蛋白质相互作用技术VIP

1、常用蛋白质相互作用技常用蛋白质相互作用技术介绍术介绍SPR技术分析蛋白质相互作用体外转录和翻译 coupled transcription/translation reaction 偶联的转录和翻译过程 continuous exchange cell-free (CECF) principle 持续交换和非细胞体系的原理 偶联的转录和翻译过程T7-RNA polymeraseT7-RNA polymeraseE.coliE.coli lysate lysategeneDNADNAcoupled transcription / coupled transcription / translati

2、ontranslationproteinproteingene持续交换和非细胞体系的原理T7 RNA polymeraseTranslation machinery E. coliEnergy regenerating systemProteinDNA templateAmino acidsEnergy substratesBuffer componentsNTPsSupplySupplyAmino acidsEnergy substratesBuffer componentsNTPsSupplySupplyInhibitory by-productsInhibitory by-product

3、sInhibitory by-productsInhibitory by-productsmembranemembranemembranemembrane供给腔 反应腔 供给腔microtiter-platePCR tubesRTS 500devicesmicrocentrifugetubes4x12 4x12 RTS 100RTS 1008x 8x 96x 96x RTS 100RTS 100RTS500 RTS500 反应装置reaction chamberfeeding chamberwithsemipermeable membranesRTS 500 ProteoMaster E. c

4、oli HY Kit 质谱 X射线结晶学核磁共振 结构生物学的蛋白标记the amino acids and methionine are both provided separately from all other kit reagentsother desired aminoother desired amino acidsacids can be exchanged by using the RTS Amino Acid SamplerRTS Amino Acid Sampler in combination with the RTS 500 HY RTS 500 HYRTS 500

5、HYMethionine specific labeling of proteins is possible by substituting the substituting the methioninemethionineor结构分析GST融合蛋白鉴定蛋白质相互作用GST PULL-DOWN：通过与GST融合蛋白质探针蛋白质相互作用从可溶性蛋白质库中亲和纯化一个未知蛋白质，再通过GST与谷光苷肽偶联球珠的结合收集相互作用蛋白质，从而分离出蛋白质复合物。 1 含有表达质粒的细菌培养；2 诱导表达；3 收集菌体；4 加蛋白酶抑制剂，冰上破碎细胞；5 离心取上清，按1：1的比例加谷光苷肽琼脂糖球珠

6、，在4C，温和混匀30分钟；6 离心收集琼脂糖球珠，用PBS轻轻混匀悬浮，反复三次；7 将混合物装柱，让PBS流出；8 加还原性的GSH将融合蛋白洗脱；9 SDS-PAGE检测蛋白质纯化情况。注意：绝大部分工作应在注意：绝大部分工作应在4C4C进行；对照？进行；对照？GST融合蛋白纯化基本程序免疫共沉淀鉴定蛋白质相互作用当细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内许多蛋白质之间的结合保持下来，因而可以据此检测生理条件下相关蛋白质间的相互作用。如果蛋白质X用其抗体免疫沉淀，在细胞内与X稳定结合的蛋白质Y也可能沉淀下来。蛋白质Y的沉淀是基于与X的物理相互作用，被称为免疫共沉淀。注意：绝大部分工作应在注意

7、：绝大部分工作应在4C4C进行；对照？进行；对照？串联亲和纯化鉴定蛋白质相互作用和蛋白质复合体Tandem affinity purification-TAP将靶蛋白与蛋白质标签融合并在天然宿主细胞中表达，制备提取物，然后采用标准的两步法重获靶蛋白及与其相互作用的蛋白质组份。成像的方法鉴定蛋白质相互作用；噬菌体表面展示鉴定蛋白质相互作用；原子力显微镜检测蛋白质相互作用；计算机方法；化学交联技术鉴定蛋白质相互作用等等。其它方法microtiter-platePCR tubesRTS 500devicesmicrocentrifugetubes4x12 4x12 RTS 100RTS 1008x 8x 96x 96x RTS 100RTS 100RTS500 RTS500 反应装置reaction chamberfeeding chamberwithsemipermeable membranesRTS 500 ProteoMaster E. coli