基因芯片技术资料

1、基因芯片技术基因芯片技术 周秀娟周秀娟 基因芯片基因芯片(Gene chip)(Gene chip) 又称又称DNADNA芯片（芯片（DNA ChipDNA Chip）或生物芯片）或生物芯片(Biological (Biological chip),chip),它是指将大量探针分子固定于支持物上，然它是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析。度及分布进而对靶分子的序列和数量进行分析。 通俗地说，就是通过微加工技术通俗地说，就是通过微加工技术 ，将数以万计、，将数以万计、乃

2、至百万计的特定序列的乃至百万计的特定序列的DNADNA片段（基因探针），片段（基因探针），有规律地排列固定于有规律地排列固定于2cm2 2cm2 的硅片、玻片的硅片、玻片 等支持物等支持物上，构成的一个二维上，构成的一个二维DNADNA探针阵列，与计算机的电探针阵列，与计算机的电子芯片十分相似，所以被称为基因芯片。子芯片十分相似，所以被称为基因芯片。 基因芯片的制作技术主要包括基因芯片的制作技术主要包括芯片制备，样品制备，芯片制备，样品制备，杂交反应，信号检测和结果分析杂交反应，信号检测和结果分析。 将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA

3、DNA经经PCRPCR扩增扩增后制备荧光后制备荧光标记探针标记探针，然后再与芯片上，然后再与芯片上寡核苷酸点寡核苷酸点杂交杂交，最后通过，最后通过扫描仪定量扫描仪定量好分析荧光分好分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。 该技术可检测各种介质中的微生物，研究复杂微该技术可检测各种介质中的微生物，研究复杂微生物群体的基因表达。生物群体的基因表达。 二、基因芯片的基本原理二、基因芯片的基本原理图1、利用基因芯片进行杂交测序的原理1 ATACGTTA2 GTTAGATC3 ACGTTAGA4 CGTTAGAT5 GTTAGATCDNA 样 品

4、 TATGCAATCTAG与基因芯片上 65,000 种可能的八聚体进行杂交从而形成特定的结合图形计算机分析杂交图象并由探针的重叠情况推导样品的核酸序列1 ATACGTTA3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT5 GTTAGATC3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGAT互补序列为：ATACGTTAGATC样品序列为：TATGCAATCTAG 三、基因芯片的技术流程三、基因芯片的技术流程PCRT7 promoterT7 promoter体内转录片段化1.5 小时杂交、冲洗ACGT扫描分析1 小时荧光素图 2 样品处理与检测过程简图1.1.支持物：如玻片、

5、硅片、支持物：如玻片、硅片、NCNC膜、膜、NylonNylon膜膜2.2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的在支持物上，每个位点的序列是已知的外观外观探针探针支持物支持物剖面图剖面图平面局部放大平面局部放大 从点阵的制备方法分从点阵的制备方法分原位合成型原位合成型“点膜点膜”型型 原位合成型原位合成型：根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机：根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子 优点：合成效率高、点阵密度高优点：合成效率高、点阵密度

6、高 缺点：设备昂贵、技术复杂、反映产率低缺点：设备昂贵、技术复杂、反映产率低“点膜点膜”型型：合成工作用传统的：合成工作用传统的DNADNA固相合成仪式完成，只是固相合成仪式完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻璃片上。布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻璃片上。 优点：设备廉价、技术简便、研制周期短、灵活度高优点：设备廉价、技术简便、研制周期短、灵活度高 缺点：点阵密度低缺点：点阵密度低 七、基因芯片技术的应用七、基因芯片技术的应用（一）、朱晓光、杨银辉、康晓平等人写了（一）、朱晓光、杨银辉、康晓平等

7、人写了1313种虫媒病毒基种虫媒病毒基因芯片检测方法的建立等论文因芯片检测方法的建立等论文 1 1、方法、方法（1 1）寡核昔酸探针的设计与合成寡核昔酸探针）寡核昔酸探针的设计与合成寡核昔酸探针由华大基因公司设计并合成。每条探针长度为由华大基因公司设计并合成。每条探针长度为70mer,mT70mer,mT介于介于7575一一8585。每种病毒设计。每种病毒设计5 5条寡核昔酸探针及相同数量的互补条寡核昔酸探针及相同数量的互补序列探针序列探针, ,用于病毒特异性鉴定。另外用于病毒特异性鉴定。另外, ,针对以上针对以上1313种病毒所种病毒所在的在的3 3个病毒属个病毒属, ,各设计各设计1010

8、条寡核昔酸探针条寡核昔酸探针, ,探针总数为探针总数为160160条条, ,用于属水平的筛查。用于属水平的筛查。（2 2）、病毒的培养和病毒核酸的提取）、病毒的培养和病毒核酸的提取 EEEVEEEV、WEEVWEEV、VEEVVEEV、MAYVMAYV、WNVWNV和和JBEVJBEV用用BHKBHK细胞培养细胞培养,1-4,1-4型型DENVDENV用用C C6 6/36/36细胞培养细胞培养,BUNV,BUNV用用Vero-E6Vero-E6细胞培养。产生细胞病变细胞培养。产生细胞病变后后, ,将培养瓶在将培养瓶在-70-70冰箱中冻融冰箱中冻融, ,用于病毒核酸的提取。用于病毒核酸的提取

9、。 由于以上由于以上1313种虫媒病毒均为种虫媒病毒均为RNARNA病毒病毒, ,因此因此, ,病毒总病毒总RNARNA用用QIAGENRNAeasyQIAGENRNAeasy试剂盒提取。试剂盒提取。（3 3）、待检病毒核酸的扩增与标记）、待检病毒核酸的扩增与标记 提取病毒提取病毒RNARNA后后, ,用锚定随机引物进行反转录获得用锚定随机引物进行反转录获得cDNAcDNA作作模板模板, ,反转录随机引物序列为反转录随机引物序列为5-GTTTCCCAGTCACGATC-5-GTTTCCCAGTCACGATC-NNNNNNNNN-3NNNNNNNNN-3, ,然后用测序酶合成第二链然后用测序酶合

10、成第二链cDNAcDNA, ,随机随机PCRPCR扩扩增用随机引物增用随机引物5-GTTTCCCAGT-CAOGATC-35-GTTTCCCAGT-CAOGATC-3进行进行, ,并在扩并在扩增的过程中掺入增的过程中掺入aa-dUTPaa-dUTP对对PCRPCR产物进行标记产物进行标记,PCR,PCR反应体系反应体系为为100ug,100ug,扩增条件为扩增条件为9595变性变性5min,5min,然后然后9430s9430s、555530s30s、7260s,7260s,共共3535个循环。个循环。 扩增产物用扩增产物用Amicon MicroconAmicon Microcon-PCR-

11、PCR纯化柱进行纯化纯化柱进行纯化, ,与与lmollmol/L/L碳酸氢钠混合碳酸氢钠混合, ,然后将待检病毒及细胞基因组的然后将待检病毒及细胞基因组的PCRPCR产物分别与产物分别与cyTM3cyTM3和和CyTM5CyTM5偶联偶联, ,经纯化后可用于芯片杂交。经纯化后可用于芯片杂交。（4 4）、基因芯片的制备）、基因芯片的制备 使用醛基化处理的玻片使用醛基化处理的玻片, ,纯化干燥后的寡核昔酸探针用纯化干燥后的寡核昔酸探针用3X3X标准柠檬酸盐溶液溶解标准柠檬酸盐溶液溶解, ,使终浓度为使终浓度为40umol/L40umol/L。用。用Spot Spot Array72Array72进

12、行点样进行点样, ,每条探针重复点样每条探针重复点样3 3次次, ,每种样品点成每种样品点成4 44 4的矩阵的矩阵, ,每种病毒的每种病毒的1010个探针分散点样在个探针分散点样在4 4个矩阵中。个矩阵中。点样后的芯片用点样后的芯片用HoeferLJVC500HoeferLJVC500紫外交联仪以紫外交联仪以600600100uJ/cm100uJ/cm2 2交联交联2 2次次, ,用于芯片的杂交。用于芯片的杂交。（5 5）、芯片杂交反应）、芯片杂交反应 将芯片在含甲酞胺的杂交液中于将芯片在含甲酞胺的杂交液中于4242预杂交预杂交1h,1h,同时将标同时将标记好并纯化的待检病毒靶核酸溶于含酵母

13、记好并纯化的待检病毒靶核酸溶于含酵母tRNAtRNA、Poly-APoly-A、SSCSSC及及SDSSDS的杂交液中的杂交液中, ,于于9999变性变性2-5min2-5min后加入甲酞胺后加入甲酞胺, ,滴滴加到芯片上加到芯片上, ,盖上盖玻片后进行杂交盖上盖玻片后进行杂交,42,42水浴孵育水浴孵育8-16h8-16h。杂交结束后分别在杂交结束后分别在2xSSC2xSSC、0.2xSSC0.2xSSC蒸馏水和无水乙醇中进蒸馏水和无水乙醇中进行洗涤。行洗涤。 （6 6）、结果判断）、结果判断 基因芯片杂交结果用基因芯片杂交结果用ScanArray GxScanArray Gx Plus P

14、lus扫描仪扫描仪进行扫描进行扫描, ,用用GenePixPro5.1GenePixPro5.1软件进行分析。在所有软件进行分析。在所有的检测中的检测中, ,病毒感染的细胞上清用一种荧光染料标病毒感染的细胞上清用一种荧光染料标记记, ,而阴性对照的未感染病毒的细胞上清用另一种而阴性对照的未感染病毒的细胞上清用另一种荧光染料标记。荧光染料标记。 取病毒荧光信号绝对值大于取病毒荧光信号绝对值大于10001000或与细胞荧光信或与细胞荧光信号强度比值在号强度比值在2.02.0以上的点为阳性信号点。以上的点为阳性信号点。 ( (二二) )、杨银辉等利用实验室建立的医学病毒属杨银辉等利用实验室建立的医学病毒属水平筛查基因芯片及主要虫媒病毒检测基因芯片，水平筛查基因芯片及主要虫