淋巴细胞分离

1、免疫细胞分离和保存技术意义临床上的各种类型的免疫缺陷、自身免疫病以及肿瘤等疾病均可出现淋巴细胞或淋巴亚群的数量和功能的变化。因此用体外方法对机体具有免疫反应的外周血淋巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所显示的功能的强弱进行检测，是判断机体细胞免疫水平判断机体细胞免疫水平的一种重要手段。这对于临床认识疾病、探讨其发病机制、观察病情变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等方面均有重要意义。要求分离的淋巴细胞纯度高、产量多，而且不丧失活性，同时也要求分离技术简单、操作方便。 细胞分离基本原理细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分

2、化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同血液中红细胞与白细胞比例约为6001000：1，两者的比重不同其沉降速度也不同，通常用两种方法加以分离。（直立静置（直立静置RT3060min，紧贴红细胞，紧贴红细胞层上的白膜层）层上的白膜层）一、白细胞的分离1、自然沉降法、自然沉降法外周血， 抗凝，静置约一小时血液分为三层，上层为血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为WBC，轻轻吸取此层即可得到富含WBC悬液，低渗破坏RBC，洗涤即可。无菌蒸馏水低渗裂解法或无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。氯化铵处理法。2、聚合物加速沉淀法、聚合物加速沉淀法某些高分子聚合物（如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素

3、和聚乙烯吡咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串，加速红细胞沉降，使之更易与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。二、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞（外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell)主要指淋巴细胞和单核主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群。密度为细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群。密度为1.0751.090 。人的红细胞密度为人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 常用的分离剂为：常用的分离剂为

4、：Ficoll和和Percoll分离剂分离剂1、 Ficoll分层液分层液 主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。其主要成分为聚蔗糖(商品名为Ficoll )其密度为1.020。可将血液分成四层，从上到下依次是：血浆、单个核细胞、粒细胞和红细胞。Ficoll 成份：2份6%聚蔗糖（ficoll)水溶液 + 1份34%泛影葡胺（hypaque)生理盐水溶液。人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的分离聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)2、Percoll分层液分层液是一种连续密度梯度离心分离法，其

5、主要成分为：硅胶颗粒，其原液密度为：1.135。经过聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒大小不一的混悬液。高速离心后，形成连续密度梯度（由下而上的逐减的连续密度梯度，由下而上的逐减的连续密度梯度，density gradient），可将密度不同的细胞分离纯化。可将血液分成四层，从上到下依次是：死亡细胞和血小板、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞和红细胞。淋巴细胞纯度淋巴细胞纯度98%, 单核细胞纯度单核细胞纯度78%。流程长。流程长, 步骤繁步骤繁, 成本成本高。高。三、淋巴细胞的分离与纯化 PBMC悬液富含淋巴细胞，但有混杂有单核细胞、红悬液富含淋巴细胞，

6、但有混杂有单核细胞、红细胞和血小板。细胞和血小板。贴壁粘附法贴壁粘附法 磁铁吸引法磁铁吸引法 Percoll 分离液法分离液法（去单核细胞）（去单核细胞）红细胞的去除红细胞的去除: 无菌蒸馏水低渗裂解法或无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。氯化铵处理法。 血小板的去除血小板的去除: 离心洗涤离心洗涤23次。次。贴壁粘附法贴壁粘附法 利用二者具黏附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶（利用二者具黏附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶（Sephhadex Sephhadex G-10)G-10)等特性。等特性。95%95%为淋巴细胞，活性大于为淋巴细胞，活性大于95% 95% 。但损失部。但损失部分分B B淋巴细

7、胞。淋巴细胞。2.2.磁铁吸引法磁铁吸引法 PBMCPBMC吞噬直径吞噬直径3um3um的羰基铁颗粒，用磁铁将细胞吸至管的羰基铁颗粒，用磁铁将细胞吸至管底，上清即含较纯的淋巴细胞。底，上清即含较纯的淋巴细胞。3. 3. Percoll 分离液法分离液法E E花环沉降法花环沉降法 EAEA花环沉降法花环沉降法 尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法 四、T细胞和B细胞的分离（一）（一）E花环沉降法花环沉降法 成熟T细胞表面有SRBC受体（E受体），可和SRBC形成E花环，B细胞则无。（二）（二）EA花环花环B细胞表面带有IgG Fc段受体，AgAb复合物中IgG Fc段牢固结合；这类红细胞抗体致敏的动物红

8、细胞（EA)黏附在B细胞周围形成花环。（三）尼龙毛柱分离法（三）尼龙毛柱分离法利用B细胞和单核细胞具有黏附在尼龙（nylon wool) 表面的特性。先洗脱出的事T细胞，再用培养也便冲洗边捻压塑料管，流出来的液体中主要含B细胞。T细胞纯度达90%，B细胞纯度达80% 。（一）亲和板结合分离（一）亲和板结合分离（二）免疫磁珠分离（二）免疫磁珠分离（三）流式分选（三）流式分选五、细胞亚群的分离T细胞：TCR、CD3、CD4、CD8、CD25等B细胞：BCR 、 CD19、CD5等NK细胞: TCR/CD3、BCR/CD19、CD56+、CD16+Macrophage: DC:Mast cells:

9、免疫细胞表面标志免疫细胞表面标志正选（正选（positive selection）法：）法：纯化所需的细胞纯化所需的细胞负选（负选（negtive selection）法：）法：去除不要的细胞，留下所需细胞去除不要的细胞，留下所需细胞将所需的细胞对应的单克隆抗体包被于小管内加入淋巴细胞形成Ag-Ab复合物洗去不反应的物质。（一）亲和板结合分离（一）亲和板结合分离（二）免疫磁珠分离（二）免疫磁珠分离磁性微珠(magnetic beads免疫磁珠分离法具有高纯度（免疫磁珠分离法具有高纯度（80 99），高得率），高得率（90 95）、高细胞活性（）、高细胞活性（99 100%）的特点，仅次或）的特

10、点，仅次或相当于流式细胞仪（相当于流式细胞仪（FACS）的分选效率。）的分选效率。 与与FACS 相比，本方法操作简单、省时、经济；可用做相比，本方法操作简单、省时、经济；可用做FACS分选前的预分离，以减少分选前的预分离，以减少FACS所用时间。所用时间。 另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可达可达9599。注意事项如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。分离柱一般只能一次应用，再用时分离效率降低。分离柱一般只能一次应用，再用时分离效率降低。抗体包被磁珠和死细胞常有非特异性结合，

11、因而分选前应抗体包被磁珠和死细胞常有非特异性结合，因而分选前应去除死细胞；上分离柱前，充分振荡混悬细胞，打散细胞去除死细胞；上分离柱前，充分振荡混悬细胞，打散细胞团块。团块。用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞柱不被气泡阻滞荧光激活细胞分离仪(FACS)主要由4部分组成:细胞流动系统及气压流速控制系统;激发系统;检测与讯号处理系统;细胞分选系统。（三）流式分选（三）流式分选荧光激活细胞分离仪（fluorescence activated cell sorter，FACS）n细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成

12、单行，细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区。逐个流经检测区。n当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴，每小滴内最多含一个细胞流断裂成一连串的均匀小滴，每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞）。（其中只有百分之几的液滴中含细胞）。n细胞经激光照射产生荧细胞经激光照射产生荧光和散射光，信号经计光和散射光，信号经计算机系统处理，分辨细算机系统处理，分辨细胞的类型。如识别的是胞的类型。如识别的是所需的细胞时（如所需的细胞时（如T细细胞），使液滴瞬即感应胞），使液滴瞬即感应阳

13、电荷、阴电荷或不带阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的电场偏转下进入不同的收集管。收集管。 用用FACS分离细胞准确快速、纯度高、回收率高，分离细胞准确快速、纯度高、回收率高，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行。能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行。 仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手段手段1、分离细胞的保存 （1）短期保存 用含有10%20%灭活小牛血清的 Hanks、RPMI 1640培养液可保存数周（2）长期保存及复苏 保存：在保护剂二甲亚砜中于液氮（-196)中保存。其过程是：先对需冻存的

14、细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含有10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬 液，分装于冻存管内，立即放入降温过渡站( -80)中，继而进行降温(-196)冷冻。 六、细胞的保存及活力测定六、细胞的保存及活力测定复苏：将其从液氮中取出，立即放入40 温水中，融化后加入10倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力。 2、细胞活力的检测 常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞而使细胞着色（蓝色）。 实验步骤豚鼠的抓取保定豚鼠的抓取保定豚鼠性情温顺，胆小易惊，一般不

15、易伤人。捉拿时，实验人员可先用手轻轻扣、按住豚鼠背部，顺势抓紧其肩胛上方皮肤，拇指和食指环其颈部，用另一只手轻轻托住其臀部，即可将豚鼠抓取保定。兔的抓取保定兔的抓取保定l家兔驯服不咬人，但四肢的爪尖锐，挣扎时容易抓伤人。抓取保定方法是用右手把两耳拿在手心并抓住颈后部皮肤，提起家兔，然后用左手托住臀部。1.另一种方法是使用家兔保定栏。一、动物保定一、动物保定（1）肝素：）肝素：肝素是含硫酸基的粘多糖，常用其钠盐或钾盐，它能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，从而阻止血液凝固。常用的肝素溶液浓度为1 000U/ml，市售肝素多为100U126Umg。使每ml血液含15U20U

16、肝素。（2）乙二胺四乙酸（）乙二胺四乙酸（EDTA）：）：是一种螯合剂。用生理盐水配制成4的溶液备用。每ml血液加入1mg2mg的EDTA。（3）阿氏液（）阿氏液（Alsever液）：液）： 枸橼酸钠（Na3C6H5O75H2O） 0.80g 枸橼酸 0.0325g 葡萄糖 2.05g 氯化钠 0.42g H2O 加至 100.00ml 混匀溶解后，114.3高压蒸汽灭菌10min备用。 阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂，又含有细胞生存的营养，所以它既可做抗凝剂，又可做血细胞的保存液。以阿氏液和采血量以11比例采集血液，边采边轻轻摇动采血瓶，使之混匀。用阿氏液采血，除了抗凝外，多用于红细胞的保存。一般在4条件下，阿氏液中保存的红细胞2周其活性和特性不变。二、抗凝剂二、抗凝剂采血前的准备l用注射器取3 ml淋巴细胞分层液于一试管中.l再用注射器吸取ml的阿氏液，并保存在注射器中心脏采血l取血前应探明心脏搏动最强部位，通常在胸骨左缘的正中，选心跳最显的部位作穿刺。针头宜稍细长些，以免发生手术后穿刺孔出血。三、豚鼠淋巴细胞的分离三、豚鼠淋巴细胞的分离取豚鼠抗凝血4毫升，加3毫升Hanks液使之稀释。加于3毫升淋巴细胞分层液液面之上（沿管壁轻轻加入，勿使两液相