微生物限度检查法

1、微生物限度检查法（微生物限度检查法（P184）微生物限度检查的微生物限度检查的概念概念 微生物限度检查法系检查非规定灭微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。程度的方法。“允许含有允许含有一定量一定量的菌的菌”微生物限度检查的意义微生物限度检查的意义 ( (l) l) 保证药品质量保证药品质量 (2) 反映药品生产工艺的科学性、反映药品生产工艺的科学性、合理性及质量管理水平合理性及质量管理水平 微生物限度检查的微生物限度检查的项目项目 染菌数量的限制染菌数量的限制 染菌种类的限制染菌种类的限制 1. 1. 染菌量检查包括细菌数、

2、霉菌数染菌量检查包括细菌数、霉菌数及酵母菌数计数，以检查这几类微生物及酵母菌数计数，以检查这几类微生物对药品的污染程度。对药品的污染程度。 2. 2. 控制菌检查控制菌检查 包括大肠埃希氏菌、沙包括大肠埃希氏菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及梭菌检查。及梭菌检查。 3. 3. 螨类检查螨类检查3 3、除另有规定外，微生物限度检查的细除另有规定外，微生物限度检查的细菌培养温度为菌培养温度为30303535；霉菌、酵母；霉菌、酵母菌培养温度为菌培养温度为23232828；控制菌培养；控制菌培养温度为温度为35353737。4 4、检验结果以检验结果以1 1

3、g g、1ml1ml、10g10g、10ml 10ml 或或1010cmcm2 2为单位报告。为单位报告。 细菌总数及霉菌总数的测定细菌总数及霉菌总数的测定 微生物限度标准微生物限度标准(单位：个单位：个/g或个或个/ml) 编号编号 剂剂 型型 细菌数细菌数 霉菌霉菌1 片剂片剂 1000 1002 酊剂酊剂 100 1003 栓剂栓剂 100 104 胶囊剂胶囊剂 1000 1005 软膏剂软膏剂 100 1006 一般眼膏剂一般眼膏剂 1007 一般滴眼剂一般滴眼剂 100 8 丸剂（滴丸、糖丸等）丸剂（滴丸、糖丸等） 1000 1009 气雾剂气雾剂 100 1010 糖浆剂糖浆剂 1

4、00 10011 膜剂膜剂 100/10cm2 100/10cm212 颗粒剂颗粒剂 1000 10013口服溶液剂、混悬剂、乳剂口服溶液剂、混悬剂、乳剂 100 10014 散剂散剂 1000 100 外用散剂外用散剂 100 10015 滴耳剂滴耳剂 100 1016 滴鼻剂滴鼻剂 100 1017 洗剂洗剂 100 10018 搽剂搽剂 100 10019 凝胶剂凝胶剂 100 100 检查被检药品在单位重量或体积（每检查被检药品在单位重量或体积（每克或每毫升）中所含的活菌数，以判克或每毫升）中所含的活菌数，以判断被检药物被细菌污染的程度。断被检药物被细菌污染的程度。 方法：营养琼脂倾注

5、平皿计数法。方法：营养琼脂倾注平皿计数法。 培养基：培养基：营养琼脂培养基营养琼脂培养基一、一、细菌细菌总数的测定（总数的测定（P184）倾注倾注 涂布涂布细菌总数测定的方法细菌总数测定的方法 取一定量的供试品以无菌生理盐水按取一定量的供试品以无菌生理盐水按比例进行系列稀释（比例进行系列稀释（10倍稀释）倍稀释），加，加入定量的稀释液于无菌平皿中，再加入定量的稀释液于无菌平皿中，再加入已熔化的、温度在入已熔化的、温度在45左右的琼脂左右的琼脂培养基，混匀，凝固后于培养箱培养培养基，混匀，凝固后于培养箱培养，然后计数平板内菌落数。选取菌落，然后计数平板内菌落数。选取菌落数在数在30-300之间的

6、平板进行计数，再之间的平板进行计数，再乘以稀释倍数即可得每克或每毫升供乘以稀释倍数即可得每克或每毫升供试药品中的活菌总数。试药品中的活菌总数。 取均匀供试液取均匀供试液,进一步稀释成进一步稀释成1:10 、1:100等适宜的稀释度。分别取等适宜的稀释度。分别取连续连续23个稀释级个稀释级10倍稀释的供试液各倍稀释的供试液各1ml,置直径约置直径约90mm的平皿中，再注入约的平皿中，再注入约45的培养基约的培养基约15-20ml，混匀，待凝，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释度应作固后，倒置培养，每稀释度应作23个平皿。个平皿。1、供试品的制备、供试品的制备(p184)液体供试品：液体供试品：10

7、倍稀释，采用三个倍稀释，采用三个 稀释度稀释度用用1ml无菌吸管精确吸取无菌吸管精确吸取1ml样品样品悬液放悬液放入入10-1的试管中，换另一支吸管将管内的试管中，换另一支吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀，然后自时离开水面，使其混合均匀，然后自10-1试管吸试管吸1ml放入放入10-2试管中，换另一试管中，换另一支吸管吸吹三次，支吸管吸吹三次，其余依次类推。其余依次类推。（可参考（可参考P163-P165）每个稀释度用每个稀释度用2-3个平皿，个平皿，每个平皿加入每个平皿加入1ml稀释液稀释液2、加入加入15ml已熔已熔化的

8、琼脂培养基化的琼脂培养基摇匀、待冷凝倒置培养摇匀、待冷凝倒置培养 3035 48h点数平板上菌落，得出平均菌落点数平板上菌落，得出平均菌落 菌数测定空白对照试验菌数测定空白对照试验 取供试验用的稀释剂各取供试验用的稀释剂各1ml，置，置2-3个个无菌平皿中，分别注入细菌、霉菌无菌平皿中，分别注入细菌、霉菌计数用的琼脂培养基制备成平板，经计数用的琼脂培养基制备成平板，经培养、检查，不得长菌。培养、检查，不得长菌。注意同时要做空白对照！注意同时要做空白对照！3、菌数报告方式菌数报告方式稀释度的选择（稀释度的选择（P163）报告的方式：报告的方式：cfu/ml或或cfu/gcfu (Colony-F

9、orming Units)菌落形成菌落形成单位单位 药典：细菌霉菌（酵母菌）计数：药典：细菌霉菌（酵母菌）计数：以固体供试液为例，供试液以以固体供试液为例，供试液以10倍递倍递增稀释，将匀浆杯中内容物摇匀，取增稀释，将匀浆杯中内容物摇匀，取2-3支灭菌中试管，分别加入支灭菌中试管，分别加入9ml灭菌灭菌稀释剂。另取一支稀释剂。另取一支1ml灭菌吸管，吸取灭菌吸管，吸取供试液供试液1ml，加入第一支试管中，混匀，加入第一支试管中，混匀，制成制成1：100的供试液，以此类推，作的供试液，以此类推，作10倍递增稀释。根据供试品污染的程倍递增稀释。根据供试品污染的程度可稀释至度可稀释至10-3或或10

10、-4，一般取连续，一般取连续三级稀释液检验。三级稀释液检验。取吸管分别吸取取吸管分别吸取1ml 10-1供试液加入供试液加入4平皿中。再取另一支吸管分别取第二平皿中。再取另一支吸管分别取第二级稀释液级稀释液1ml加入加入4个平皿中，第三级个平皿中，第三级稀释液同样操作。将稀释液同样操作。将45左右的营养左右的营养琼脂培养基按每一级稀释液倒入琼脂培养基按每一级稀释液倒入2个平个平皿，每个平皿皿，每个平皿15-20ml，立即摇匀。再，立即摇匀。再取玫瑰红钠琼脂培养基按每一级稀释取玫瑰红钠琼脂培养基按每一级稀释液倒入液倒入2个平皿，同样操作。个平皿，同样操作。细菌数和霉菌数的阴性对照试验：分细菌数和

11、霉菌数的阴性对照试验：分别吸取稀释剂各别吸取稀释剂各1ml加入到加入到4个平皿中，个平皿中，再分别加入营养琼脂培养基和玫瑰红再分别加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基各制成钠琼脂培养基各制成2个平板。个平板。检查细菌的平板倒置于检查细菌的平板倒置于30-35培养箱培养箱中，培养中，培养2天。检查霉菌的平板倒置于天。检查霉菌的平板倒置于25-28培养箱中，培养培养箱中，培养3天。逐日观天。逐日观察并记录结果。阴性对照的平板培养察并记录结果。阴性对照的平板培养后均不得长菌。后均不得长菌。 细菌宜选取平均菌落数在细菌宜选取平均菌落数在30300之间之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。的稀释级作为报

12、告菌数计算的依据。（1）如有如有1个稀释级在个稀释级在30300(30100)之间时之间时,将该稀释级的平均菌落数乘以稀将该稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告；释倍数报告；菌数报告规则菌数报告规则（2）如同时有如同时有2个稀释级在个稀释级在30300(30100)之间时，按下式计算两级比值。之间时，按下式计算两级比值。 高稀释级的平均菌落数高稀释级的平均菌落数稀释倍数稀释倍数比值比值低稀释级的平均菌落数低稀释级的平均菌落数稀释倍数稀释倍数 当比值当比值2时，以两稀释级的均值报告，时，以两稀释级的均值报告，如比值为如比值为25时，说明两级之间存在较时，说明两级之间存在较大差别，应以低稀释级的平均

13、菌落数大差别，应以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。乘以稀释倍数的值报告菌数。 比值大于比值大于5，或出现高稀释级菌数大于，或出现高稀释级菌数大于或等于低稀释级，应查明原因。如试或等于低稀释级，应查明原因。如试液有较强的抑菌作用，就不能象上述液有较强的抑菌作用，就不能象上述一样忽略，必须调整方法。一样忽略，必须调整方法。（3）如同时有如同时有3个稀释级的平均菌落数个稀释级的平均菌落数均在均在30300之间时之间时,以后以后2个稀释级计个稀释级计算级间比值报告；算级间比值报告；（4）如各稀释级的平均菌落数均不在如各稀释级的平均菌落数均不在30300之间，以最接近之间，以最接近30或或

14、300的稀的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；（5）如各稀释级平均菌落数均在如各稀释级平均菌落数均在300以以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告；数报告；（6）如各稀释级平均菌落数均小于如各稀释级平均菌落数均小于30时，时，一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告。倍数报告。（7）如均无细菌生长，报告：）如均无细菌生长，报告：10 测定供试品中霉菌和酵母菌的总数，以测定供试品中霉菌和酵母菌的总数，以判断被检药物被污染的程度。判断被检药物被污染的程度。 方法：营养琼脂倾注平皿计数法。方法：营养琼脂

15、倾注平皿计数法。 培养基：培养基：霉菌及酵母菌霉菌及酵母菌计数用计数用玫瑰红琼玫瑰红琼 脂培养基。脂培养基。 二、霉菌和酵母菌数测定二、霉菌和酵母菌数测定供试药品样品稀释与供试药品样品稀释与“细菌总数细菌总数”相同相同 培养温度：培养温度：25-28 培养时间：培养时间：72小时小时 菌数报告规则菌数报告规则 细菌宜选取平均菌落数在细菌宜选取平均菌落数在30100之间之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。的稀释级作为报告菌数计算的依据。（1）如有如有1个稀释级在个稀释级在30100之间时之间时,将将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；（2）如同时有如同时有2个稀释

16、级在个稀释级在30100之间时，之间时，按下式计算两级比值。按下式计算两级比值。 高稀释级的平均菌落数高稀释级的平均菌落数稀释倍数稀释倍数比值比值低稀释级的平均菌落数低稀释级的平均菌落数稀释倍数稀释倍数 当比值当比值2时，以两稀释级的均值报告，时，以两稀释级的均值报告，当比值当比值2时，以低稀释级平均菌落数时，以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；乘以稀释倍数报告；（3）如同时有如同时有3个稀释级的平均菌落数个稀释级的平均菌落数均在均在30100之间时之间时,以后以后2个稀释级计个稀释级计算级间比值报告；算级间比值报告；（4）如各稀释级的平均菌落数均不在如各稀释级的平均菌落数均不在30100之

17、间，以最接近之间，以最接近30或或300的稀的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；（5）如各稀释级平均菌落数均在如各稀释级平均菌落数均在100以以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告；数报告；（6）如各稀释级平均菌落数均小于如各稀释级平均菌落数均小于30时，时，一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告。倍数报告。三、控制菌的检查三、控制菌的检查 大肠杆菌大肠杆菌 沙门氏菌沙门氏菌 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 白色念珠菌（白色念珠菌（2010版增加）版增加）三、控制菌的检查

18、三、控制菌的检查 样品样品 鉴别培养鉴别培养 增菌培养增菌培养 革兰氏染色、生化试验、血清凝集试验革兰氏染色、生化试验、血清凝集试验可疑菌落可疑菌落 大肠杆菌的检查大肠杆菌的检查样品样品 胆盐乳糖培养基胆盐乳糖培养基曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板 营养琼脂培养基斜面营养琼脂培养基斜面革兰氏染色革兰氏染色 乳糖发酵试验靛基质试验乳糖发酵试验靛基质试验 甲基红试验等甲基红试验等可疑菌落可疑菌落 CFU (Colony-Forming Units)CFU (Colony-Forming Units)菌落形成菌落形成单单位位将将稀稀释释后的一定量的菌液通后的一定量

19、的菌液通过浇过浇注或涂布的注或涂布的方法，方法，让让其其内内的微生物的微生物单细单细胞一一分散在胞一一分散在琼琼脂平板上，待培脂平板上，待培养养后，每一活后，每一活细细胞就形成一胞就形成一个个菌落。菌落。 结果判断结果判断细菌菌落数、霉菌和酵母菌菌落数、细菌菌落数、霉菌和酵母菌菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度控制菌三项均符合该品种微生物限度项下规定，应判供试品合格；其中任项下规定，应判供试品合格；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不合格。供试品不合格。 细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数第一次测定超过该品种微生物限

20、度项第一次测定超过该品种微生物限度项下规定时，应从同一批号样品中随机下规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试抽样，复试2次，取次，取3次结果平均值报次结果平均值报告。告。眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试报告，须以报告，须以2次复试结果均不得长菌，次复试结果均不得长菌，方可判供试品合格。方可判供试品合格。 如营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵如营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵母菌）菌落数或玫瑰红钠琼脂培养基母菌）菌落数或玫瑰红钠琼脂培养基平板生长细菌菌落数超过该品种微生平板生长细菌菌落数超过该品种微生物限度项下规定时，经复试物限度项下规定时，经复试2次，如次，如3次结果平均值仍超过规定，应判供试次结果平均值仍超过规定，应判供试品不合格。品不合格。各类制剂检出控制菌或其他致病菌时各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再抽样复，按一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判该供试品不合格。试，即应判该供试品不合格。以小组为单位以小组为单位,对样品进行细菌总数及霉菌总对样品进行细菌总数及霉菌总数的检测数的检测,最后出具一份检测报告最后出具一份检测报告.时间安排时间安排: 每班分两大组，每组分每班分两大组，每组分