讲义2 基因诊断

1、 基因诊断基因诊断Gene Diagnosis 疾病的根本原因: 疾病的各种表型的改变 是基因的改变造成的基因诊断基因诊断: 采用分子生物学的技术方法分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构某一特定基因的结构(DNA(DNA水平水平) )或功能功能(RNA(RNA水平水平) )是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。是病因的诊断。是病因的诊断。 检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。疾病作出诊断的方法和过程。基因诊断(Gene Diagnosis)的含义基因诊断的原理1、基因诊断的原理：DNA诊断-检测相关基

2、因的结构及其表达功能是否正常。RNA诊断-对表达产物mRNA质和量表 达的分析。第一节第一节 基因诊断的技术方法基因诊断的技术方法一、基因诊断中常用的分子生一、基因诊断中常用的分子生物学技术物学技术 核酸分子杂交核酸分子杂交 PCR SSCP（PCR-SSCP） 限制酶酶谱分析限制酶酶谱分析 DNA序列测定序列测定 DNA芯片技术芯片技术印迹技术的类别及应用印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体、重组质粒和噬菌体的分析。的分析。(不仅可以检出特异的不仅可以检出特异的DNA片段，而且能进行定片段

3、，而且能进行定位和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分位和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等析等)（二）（二）RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 Southern 印迹杂交用于基因探测的基本过程印迹杂交用于基因探测的基本过程 Southern印迹杂交常用于探测印迹杂交常用于探测DNA的限制性内切的限制性内切酶图谱。通过检测某个体特定基因及旁

4、侧区域限制性酶图谱。通过检测某个体特定基因及旁侧区域限制性内切酶图谱的变化，可判断是否发生了明显的内切酶图谱的变化，可判断是否发生了明显的DNA突变。具体方法图示如下突变。具体方法图示如下：组织或细胞 含已知基因的重组质粒菌株 基因组DNA 质粒DNA 限制酶酶解及电泳分离 限制酶酶解及电泳分离回收含已知基因的DNA片段 转移到硝酸纤维膜或尼龙膜 标记的探针 预杂交杂交 洗膜 放射自显影 图图 用用Southern 印迹杂交方法进行基因诊断的基本步骤印迹杂交方法进行基因诊断的基本步骤 三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较分子杂交实验分子杂交实验目目 录录放放射射自自显显影影照照片片目目 录录核

5、酸分子杂交核酸分子杂交制备样品制备样品制备探针制备探针杂交杂交检测检测获得满意的高特异性杂交的关键是获得满意的高特异性杂交的关键是控制好杂交条件和杂交后冲洗条件控制好杂交条件和杂交后冲洗条件获得满意的高特异性杂交的关键是控制好杂交条件和获得满意的高特异性杂交的关键是控制好杂交条件和杂交后冲洗条件。杂交双链的稳定程度主要由其杂交后冲洗条件。杂交双链的稳定程度主要由其Tm值（熔解温度）决定。影响杂交双链值（熔解温度）决定。影响杂交双链Tm值的因素包值的因素包括以下几个方面：括以下几个方面：1)杂交双链的碱基组成。GC含量越高，Tm越高。2)杂交双链的长度。越长，Tm越高。3)杂交双链的碱基错配程度

6、。错配程度越低，Tm越高。4)溶液中的离子强度。离子强度越高，Tm越高。5)变性剂（如常用的甲酰胺）的影响。甲酰胺浓度越高，Tm越高。 在液相体系中，完全配对的核酸双链的Tm值可以下列公式估计： DNA/DNA Tm(0C)81.5 + 0.41(G-C)% + 16.6logM 0.63甲酰胺(%) 600/LDNA/RNATm(0C)79.8 + 0.58(G-C)% + 18.5logM + 11.8(G-C)%2 0.50甲酰 胺(%) 820/LRNA/RNATm(0C)79.8 + 0.58(G-C)% + 18.5logM + 11.8(G-C)%2 0.35甲酰胺(%) 820

7、/L寡聚核苷酸Tm(0C)2（AT碱基对数） 4（GC碱基对数） （适用于1030bp）Tm(0C)81.5 + 0.41(G-C)% + 16.6logM600/L （适用于1470bp） 其中M为单价阳离子（通常为Na+）浓度, L为杂交双链的长度，以碱基对计算。这些公式适用于0.010.4mol/L Na+浓度及3075GC。 在无变性剂存在的条件下，最适杂交发生在比DNA/DNA Tm低20250C，比DNA/RNA Tm 低10150C。 在固液体系中，杂交条件对杂交双链Tm值的影响更为复杂，一般低于按上述公式得到的计算值。(二二) 聚合酶链式反应聚合酶链式反应5 Primer 15

8、 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 （1 1）、基本工作原理）、基本工作原理目目 录录Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ （2 2）、）、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分（3 3）、）、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火

9、退火Tm-5C（三）、单链构象多态性（三）、单链构象多态性(SSCP) 分析分析PCR和单链构象多态性和单链构象多态性(single stranded conformation polymorphism, SSCP) 分析分析 把把 PCR后获得的双股后获得的双股DNA加热变性后形成单链加热变性后形成单链DNA，相同长度的相同长度的DNA单链由于碱基顺序不同，它们在中性聚丙烯单链由于碱基顺序不同，它们在中性聚丙烯酰胺凝胶中可有不同的构象而导致电泳速度的不同，这种现酰胺凝胶中可有不同的构象而导致电泳速度的不同，这种现象称为单链构象多态性。象称为单链构象多态性。 PCR产物变性后经由产物变性后经由

10、SSCP分析，可能有效的检出分析，可能有效的检出DNA顺顺序变异。不是所有的核苷酸序列改变都引起可检测的单链构序变异。不是所有的核苷酸序列改变都引起可检测的单链构象改变，因此象改变，因此SSCP方法并不能鉴别所有的突变。方法并不能鉴别所有的突变。PCR/单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCP）PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，可分析确定致病基因的存在。 四、限制酶酶谱分析四、限制酶酶谱分析基因突变导致酶切位点的丢失或相对位基因突变导致酶切位点的丢失或相对位置发生改变置发生改变 以此酶消化待测以此酶消化待测DNA和野生型对照和野生型对照DNA，通

11、过比，通过比较二者的酶切片段，的长度，数量上的差异就可较二者的酶切片段，的长度，数量上的差异就可判断待测判断待测DNA的突变情况。的突变情况。 DNA序列测定序列测定 是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法。不仅是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法。不仅可确定突变的部位，而且可确定突变的性质。可确定突变的部位，而且可确定突变的性质。 分子克隆到分子克隆到T载体上，或直接对扩增产物进行测序。载体上，或直接对扩增产物进行测序。 DNA芯片芯片(DNA chip) cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固

12、定于单位段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。（六）（六） DNA芯片技术芯片技术基因芯片基因芯片(gene chip)目目 录录二、基因诊断的基本方法二、基因诊断的基本方法基因变异致病的类型：基因变异致病的类型：1. 内源基因的变异内源基因的变异基因结构的突变基因结构的突变点突变、插入、缺失、重排、异位、点突变、插入、缺失、重排、异位、基因扩增，基因扩增，基因表达异常基因表达异常mRNA剪接异常剪接异常2. 外源基因的插入外源基因的插入基因突变的诊断基因突变的诊断1.点突变的诊断点突变的诊断诊断已知的点突变诊断已知的点突变 （PCR/ASO） ASO alle

13、le specific oligonucleotide等位基因特异性寡核苷酸探针等位基因特异性寡核苷酸探针突变碱基置探针中央突变碱基置探针中央控制杂交条件控制杂交条件 结果分析：结果分析：A TC G 探针定位 正常 C T (纯合子) C T C G C A(杂合子) （新突变） （新突变）诊断未知的突变诊断未知的突变 PCR/SSCP/测序测序DNA芯片技术（大规模未知突变的筛芯片技术（大规模未知突变的筛查）查）N 4n1.28平方平方cm 16000个寡核苷酸个寡核苷酸 2 .大片段丢失或插入的诊断大片段丢失或插入的诊断外侧确定有无缺失及缺失片断的相对大小外侧确定有无缺失及缺失片断的相对

14、大小内侧确定缺失部位内侧确定缺失部位.多态性连锁分析多态性连锁分析DNA多态性多态性在同种生物不同个体的在同种生物不同个体的基因组中，常存在一些不影响基因功基因组中，常存在一些不影响基因功能的能的DNA顺序变异，称为顺序变异，称为DNA多态性多态性（polymorphism）DNA多态性标记多态性标记1. 限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP)2. 短串联重复序列（短串联重复序列（short tandom repeat, STR）3. 单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（single nucleot

15、ide polymorphism, SNP）1.限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）DNA酶切酶切Southern杂交分析杂交分析DNAPCR 酶切酶切电泳分析电泳分析2.由串联重复顺序导致的长度多态性由串联重复顺序导致的长度多态性STR含有较高的信息量且容易检测含有较高的信息量且容易检测STR由由26个核苷酸串联重复组成，微卫星个核苷酸串联重复组成，微卫星DNA基因表达异常的诊断基因表达异常的诊断1.mRNA的相对定量分析的相对定量分析斑点杂交斑点杂交RTPCR2.mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析RTPCR/竞争性竞争性PCR(50bp标准标准cDNA已知浓度已知浓度)

16、3.mRNA长度分析长度分析Northern杂交杂交/ RTPCR产物电泳产物电泳 外源外源DNA检测检测 核酸分子杂交核酸分子杂交 PCR技术技术 许多病原体的基因结构已被阐明，设计基因特异性探许多病原体的基因结构已被阐明，设计基因特异性探针，或合成特异的寡核苷酸引物，可直接从临床标本针，或合成特异的寡核苷酸引物，可直接从临床标本中检测病原体基因组核酸中检测病原体基因组核酸(DNA或或RNA)的存在，即可的存在，即可早期、快速、敏感、特异地确定病原体的存在。早期、快速、敏感、特异地确定病原体的存在。第二节第二节 基因诊断的应用基因诊断的应用1、遗传疾病2、感染性疾病（1）病毒性感染（2）细菌

17、性感染（3）寄生虫（4）其他3、恶性肿瘤4、法医学中的应用（1）DNA指纹分析（DNA fingerprinting）（2）短串联重复多态性分析（short tandem repeat，STR）一、遗传性疾病一、遗传性疾病 Hb D Punjab血红蛋白病血红蛋白病 121位位co密码子由密码子由GAA突变位突变位CAA，该突变导致限制酶，该突变导致限制酶EcoR1位点消失（位点消失（GAATTC） 镰刀型红细胞贫血症：镰刀型红细胞贫血症： 第六位密码由第六位密码由GAG突变成突变成GTG,导致不能被导致不能被OxaN1酶切酶切Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)5 3 正常基因正常基因5

18、 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析OxaN10.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 遗传性疾病遗传性疾病-DMD的分子诊断的分子诊断杜氏肌营养不良症（Duchene muscular dystrophy,DMD）X染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病,发病率为1/3 500个男孩，是 一种高发病率、高致残、高致死的X染色 体连锁的遗 传性疾病。DMD基因位于Xp21.2-21.3，全长2400Kb

19、 DMD基因的突变导致抗肌萎缩蛋白dystrophin缺陷DMD基因外显子缺失的检测二、感染性疾病基因二、感染性疾病基因诊断的策略诊断的策略1.针对病原体特异的核酸序列设计探针针对病原体特异的核酸序列设计探针进行杂交进行杂交2.应用应用PCR技术扩增病原体基因保守序技术扩增病原体基因保守序列列3.核酸杂交技术与核酸杂交技术与PCR技术联合应用技术联合应用SARS相关冠状病毒的分子诊断 20032003年年4 4月，香港研究者月，香港研究者PeirisPeiris等报等报 告了告了50 50 例例SARSSARS病人的临床表现和病人的临床表现和 病毒学研究结果证明，新冠状病毒病毒学研究结果证明，

20、新冠状病毒 可能是可能是SARSSARS的致病原因。的致病原因。 （Lancet, 2003, 361: 9365)Lancet, 2003, 361: 9365) 其它实验室陆续得出相同结论。其它实验室陆续得出相同结论。 2003年4月，德国汉堡Bernhard- Nocht热带医学研究所学者 Drosten 等用随机扩增技术，获得长度为 300 bp的核苷酸序列。 根据这段序列，建立了检测新冠状 病毒的常规和实时定量PCR技术。（.org on April 10, 2003）引物和探针 BNIoutS2-BNIoutAs BNI-1片段，189 bp BNIinS-BNIinAs BNI-

21、1片段的内套片段，108bp BNITMSARS1BNITMSARAs2 BNITMSARP(荧光素标记的探针） 产物长度：77 bp 检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺 泡灌洗液 、血浆、粪便。 检测方法 逆转录-巢式PCR 讨 论 疾病的早期即可获得阳性结果（早 于血清转换期）。 特异性较高（SARS患者中的阳性 率约为80%，对照中的阴性率约为 98%100%）。 现有的方法敏感性较差，阴性结果 不能排除病毒感染。讨 论痰液中病毒RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道 排放是主要传播途径。血清中检测到极低浓度的病毒RNA，提示病毒 复制不仅发生于呼吸道。病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA

22、，说明粪 便可能也是一种传播途径。鼻、咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液， 提示不适合作为标本（有可能漏检）。三、肿瘤的基因诊断三、肿瘤的基因诊断 肿瘤是由于遗传物质（肿瘤相关 基因）发生突变而导致的疾病。 肿瘤相关基因的突变只是增加了 个体对肿瘤的易感性而并不一定 马上产生肿瘤， 肿瘤的发生是一个多因素、多步骤 的过程。生物芯片技术在今后的肿瘤发病机制研究和肿瘤的诊断等方面将发挥越来越显著的作用1.检测肿瘤相关基因检测肿瘤相关基因癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因2.检测肿瘤相关病毒的基因检测肿瘤相关病毒的基因鼻咽癌鼻咽癌EB，宫颈癌，宫颈癌HPV3.检测肿瘤标志

23、物基因或检测肿瘤标志物基因或mRNA 肝癌肝癌甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）结肠癌结肠癌癌胚抗原（癌胚抗原（CEA）ras癌基因的检测癌基因的检测ras基因中最常见的点突变是第基因中最常见的点突变是第12，13或或61密密码子突变码子突变检测方法：检测方法：1. PCR/ASO2. PCR-SSCP p53的检测的检测p53基因突变主要为点突变，热点区域位基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子于密码子130290，其中，其中175、273、284密码子突变最常见。密码子突变最常见。检测方法：检测方法：1. PCRSSCP2. PCR测序测序3. PCRRFLPTotal RNA from HeLa or NCI-H23 cells were reverse-transcribed into cDNAs in the presence of Biotin-dUTP. The biotin-labeled cDNA probes were then