蛋白质分分离纯化和表征2010

1、第七章 蛋白质的分离纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的分子大小与分子量的测定三、胶体性质与蛋白质的沉淀四、蛋白质的变性与复性五、蛋白质分离纯化的一般原则六、蛋白质的分离纯化方法 七、蛋白质的含量测定与纯度一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高，则解离情况相反。 等电点（pI）: 在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一pH 称为该蛋白质的等电点（pI）。几种蛋白质等电点几种蛋白质等电点 等电等电pH并不是

2、一个恒定的值，它会因溶液并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。 等离子点等离子点(isoionic piont): 蛋白质在纯水蛋白质在纯水溶液中的带电状态则没有其他离子干扰，完全由溶液中的带电状态则没有其他离子干扰，完全由H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数。离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数。二、蛋白质的分子大小与分子量的测二、蛋白质的分子大小与分子量的测定定蛋白质的分子量的范围：蛋白质的分子量的范围：6 610103 31 11

3、0106 6 Da Da。（一）根据化学组成测定最低相对分子量 用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。 例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%,计 算二者的相对分子质量。 最低相对分子量 x 100 =铁的百分含量 铁的原子量0.335 55.8x 100=16700测定蛋白质相对分子量的原理和方法也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原理计算蛋白质的最低分子量。（二）渗透压法测定相对分子量（二）渗透压法测定相对分子量 渗透压法测定Mr操作简单， Mr在10-100 kDa时较准，但不能区别蛋白质分子

4、是否均一 。 渗透压公式： Mr =RTlimc0c(c=质量浓度，g/mol)渗透压法测定Mr法的缺点：不能确定溶液蛋白质分子是否均一。（三）沉降分析测定（三）沉降分析测定Mr 在强大的离心场中，如果蛋白质溶液的密在强大的离心场中，如果蛋白质溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白质会发生沉度大于溶液密度，溶液中的蛋白质会发生沉降。降。 沉降速度决定于蛋白质的分子量、分沉降速度决定于蛋白质的分子量、分子密度、分子形状和溶剂的密度、粘度。子密度、分子形状和溶剂的密度、粘度。 沉降系数（沉降系数（20,w）：单位离心场强度）：单位离心场强度时的沉降速度。定义时的沉降速度。定义110-13秒（斯维得秒

5、（斯维得贝格单位）。贝格单位）。 Mr = RTSD(1V) 沉降速度法其中:S:是沉降系数D:是扩散系数:是溶剂的密度 v:是蛋白质的偏微分比容。 将纯的分析样品放于离心池中，进行 低速度长时间 离心，样品颗粒沉降形成浓度差， 而扩散又使样品 颗粒由高浓度区向低浓度区扩散, 最终达到沉降与扩 散的平衡状态。Mr = 2RTln(C2/C1)2(1V)(x22x12) 沉降平衡法（四）凝胶过滤法测定（四）凝胶过滤法测定Mr 凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术进行分离的技术，同时可以测定蛋白质分子量。同时可以测定蛋白质分子量。蛋白质通过凝胶

6、柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:先测得几种标准蛋白质的Ve Ve （VeVe为洗脱体积） ，并以其分子量对数对VeVe作图得一直线，再测出待测样品的VeVe，查标准曲线即可确定分子量，并以其分子量对数对VeVe作图得一直线，再测出待测样品的VeVe，查标准曲线即可确定分子量。LogMLogMA AB BC CLogMLogM测V V测（五）（五）SDS-PAGE法测定法测定Mr 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同

7、。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。带净电荷以及分子量和形状有关。 当电泳体系中含有一定浓度的十二烷当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS-PAGE）0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD300200

8、10080605040302010Migration (Rf)Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis1蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100 nm)。又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。 蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素： l 双电层l 水化层 a. 丁达尔效应 b. 布朗运动 c. 不能透过半透膜三、胶体性质与蛋白质的沉淀2蛋白质的沉淀 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀

9、现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用。 盐析法（salting out） ： 中性盐（NH4SO4，NaSO4，NaCl等） 蛋白 质脱去水化层。 优点：不引起蛋白质变性。 盐溶（salting in）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增 加的现象。 有机溶剂沉淀法： 极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）脱去水 化层以及降低介电常数 而增加带电质点间的相 互作用。 条件：低温操作，缩短时间。 重金属盐沉淀法：当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等) 生成沉淀。 生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类试剂。 当溶 液pHpI,蛋白质颗粒

10、带负电荷,易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等) 生成沉淀。 生物碱试剂和某些酸类沉淀法： 生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类试剂。 当溶 液pHpI时,蛋白质颗粒带正电荷 易与生物碱试剂, 酸根负离子反应沉淀 用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质l 旋光值改变l 特性粘度增加l 溶解度降低l 扩散系数降低l 结晶能力丧失l 易于沉淀，若加热还会凝固。但若远离等电点 则不一定沉淀l 变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化3.变性后蛋白质的表现凝胶过滤法 凝胶过滤（层析）是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分

11、离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N, N-甲叉双丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH( )n( )n( )m( )m聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS-PAGE）0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD30020010080605040302010Migration (Rf)Pha