DNA超螺旋基因组染色体实用教案

1、Superhelix of SV40 DNA (Vinograd, 1965)一、 DNA超螺旋（superhelix or supercoil）第1页/共40页第一页，共41页。DNA超螺旋结构(jigu)Linear DNA. LOpen Circle DNA OC relexed formSupercoiled circle(高级(goj)结构)Covalent Closed Circle CCC指双螺旋环状分子(fnz)再度螺旋化即成为超螺旋结构。第2页/共40页第二页，共41页。超 螺 旋 形 成 示 意末端(m dun)固定的线型双螺旋额外的张力不能释放(shfng)双螺旋以扭曲方

2、式缓解应力，形成超螺旋第3页/共40页第三页，共41页。二、 DNA超螺旋的方向性松弛（relaxed）状态(zhungti)： DNA在水溶液中, 构型偏B型状态(zhungti)。DNA以10.5 bp/helix为最稳定构型。正超螺旋：小于10.5bp/helix，则其二级结构处于紧缩(jn su)状态，由此产生的超螺旋为正超螺旋。 负超螺旋：大于10.5bp/helix，则其二级结构(jigu)处于松缠状态，由此产生的超螺旋为负超螺旋。 由此可见，超螺旋总是要向着抵消初级螺旋改变的方向发展；双螺旋DNA的松开导致形成负超螺旋；而DNA的拧紧，则导致形成正超螺旋；所有的超螺旋都比松弛型含

3、有更多的自由能。 第4页/共40页第四页，共41页。拓扑学(topology)是研究(ynji)几何图形在平面位置关系不变情况下空间结构变化规律的数学分支。三、DNA超螺旋拓扑学定义(dngy)实验证明，细胞内的DNA存在拓扑异构现象(topoisome)，即在保持DNA一级和二级结构不变的情况下，两条单链可以相互缠绕，形成(xngchng)不同的空间构型。第5页/共40页第五页，共41页。超螺旋发生(fshng)的规律Vinograd. J (1968)Vinograd equationL = T + W ( = + )L Linking number ( 双 链 D N A 的 交 叉(j

4、ioch)数)T Twisting number (双链DNA的缠绕数，初级(chj)螺旋圈数，即DNA分子中的Watson-Crick螺旋周数，其数值可直接在处于最稳定状态下的双链环形（或超螺旋形式）DNA中的实际螺旋周数计数得到，不一定是整数)W Writhing number (直观上为双螺旋数, 可为小数)W= 负值（negative superhelix）W = 正值 ( positive superhelix） Non-breaking Non-unwinding Non-overwindingL为定值，整数第6页/共40页第六页，共41页。l B-DNA是力学上稳定(wndng)

5、的结构（ 10 bp/ helix）l 虽交叉数减少，但需转换为一种应力，以维持(wich)10bp/helix的螺旋数，l 应力(yngl)的重新分配 或在B-DNA状态中保留一单链区或螺旋力将维持B-DNA的右旋结构, 形成超螺旋 420bpL=42T=42W=0无应力松弛状态应力的分配L = 36T = 36W = 0L = 36T = 42W = -6 链松弛后再结成环链未松弛再结成环松开6圈螺旋L = 6第7页/共40页第七页，共41页。2比连系差（Specific linking difference） = Lk Lk0 = Lk- Lk0 Lk0 能够根据DNA分子(fnz)Lk

6、的改变描述螺旋不足（超螺旋），也叫超螺旋密度（superhelix density）。 第8页/共40页第八页，共41页。DNA分子形成超螺旋的生物学意义(yy)：1 超螺旋DNA具有更紧密地形状，因此在DNA组装中具有重要作用；2 DNA的结构具有动态性，DNA超螺旋程度的改变介导了这种结构的变化，这有利于其功能的发挥。3 DNA是一种热力学上的稳定结构，超螺旋的引入提高了他的能量水平。第9页/共40页第九页，共41页。拓扑异构体(topoisomer)：具有(jyu)不同连接数的同一种DNA分子称为DNA拓扑异构体。四、DNA拓扑(tu p)异构体与拓扑(tu p)异构酶拓扑异构酶(top

7、oisomerase) 作用方式：拓扑异构酶与DNA共价(n ji)结合形成中间体，使磷酸二酯链暂时断裂形成切口，DNA分子的一条单链或双螺旋穿越另一条单链或双螺旋，改变其拓扑状态，但一级和二级结构并无变化。即在保持DNA一级和二级结构不变的情况下，两条单链可以相互缠绕，形成不同的空间构型。拓扑异构酶(topoisomerase) 细胞内存在着一类能催化DNA拓扑异构体相互转化的酶，称为拓扑异构酶。或者说，能改变DNA拓扑联系数的酶就叫拓扑异构酶。第10页/共40页第十页，共41页。型酶在两条单链上都产生切口，每次作用使连接数改变(gibin)2。在型酶的作用是增加负超螺旋数，或减少正超螺旋数

8、，在真核生物中还有减少负超螺旋的作用。 拓扑(tu p)异构酶分为型和型两类。拓扑异构酶的生物学功能 消除(xioch)DNA复制和转录等过程产生的正负超螺旋。在细胞中，型酶与型酶的活性保持一种平衡状态，型酶使DNA超螺旋化的作用为型酶使DNA松驰化的作用所抗衡，从而使DNA保持适当的超螺旋密度。型酶在DNA的一条单链上产生切口，使另一条单链得以穿越，每作用一次使DNA连接数改变1；原核生物中，型酶只作用于负超螺旋DNA，减少负超螺旋数，使其松弛；在真核生物中，型酶还可以作用于正超螺旋DNA，减少正超螺旋数。第11页/共40页第十一页，共41页。Top I (swivelase, niking

9、-closing enzyme) Breakage & rejoining of S.S. DNA at phospho-diester bonds松弛(sn ch)B-双螺旋消除(xioch)负超螺旋CCC OC onlyNo ATP, NADattach Negative supercoilGet energy from Negative supercoil第12页/共40页第十二页，共41页。图3.30 型拓扑(tu p)异构酶作用机理Function Mechanism of Topoisomerase I第13页/共40页第十三页，共41页。Top II (gyrase) A

10、TP neededCutting & ligation of D. S. DNAtetramer 紧缩B-双螺旋引入负超双螺旋Cut D.S. DNAATPLigateAABB第14页/共40页第十四页，共41页。Function Mechanism of Topoisomerase II 第15页/共40页第十五页，共41页。2-2 基因(jyn)和基因(jyn)组一、基因(jyn)、基因(jyn)组的概念二、基因(jyn)组的大小与C值矛盾三、基因(jyn)组的复性动力学四、重复序列五、真核与原核生物基因(jyn)组比较第16页/共40页第十六页，共41页。指DNA分子所携带遗传信

11、息总和(zngh)，即指一个细胞所有基因和基因间DNA的总和(zngh)，称基因组。遗传学定义为：一个物种的单倍体的染色体的数目为该物种的基因组。在真核生物(shngw)中，每种生物(shngw)的单倍体基因组的DNA总量是恒定的，称之为C值。一、基因(jyn)、基因(jyn)组的概念产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列，在遗传学上也称顺反子（cistron）。 (二)基因组(三)C值一个单倍体基因组中DNA的总量(一)基因第17页/共40页第十七页，共41页。霉菌藻类G+细菌G-细菌显花植物鸟类哺乳类爬行类两栖类硬骨鱼类软骨鱼类赖皮类甲壳类昆虫类软体动物蠕虫类真菌枝原体C val

12、ue paradoxof nucleotide A 生 物 体 进 化(jnhu)程度高低与C值的相关性不强 B 亲缘(qn yun)关系相近的生物C值相差较大 低等生物(shngw)单倍体基因组DNA的含量与生物(shngw)复杂性呈正相关，但高等生物(shngw)这种关系并不一致。第18页/共40页第十八页，共41页。真核生物 DNA 染色体数 （2C） （2N）两栖鲵 168.0 pg 24肺鱼 100 38蝾螈 85.3 24警蛙 28.2 24牛 6.4 60人 6.4 46绵羊 5.7 54果蝇 0.2 8贝母(bi m) 196.7 24豌豆 28 12玉米 11 20原核生物(

13、shngw) DNA （C）Salmonella 0.0143 pg(沙门氏菌)T2 174这种形态学的复杂程度与C值大小(dxio)的不一致称为C值矛盾。第19页/共40页第十九页，共41页。三、基因组的复性(f xn)动力学 Hydroxyapatite column 羟基(qingj)磷灰石柱Low C of PHigh C of Prelease D.S. DNA absorb D.S. DNA第20页/共40页第二十页，共41页。复性发生(fshng)的过程的讨论dCt / dt = -KC2 反应(fnyng)初始 t = 0 单链DNA的随机碰撞(pn zhun) 过程（ ran

14、domly collision ）（二级反应动力学）单链 DNA浓度 = C0反应达 t 时单链DNA浓度 = Ct 两条部分同源(小于20dNt)的S.S. DNA, 在复性过程中形成的部分双链区是不稳定的第21页/共40页第二十一页，共41页。 dCt / dt = -KCt2 积分(jfn) Ct / C0 = 1 / 1+KC0t 当 Ct / C0 = 1/2 时Ct / C0 = 1/2 = 1 / 1+ KC0t(1/2)K = 1 / Cot(1/2)Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 任一DNA分子(fnz)达到Ct / C0 = 的速率是定值第22页

15、/共40页第二十二页，共41页。0101C0t(1/2) C0t(1/2) Fraction reassociated在控制反应条件相同的前提(qint)下, 两种DNA分子的C0t(1/2)值,取决于dNt 的排列复杂性 。 AAAAAAAA K. C. = 1 C0t(1/2) = 210-6ATCGATCGATCG K.C. = 4 K.C. = 5 105 C0t(1/2) = 1( 复性(f xn)动力学的复杂性，Kinetic complexity，K.C )第23页/共40页第二十三页，共41页。第24页/共40页第二十四页，共41页。Eukaryotic genomes hav

16、e several sequence components第25页/共40页第二十五页，共41页。变性程度 部分变性的DNA可直接通过拉链作用迅速复性(f xn)，而完全变性的DNA一般需要几个小时才能复性(f xn)。 除温度、离子强度、pH等变性条件外，影响(yngxing)复性的因素有：DNA的浓度 浓度越大有效碰撞(pn zhun)的频率越高。DNA分子大小 越小的分子复性越快。DNA复杂性(complexity) 指最长的没有重复序列的核苷酸对数之和。ATATATATATAT的复杂性为2；ATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCATGC的复杂性为4；ATGCATGCC

17、TCAGTATGCATGCATGC的复杂性为10；ATGCTGACGTAGCA的复杂性为14。序列复杂的DNA更容易发生非对应配对，所以复杂性越高的DNA复性越困难。第26页/共40页第二十六页，共41页。（Highly repetitive sequence）四、重复(chngf)序列单一(dny)序列（Unique sequence） 主要是蛋白质编码(bin m)基因。（Moderately repetitive sequence）包括rRNA、tRNA、组蛋白的编码基因。研究较多的是Alu家族。长度不到10bp，多是串联集中分布，一般不转录。有些AT含量很高的高度重复序列，在离心时常会

18、在主要的DNA带的上面有一个次要的DNA带相伴随，这就是所谓的“卫星DNA”第27页/共40页第二十七页，共41页。 着丝点（centromere）功能必需的DNA序列约130bp长，并富含A=T碱基对；在着丝点附近，还有高度重复的卫星DNA。 端粒（telomere）顺序(shnx)长约100bp，起到稳定染色体的作用。是由： 5(Tx Gy)n x约为14 3(Ax Cy)n y约为18反向重复(chngf)序列（Inverted repetitive sequence） 又称回文序列(xli)（Palindrome）,易形成发夹结构，在DNA双链中可能形成十字形结构。 CATGAACGT

19、CCTATTGTCGGACGTTCTGA GTACTTGCAGGATAACAGCCTGCAAGACT第28页/共40页第二十八页，共41页。基因家族：真核生物基因组中有许多来源相同、结构相似(xin s)、功能相关的基因，这样一组基因称为基因家族。（4）有些可以编码蛋白质，在某些(mu xi)基因的转录中作为调控成分。五. 断裂基因（split gene）也叫不连续(linx)基因，指在真核生物中，大多数编码蛋白质的基因是不连续(linx)的，即基因的编码序列之间插入了不编码的序列，称为断裂基因。内含子的意义：（1）可能是遗传的残留物。（2）Walter Gilbert假说：是使蛋白质进化过程

20、的残迹。（3）可以保护基因家族中基因的完整性。第29页/共40页第二十九页，共41页。五、真核与原核(yun h)生物基因组比较（ P78 ） 作为(zuwi)总结性的问题，课后总结。同时掌握断裂基因、假基因、内含子、外显子的概念。第30页/共40页第三十页，共41页。2-3染色体第31页/共40页第三十一页，共41页。2-3染色体一、组成(z chn)1. 核小体（nucleosome）：染色质是由重复(chngf)单位构成的，每个重复(chngf)单位由约200bp的DNA和H2A、H2B、H3、H4各两分子组成，这个重复(chngf)单位叫核小体。2. 组蛋白（histone）五种： H

21、1、H2A、H2B、H3、H4。呈碱性。除了H1以外，其余四种有相互作用形成聚合体的趋势。它们通过(tnggu)C端的疏水氨基酸相互结合，而N端的碱性氨基酸则向四面伸出以便与DNA分子相互作用。第32页/共40页第三十二页，共41页。3.构成：每个核小体含8个组蛋白；200bp DNA中，146bp 紧紧缠绕着组蛋白，其余用于连接两个核小体，称为(chn wi)连接DNA（linker DNA）。H1通常和连接DNA相结合，把核小体“封锁”起来。第33页/共40页第三十三页，共41页。4. 核小体包装的高级(goj)形式第34页/共40页第三十四页，共41页。第35页/共40页第三十五页，共4

22、1页。第36页/共40页第三十六页，共41页。（1）核小体（压缩比为7，200bp长为68nm，压缩后为10nm ） （2）30nm的核小体纤维（30nm fiber，压缩比为40）。（3）染色体DNA的某一部分和“核骨架”（nuclear scaffold）相连，把染色体DNA隔成许多含20000至100000碱基对的DNA环。（4）约6个环与核骨架形成一个(y )梅花结，每30个梅花结形成一盘。一条染色单体大约有10盘。4. 核小体包装的高级(goj)形式第37页/共40页第三十七页，共41页。染色体模型基于的原理：真核染色体DNA包装好象是一次缠绕(chnro)再接一次更高级的缠绕(chnro)。即在螺旋上形成螺旋，再形成螺旋。第