，一般深解度约为0。91。4%，亦可溶于酒精，二甲苯及苯中。苦味酸的渗透力强，能使组织发生较强的收缩。通常用它的饱和水溶液作为固定之用，它可使蛋白质、核蛋白及核糖发生沉淀作用，对于胚囊自由核时期的固定效果很好，并且可以防止过度硬化，还可增进以后的染色效果。 苦味酸很少单独使用，常与其他溶液配合用作固定。用苦味酸溶液固定后，材料必须用50%或70%酒精洗涤，不能用水冲洗，否则沉淀将会破坏（除非原来的固定液中所含的其他药剂不能溶解沉淀物时，才

29、能用水冲洗）。用酒精也不必洗涤很久，因为在脱水时，要经过一毓不同浓度的酒精，在这过程中还起着洗耳恭听涤的作用。此外，如在石蜡切片中，当溶去石蜡以后的染色过程又经过酒精及二甲苯等，亦可不断的洗去此种物质。平常经过处理后，组织中虽存留着黄色，此种颜色对于染色并无多大妨碍，若要洗净，可在70%酒精中加入少许碳酸锂进行洗涤即可。6、 锇酸：锇酸即四氧化锇，是一种灰黄色的结晶，它不是一种酸类，它的溶液呈中性反应。此药品十分昂贵，通常将半克成一克的结晶封储在小玻璃管内，配制溶液时，连同小管在瓶中击碎，它是一种强烈的氧化剂，不能和酒精、甲醛混合，平常配成2%的基液务用，其饱和度可达6%，配制时要特别小心，所

30、用的？水要绝对纯净，如果所用的？水及盛具含有极微量的有机质存在时，也可使其还原成黑色，而失去固定的效应，储存时应用棕色瓶？装。为了便于保存，防止其还原，可用下列方法处理：（1） 在溶液中加入适量的高锰酸钾，使溶液呈玫瑰色，如颜色减退，可再次加入；（2） 将锇酸溶于1%铬酸溶液中配成1%的溶液；（3） 在溶液中加入少量的古典化钠。锇酸是目前制片技术中最好的固定剂，尤其在细胞学方面的研究，此种固定剂最为优良，在电子显微镜术的超薄切片中也用此药作为主要固定剂，位于细胞内的细微构造固定良好，并为脂肪性物质唯一的固定剂，尤其对线粒体的研究常用此液固定，材料经此液固定后，又能防止用酒精脱水所产生的沉淀作用

31、。锇酸的渗透力很弱，且不易于固定均匀，往往材料外面固定过度里面尚未固定完全，所以材料应越小越好，等材料已全呈棕黑色时，表示固定作用完成。固定以后在脱水之前，必须在流水中彻底洗涤，约需一昼夜的时间，染色前可用过氧化氢漂白，以免影响染色7、 重铬酸钾：重铬酸钾是一种？色的结晶粉未，它在水中溶解度大约为9%，用作固定液的浓度为13%，它的水溶液带酸性。它是一咱强烈的氧化剂，因此不能与酒精、甲醛等事先配合。此外，它又为一强烈的硬化剂，但它的渗透力则较弱，被固定的材料以小为宜。重铬酸钾很少单独作用，常与其他药品配合作固定之用。重铬酸钾和其他药剂混合时，国为配合后的酸碱度不同，对于组织的固定，可以产生两种

32、固定象。当它和酸性液体混合的，PH值在4。2以下时，其固定性能象铬酸，可以固定染色体，细胞质染色质则沉淀为网状，但不能固定细胞质中的线粒体，如果PH值在5。2以上时，染色体被溶去，染色质的网状不明显，但是细胞质则保存得均匀一致，尤其对线粒体固定有很好的效果。8、 氯化汞：氯化汞又名升汞，是一种剧毒的无色粉未，不单独作用，常与醋酸等配合，一种杀死力强，渗透力迅速、对于蛋白质有强烈的沉淀作用的固定剂，它的缺点是容易引起细胞发生收缩现象。用此药固定的材料，必须彻底洗净，因氧化汞易留存于组织中成结晶体。氯化汞通常是用饱和的水溶液作固定之有，有时也用70%酒精为溶剂。水溶解的要用水冲洗干净，酒精溶解的则

33、要用同浓度的酒精冲洗，并加入许碘液便于将汞盐提出。洗耳恭听净汞盐后，再用0。2%硫代硫酸钠溶液将碘洗去，然后再用水或酒精洗耳恭听净。 应用此液固定的材料，要迅速进行包埋，以免材料经久会变坏。含有氧化汞的固定液，对于细胞学的研究不宜使用。9、 碘：碘是一种很好的防腐剂，可与碘化钾配合成为良好的固定剂。其配制方法：取饱和的碘化钾水溶液若干，加入碘的结晶直到饱和为止，经过滤再用？水稀释成溶棕色为止。固定时仍需加水稀释至淡棕色溶液，是低等单细胞生物、群体生物以及藻类植物等的良好固定剂。它的渗透力很强，如与冰醋酸或甲醛配合可得到更好的效果。固定后用流水冲洗耳恭听，如材料中含有的淀粉核被着色未能洗去可在水

34、中加入0。5%酸水溶液，即可将各种色彩除尽。 （二）、混合固定剂的种类、性质及其应用1、 混合固定剂的混合原则：上述各种单纯的固定剂，各有其优缺点，通常均要配合成混合液而使用，这样可相互抵消其缺陷，而得到所需的固定液。在配合时，要注意它们的特殊性，的用的各种药剂之间要有一种平衡的作用，如某种药剂可使细胞质收缩，必须与另一种可使细胞质膨胀的药剂同时并用。另外强的氧化剂不能与强的还原剂同时配制在一起，若需混合应用的，则两者分别配制，等临用时再混合。2、 混合固定剂的种类性质及其应用的范围（1）、ZENKER氏液：配方：升汞5。0克；重铬酸钾2。5克；硫酸钠1克（可略去不有，因无固定作用） ？水10

35、0毫升（以上为ZENKER贮存液） 冰醋酸（用时加入）5毫升配制此液可将升汞，重铬酸钾一起置于？水中，加温至4050度使其溶解，冷后过滤，贮于棕色瓶内，成为贮存液，用时取此液95毫升再加入冰醋酸毫升即成。此液PH2。3。ZENKER氏液为组织学、细胞学及病理学常用的固定剂，多用于固定一般组织，能使细胞核和细胞浆染色较为清晰，固定时间1236小时，加热固定可以加快渗透作用。固定后流水冲洗12小时，在乙醇脱水过程中加入碘液以去汞。 （2）HELLY氏注：将上述ZENKER氏液配方中的冰醋酸换成甲醛液5毫升即可。甲 醛也在用前加入。因在加入甲醛24小时后即生成沉淀而失效。升汞5。0克，重铬酸钾2。5

36、克，硫酸钠1克，？水100毫升，甲醛（40%）（用时加入）5毫升HELLY氏液常用于研究线粒体，胞浆、胞核固定较好，也为固定白细胞颗粒最好的固定剂，用于造血脏器、脾、肝等组织最为适宜，一般大小组织固定1224小时，固定后流水冲流1224小时，用碘酒精去汞。 （3）MAXIMOV氏液： ZENKER贮存液100毫升，甲醛（中性）10毫升 此液主要是用甲醛代替ZENKER氏液的冰醋酸，因此不产生铬酸万分，因重铬酸钾未酸化，对细胞浆固定很好，甲醛稍有促染细胞浆的作用，增加对酸性染料的亲和力。升汞对细胞核染色较好。 （4）MULLER氏液：重铬酸钾22。5克，硫酸钠1。0克，？水100毫升 此液作用缓

37、慢，但固定均匀，收缩也少，多用于媒染和硬化神经组织；固定时间自数天至数星期，固定过程中，须时常更换新液。固定后流水冲洗耳恭听，酒精脱水。（5）HEIDENHSIN氏液：升汞4。5克，氯化钠0。5克，？水80毫升，三氯醋酸2。0克，冰醋酸4毫升。甲醛20毫升为用于正常或病理组织较好固定剂之一，因含三氯醋酸和氯化钠，对较硬的组织特别有用，如皮肤，蝈虫，昆虫幼虫等角质层较厚的组织均可采用。它的渗透力快，固定34小时，2毫米之薄块组织只须3小时，固定后直接投入95%酒精，勿入水或低浓度之酒精，因能使结缔组织膨胀，在酒精内可加入碘酒精（95%酒精配制）以去汞。去汞也可在切片染色前进行。（6） BOUIN

38、氏液：苦味酸饱和溶液（0。91。2%）75毫升，甲醛（3740%）25毫升冰醋酸5毫升配方中苦味酸可沉淀一切蛋白质，但穿透速度慢，使组织收缩大，故不能单独作用。而冰醋酸，甲醛的穿透力较强，但冰醋酸组织膨胀故不单独作用，所以相互配合在一起后就成为较好的固定剂。此外冰醋酸也可固定染色质。BOUIN氏液为常用良好固定剂，一般动物组织、昆虫组织、无脊椎动物的卵和幼虫及一般组织学、胚胎学的材料均可用以固定。该液渗透力迅速，固定均匀，组织收缩少，可把一般的微细结构显示出来，对苏木素及酸性复红易于着色。 一般组织固定1224小时，小块组织数小时（416小时）即可。固定后可入70%酒精洗去苦味酸，可在每次更换

39、酒精时加入氮水一滴使中和酸性和漂白苦味酸，或加入少许碳酸锂饱和水溶液以洗去黄色。组织在脱水经酒精时也可洗去苦味酸，即使留有少量苦味酸，对一般染色并无影响。（7） CARNOY氏液：纯酒精（100%）6份（60毫升），冰醋酸一份10毫升，氯仿（三氯甲烷）3份（30毫升）此液能固定胞浆和胞核尤其适宜于染色体故多用于细胞学的制片。其中以纯酒精固定胞浆及沉淀肝糖，冰醋酸固定染色质，并可防止酒精的硬化及收缩作用，并增加渗透力，对外膜致密不易透入的组织特别适合。固定的组织适合各种染色法。 此液穿透速度快，小块组织一般固定2040分钟，大型材料不超过34小时。如放置过久，对组织不仅会产生膨胀作用，且有硬化现

40、象。此液尤其适用于固定染色体、中心体、固定有丝分裂最合宜（如：固定蚕精巢10分钟，马蝈虫子宫3040分钟，小白？的？丸3050分钟）。此外对于腺体，淋巴组织了也较好，并能固定原生动物的胞壳，固定后用95%酒精洗涤，可保存于80%酒精中。（8） FLEMMING氏液强液：1%铬酸水溶液75毫升；2%锇酸水溶液20毫升；冰醋酸5毫升弱液：1%铬酸水溶液25毫升；2%锇酸水溶液5毫升；1%冰醋酸（用前加入）10毫升，？水60毫升。 此液为细胞固定剂，尤其适应于高尔基体及线粒体的固定，它的渗透力极弱，不块组织须固定2448小时，强液适于固定脂肪组织（经固定的脂肪，髓鞘，变为黑色）。固定的组织须用流水冲

41、洗24小时，如组织变为黑色，当构前须经过深白处理，对蕃红花及苏木素着色较好。 配方中的锇酸使细胞质固定很均匀，冰醋酸及铬酸将染色体保存得较好，铬酸并能使组织有适宜的硬度，有利于石蜡的浸透。此液的缺点是固定不均匀，不适于大块组织的固定。固定液须临用时配制，不能长期贮备。（9） ALTMANN氏液：5%重铬酸钾水溶液10毫升 临用时配合，为线粒体，脂肪良好固定剂，固定白血球颗粒较好。小块组织（23毫米）固定24小时，流水冲洗组织24小时。（10） Dafano氏液硝酸钴1克，福尔马林15毫升，？水100毫升高尔基体固定良好，流水冲洗。（11） Champy氏液：3%重铬酸钾7份，1%铬酸7份，2%

42、锇酸4份。 这是一种可以长期贮存的锇酸混合液，此液PH为1。5为细胞学优良固定剂，主要用于线粒体，其中铬酸能沉淀蛋白质，四氧化锇固定线粒体及高尔基体，因穿透力较差，组织块宜小，固定624小时，流水冲洗过夜。（12） Orth氏液： 重铬酸钾2。5克，硫酸钠（可略去）1克，？水100毫升。甲醛（3740%）（用时加入）10毫升 此液为较好的常规固定剂，神经组织、胚胎、精元和脂肪等均可应用。它的渗透力极强，组织发生收缩较少。必须临用前配合，固定应在暗处进行，固定1224小时或较久（4毫米厚之组织固定3672小时），若超过24小时，则每隔24小时须更换新液一次，此液呈黑色失去效用，即不宜再用。固定后

43、流水冲洗1024小时，可贮于70%酒精中。（13） Smith改良Tellyesniczky氏液：生铬酸钾0。5克，冰醋酸2。5毫升，甲醛10毫升，水87。5毫升 用于蛙卵的固定效果甚佳，固定2448小时，固定后再用水洗612小时，脱水从15%酒精开始。（14） 铬酸醋酸甲醛混合液： 1%铬酸16毫升，冰醋酸1毫升 用前取以上混合剂2毫升加10%甲醛9毫升，固定24小时，固定后流水冲洗，为 脊椎动物胚胎材料的良好固定剂。（15） Mossmans氏液： 福尔马林10份，95%乙醇30份，冰醋酸10份，？水50份 此液用于哺乳动物胚胎，它有渗透力很快兼有脱钙作用。第二节洗涤和脱水一、 洗涤的目的

44、和洗涤的原则 组织在固定后一定要把渗入里面的固定液洗去然后再进行下一步的操作。冲涤必须彻底，否则留在组织中的固定液有的可以妨碍染色，有的可以发生沉淀物或结晶影响观察，有的可以继续发生作用，使材料变坏或使以后的处理上发生困难，但冲洗有一定原则，要看固定剂的种类不同而定：1、 固定剂为酒精，或酒精混合液，一般不要求冲洗，如需冲洗必须采用与固定剂中的酒精浓度相近的酒精冲洗，不可用水冲洗，也不应用浓度相差很大的酒精冲洗，应用同浓度的酒精洗。用福尔马林固定的也不须冲洗，但长久固定于福尔马林的标本应充分水洗，否则会影响染色。2、 固定剂以水配制的用流水冲洗，可使组织中的固定液随时溢出随时洗去，可洗得干净。

45、3、 凡是含有铬酸、重铬酸钾的固定剂，必须用流水冲洗，冲洗时间应与固定时间相同，或多于固定时间。4、 含有苦味酸的固定液，无论是水溶液或酒精溶液，都应冲洗，冲洗时最好用70%的酒精，也可用水冲洗12小时后脱水，苦味酸的黄色在70%的酒精中能自行脱去或加入碳酸锂饱和水溶液以除去之。5、 如固定液中含有氧化汞，应根据溶液的性质用水或酒精冲洗，冲洗完毕必须在70%酒精中加碘液去汞，因汞在组织内易形成结晶不利于切片，并形成假象，不利于观察，去汞后再用5%硫代硫酸钠以去碘的黄色。6、 用锇酸及含有锇酸的固定液，必须用流水冲洗，因锇酸使组织发黑影响染色，经酒精时并生成沉淀。7、 冲洗时间视固定的种类而异，

46、最少者1小时以上，或半日，多日，一般化024小时。 冲洗的方法：将组织块放入广口瓶中，瓶口罩纱布用绳缚牢，如材料品种较多可用纱布分别包好五起放入广口瓶中，将此瓶置自来水龙头下，龙头上可接橡皮管一段，并将另一端插入瓶底，调节水的流量，使水从瓶底缓缓流出，使瓶内的水能够独获得更新。过激的水流能冲击标本使标本受损，甚至发生流失，必须注意。二、 几种常用固定剂的特殊洗涤法1、 苦味酸含有苦味酸固定液的材料，可用于50%或70%酒精来洗。这是认为苦味酸与蛋白质结合经水能溶解，但Baker认为没有此种作用，一般所以不用水洗已成习惯，苦味酸所留的黄色，在70%酒精中自会脱去，即使不让它完全脱去，则在以后制片

47、脱水过程中经各级酒精也会逐渐消失，即留少许黄色于组织中并无妨碍，所存少量酸性也不足以影响染色。如欲去色可在70%酒精中不时滴入碳酸锂饱和水溶液，直至酒精不变颜色为止，表示已去除干净。2、 锇酸固定后用流水洗涤1224小时，组织必须冲洗干净，否则会影响染色。3、 氧化汞用氧化汞固定的组织内常有一种沉淀物生成，呈棱形结晶或不规则或略圆的块状物，棱形物被认为是氧化亚汞，不规则物可能是金属汞，此种结晶必须洗去否则会使组织发脆，或染色不良。可用0。5%碘酒精溶液（70%酒精配制）逐渐反复加入70%酒精中，直至酒精因加入碘的黄色不裉为止表示组织内氧化汞已完全被洗去，其反应为氧化汞与碘化合成为氧化亚汞和碘化

48、汞。氧化亚汞多溶于酒精，碘化汞多溶于水中，用碘洗后，组织所留黄色可在70%酒精中洗去，或用硫代硫酸钠洗去。去汞步骤也可在切片染色前进行。4、 重铬酸钾用重铬酸钾固定的组织可用流水冲洗1224小时；或用亚硫酸，或用1%含水氯溶液洗。 第三节透明及透明剂材料在除尽水分后，还要经过一种即能与脱水剂又能与包埋剂（石蜡、火棉胶）相混合的溶剂来处理，以便于包埋剂的渗入。由于这种溶剂能使材料透明，因此这个步骤则称之为“透明”。在制片技术中，除了应用一般即能脱水及透明，而又能与包埋剂或封固剂相混合的脱水剂外（例如氧化二乙稀，正丁醇），一般应用酒精脱水的制片，都要经过透明的步骤。目前常用的透明剂有以下几种：一、

49、 二甲苯二甲苯是目前应用最广泛的一咱透明剂，作用迅速，能溶解石蜡，加拿大树胶，但缺点是易使材料发生收缩变脆，使用材料必须彻底脱尽水分，否则发生乳状混浊。为了避免材料的收缩，而采取逐步从纯酒精过渡到二甲苯中，一般是从2/3纯酒精+1/3二甲苯1/2纯酒精+1/2二甲苯1/3纯酒精+2/3二甲苯二甲苯。二甲苯应更换二次，以除尽酒精。在二甲苯中的时间不宜放置过长，否则会使材料收缩或变得硬脆，要视材料的大小而定，一般13小时（染色后的切片，经510分钟即可）。二、 氯仿氯仿又名三氯甲烷，为麻醉剂，挥发的气体有甜味，呼吸过久会引起麻醉，在盛装时应用棕色瓶，并避免日光曝晒，否则可逐渐氧化成为“光气”，有剧

50、毒。火锦胶法的制片，都采用氯仿作透明剂，石蜡法也可应用，但它的挥发性能要比二甲苯快。氯仿的渗透力较弱，对材料的收缩性能也较小，浸渍的时间应？延长。此外，氯仿能破坏染色，所以对于已经染色的切片作透明时不宜使用。三、 甲苯甲苯的性能与二甲苯同，国内出产较多，价格亦较便宜，可作二甲苯的代用品。四、 苯苯的性能与二甲苯相似，亦可作为透明剂。五、 丁香油丁香油为切片染色后，在用树胶封固以前最好的透明剂。例如固绿，桔红G等可在丁香油中溶成饱和液，待染色到最后一步时，可作为染色、分色、透明三步合并使用，效果很好。经丁香油透明后的制片，尚须经过二甲苯处理一下，而将组织中的残油除净，否则混暗不清。另外丁香油？发

51、得慢，如不经二甲苯，制片虽放置很长时间，亦不易干涸。丁香油的价格甚贵，应用时往往采用滴剂，处理后多余的可收回再用。六、 香柏油纯的香柏油多用于油镜上，普通的常混有杂质（如二甲苯等），此种可用作透明剂，并且不易使材料收缩变硬，但它的作用很慢，应用时可从纯酒精放入，此剂不易挥发，因此最好经过二甲苯一次，以但除净香柏油，加速石蜡的渗透。七、 冬绿油冬绿油可作整体制片的透明剂，尤其对于显示植物维管系统的制作效果很好，但因此剂的渗透力很慢，并具有毒性，平时较少应用，而采用其它试剂代替。 第四节浸透和包埋一、 石蜡浸透法材料经过完全透明以后，进一步就是浸蜡，浸蜡的目的在于除去材料中的二甲苯（或其它透明剂）

52、，而代之以石蜡（或火锦胶）。其要点是使石蜡完全浸入细胞的每个部分，同时要使石蜡紧密地巾在细胞壁的内外，成为不可分离的状态，而便于切片。浸蜡一般是从低至高温，从低浓度到高浓度，这样可使石蜡慢慢渗入组织内，而将透明剂替代出来，如果操之过急，则石蜡浸入不彻底，而影响浸蜡的效果。浸蜡的步骤：先将石蜡切成小块或薄片，取少许溶化在含材料的透明剂中，使其随着透明剂渗入组织。待溶解后，再不断加入小块石蜡，直至达到饱和后，将其放入3640的温箱中，并不断加入石蜡，直达1/2石蜡的体积为止。经几小时后，移入5860的温箱中，打开瓶塞，让透明剂？发，放置数小时后，将材料投入盛有融化的石蜡的酒杯中，再经数小时后换纯蜡

53、一次，经数小时后，此时材料中完全被石蜡浸透并除尽透明剂，即可进行包埋。二、 包埋剂关于石蜡制片法的包埋剂石蜡的性质，对于切片的成败有密切的密切的关系。因此，对于石蜡的选择应？以注意。在石蜡市片技术中，所用石蜡的熔点一般是5256，同时要求质地平滑均匀而无杂质的为好。但是这里也必须批出，此等石蜡还有一个缺点，即是在常温下或切取级薄的片子时，往往不能切得令人满意，如果应用二种或三种不同溶点的石蜡配合作用，则可得到较好的效果。此外，也可采用石蜡混合剂进行浸蜡的包埋，也可达到很好的效果。困为纯粹的石蜡质地疏松。虽然要以将它放在容器中作较长时间的煮炼，使它变得紧密，但是无论如何，其中还有微小的空隙存在。

54、因此，常采用石蜡和少许蜂蜡混合（至于加入蜂蜡的比例要视材料的性质来决定，一般为石蜡5份，蜂蜡1份），因为蜂蜡质地柔软润滑并带有粘性。 浸蜡及包埋时所用的石蜡，还要依季节而定，即是夏季时应采用熔点较高（如5658）的石蜡，但石蜡熔点愈高，质地愈疏松，不易切得连续的切片，如采用上述的混合剂，则可获得较好的效果。在冬季制片时，则宜用熔点较低（5254）的石蜡。三、 包埋的操作及作用材料经浸蜡以后，进一步是包埋，在包埋前准备好纸盒，金属温台、镊子、酒精灯及熔化的纯石蜡等工具。纸盒是包埋蜡块的铸型，其制作是取质地坚？、光滑而不易透水的白纸（如重磅道林纸或图画纸），裁成长方形的纸块（大小视材料而定），如图

55、121所示，折叠成纸盒。包埋的方法：先将纸盒放置在温台上，在温台的一角用酒精灯保持一定的温度（应料石蜡的熔点稍高些），将已熔化的纯石蜡迅速倒入纸盒中，并取镊子或解剖针放在酒精上加热插入盒中，沿纸盒的边缘轻轻移动，以除去石中的气泡如图122所示，此时，可将纸盒从温台上取下，放在桌上，不多时盒底部的石蜡即能凝固一薄层，接着即将材料用已加热的镊子移入纸盒内，并迅速将材料按照所需要的切面整齐的排好，注意每个材料之间要有一定的距离，以免将来修整蜡块时将材料毁坏。在这个过程中，所用的镊子或解剖针要不断地加热，将材料四周的气泡赶出，同时也使得材料和四周的石蜡温度一致，而避免石蜡在凝固后与材料发生分离的现象，

56、而影响切片。当材料排好并赶尽气泡以后，将石蜡的表面凝固一薄层时，用双手平稳的将纸盒放于冷水中，等到表面已凝固后，将纸盒全部压入水中，使石蜡迅速凝固。如果让其自动凝固。则石蜡往往发生结晶现象，而不能进行切片。四、 包埋时应注意的事项 包埋的好坏，能直接影响到切片的效果，因此，在包埋时技术应熟练而迅速，特别要注意温度的控制，温度太高，而石蜡凝固太慢，往往在蜡块中出现气泡，如果将它突然放入水中，蜡块又会产生破裂现象，温度过低时，不仅不易操作，而且常使材料与其周围的石蜡不能凝固的紧密，也不易赶走气泡，造成材料与石蜡分离的现象，而不能进行切片。 第五节切片 包埋完毕后，下一步即可进行切片，这是石蜡切片法

57、的最重要的步骤之一，它的成功与否，关系到下一步的进行，所以应仔细操作。一、 蜡块的修整与固着 修整蜡块时，须将其上下两边和左右两边修成平行，这样切成的蜡带才成直线。一般都将蜡块修成梯形或正方形或长方形，修好的蜡块必须安在载蜡器上（木制或金属的），方可切片。其方法是：用蜡铲或解剖刀铲少许蜡片碎屑，在酒精灯上加热熔化后倾注在载蜡器上，速将蜡块的底部与载蜡器紧贴，并轻轻压一下，再加少许熔化石蜡于蜡块基部周围，以石蜡块牢固地粘在载蜡器上为度。二、 切片过程（一） 切片机 切片机包括石蜡切片机、火棉胶切片机和冰冻切片机等，一般石蜡切片通常使用旋转式切片机，其主要部件包括：（1）转轮，即带有一半实心的轮子；（2）微螺旋齿轮推进器；控制切片厚度及推进