单克隆抗体的制备和应用

1、获奖年代获奖年代学学 者者获奖成就获奖成就1901E. A. Behring发现抗毒素，开创免疫血清疗法发现抗毒素，开创免疫血清疗法1908P. Ehrlich抗体生成的侧链学说抗体生成的侧链学说E. Metchnikoff细胞吞噬作用细胞吞噬作用1913C. Richet发现过敏现象发现过敏现象1960F. M. Burnet抗体生成的克隆选择学说抗体生成的克隆选择学说P. B. Medawar1972G. M. Edelman抗体的化学结构抗体的化学结构R. M. Porter1977R. S. Yalow创立放射免疫测定法创立放射免疫测定法1984G. KhlerB细胞杂交瘤和单克隆抗体

2、细胞杂交瘤和单克隆抗体C. MilsteinN. Jerne免疫网络学说免疫网络学说1987Tonegawa抗体多样性的遗传学基础抗体多样性的遗传学基础Niels K. JerneGeorges J.F. KhlerCsar Milstein应用应用SRBC为免疫原免疫小鼠为模型为免疫原免疫小鼠为模型, 观察抗体观察抗体产生细胞的体细胞突变产生细胞的体细胞突变(Somatic mutation)Hybridomas: The making of a revolution. Science 1982 Vol 205 pp1073-1075Continuous cultures of fused

3、cells secreting antibodies of predefined specificity. Nature 1975,256:495导致了在生命科学领域中的一场革命导致了在生命科学领域中的一场革命 克隆克隆（Clone）又名无性繁殖系，指由一个祖）又名无性繁殖系，指由一个祖先细胞经分化、增殖所产生的遗传性状完全相先细胞经分化、增殖所产生的遗传性状完全相同的细胞群同的细胞群多克隆抗体（多克隆抗体（Polyclonal antibody, pAb） 用包含多种抗原决定基的抗原物质免疫动用包含多种抗原决定基的抗原物质免疫动物，从而刺激多个物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗细胞克隆

4、产生针对多种抗原表位的不同抗体的总和，称为多克隆抗体原表位的不同抗体的总和，称为多克隆抗体单克隆抗体（单克隆抗体（Monoclonal Antibody, mAb）由一个杂交瘤细胞克隆所产生的，针对单一抗原由一个杂交瘤细胞克隆所产生的，针对单一抗原 决定簇的抗体，称为单克隆抗体决定簇的抗体，称为单克隆抗体单特异性和均一性单特异性和均一性无限供应无限供应用混合的抗原制备出识别一个抗原决定簇的抗体用混合的抗原制备出识别一个抗原决定簇的抗体McAbPcAb杂交细胞（杂交细胞（hybrid cell） 在外界某些条件干预下（如在外界某些条件干预下（如PEG、电穿、电穿孔），当两个细胞紧密地接触的时候孔

5、），当两个细胞紧密地接触的时候,其细胞膜其细胞膜可能发生融合，产生具有原来两个细胞染色体可能发生融合，产生具有原来两个细胞染色体/基因的单个细胞，称为基因的单个细胞，称为杂交细胞杂交细胞 杂交瘤细胞（杂交瘤细胞（Hybridomas） 若用一种肿瘤细胞与另一种体细胞（如淋若用一种肿瘤细胞与另一种体细胞（如淋巴细胞）融合，所形成的杂交细胞称为杂交瘤巴细胞）融合，所形成的杂交细胞称为杂交瘤细胞，简称细胞，简称杂交瘤杂交瘤。其既具有肿瘤细胞无限增。其既具有肿瘤细胞无限增殖的能力，也具有淋巴细胞的一些特性殖的能力，也具有淋巴细胞的一些特性 B淋巴细胞杂交瘤淋巴细胞杂交瘤 骨髓瘤细胞与免疫骨髓瘤细胞与免

6、疫B细胞融合所产生的杂细胞融合所产生的杂 交瘤细胞交瘤细胞B细胞细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞抗原制备抗原制备免疫动物免疫动物骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备细胞融合细胞融合 杂交瘤细胞的选择培养杂交瘤细胞的选择培养 杂交瘤细胞的筛选及克隆化杂交瘤细胞的筛选及克隆化单克隆抗体的鉴定单克隆抗体的鉴定 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 细胞、细菌和病毒等，一般具有较强的免疫细胞、细菌和病毒等，一般具有较强的免疫原性，可不加佐剂。例如，直接腹腔注射原性，可不加佐剂。例如，直接腹腔注射12107个细胞。个细胞。 颗粒性抗原：颗粒性抗原： 可溶性抗原的来源主要是天然纯化

7、，或者用目可溶性抗原的来源主要是天然纯化，或者用目的基因在原核或真核细胞内表达。可溶性抗原需的基因在原核或真核细胞内表达。可溶性抗原需与弗氏完全或不完全佐剂混匀，进行免疫。与弗氏完全或不完全佐剂混匀，进行免疫。 可溶性抗原：可溶性抗原： 免疫目的：免疫目的： 采用与骨髓瘤供体同一品系的动物采用与骨髓瘤供体同一品系的动物 免疫动物品系（脾细胞供体）和骨髓瘤细胞免疫动物品系（脾细胞供体）和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远则产生的杂交瘤越不稳定，在种系发生上距离越远则产生的杂交瘤越不稳定，获得的杂交瘤不能在该品系小鼠体内诱生腹水。获得的杂交瘤不能在该品系小鼠体内诱生腹水。 动物的选择：动物的选择： 动

8、物对抗原刺激易产生免疫应答反应动物对抗原刺激易产生免疫应答反应 8 12周龄雌性小鼠（最常用周龄雌性小鼠（最常用BALB/c）第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐剂第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐剂第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐剂第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐剂第三次免疫：可溶性抗原加生理盐水第三次免疫：可溶性抗原加生理盐水小鼠背部皮下注射小鼠背部皮下注射小鼠背部皮下注射小鼠背部皮下注射4周后周后3周后周后小鼠腹腔注射小鼠腹腔注射10天后天后检测血清效价检测血清效价加强免疫：可溶性抗原加生理盐水加强免疫：可溶性抗原加生理盐水小鼠腹腔注射小鼠腹腔注射细胞融合细胞融合3天后天后 免疫程

9、序：免疫程序： 脾（脾（spleen）抗原抗原脾（脾（spleen） 所选择的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物所选择的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物 品系相同品系相同骨髓瘤细胞系的选择要点：骨髓瘤细胞系的选择要点：自身不产生免疫球蛋白的重链与轻链自身不产生免疫球蛋白的重链与轻链 对氨基碟呤敏感对氨基碟呤敏感 与免疫脾细胞融合后产生稳定分泌与免疫脾细胞融合后产生稳定分泌Ig杂交瘤细胞杂交瘤细胞 饲养细胞（饲养细胞（feeder cell）：）：融合前的准备工作融合前的准备工作拉颈处死小鼠拉颈处死小鼠无菌操作取出脾脏无菌操作取出脾脏清洗、研磨清洗、研磨收集细胞收集细胞离心洗涤离心洗涤细胞计数

10、细胞计数脾细胞的准备脾细胞的准备收集细胞收集细胞离心洗涤离心洗涤活细胞计数活细胞计数调整细胞浓度调整细胞浓度骨髓瘤细胞的准备骨髓瘤细胞的准备细胞融合细胞融合 骨髓瘤细胞与脾细胞骨髓瘤细胞与脾细胞 按一定比例混合按一定比例混合1: 10或或1: 5 加入促融剂加入促融剂PEGPEG在聚乙二醇作用下在聚乙二醇作用下B淋巴细胞可与淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞 用于杂交瘤融合的骨髓细胞缺乏用于杂交瘤融合的骨髓细胞缺乏HGPRT和和TK，在在HAT培养液中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏培养液中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT和和TK ，不能利用补救途径

11、合成不能利用补救途径合成DNA而死而死亡。亡。 未融合的未融合的B淋巴细胞虽具有淋巴细胞虽具有HGPRT和和TK ，但但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有骨髓瘤细胞与免疫只有骨髓瘤细胞与免疫B细胞融合的杂交瘤既细胞融合的杂交瘤既有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又从免疫有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又从免疫B细胞得细胞得到到HGPRT和和TK 的基因产物，因此，能够克服氨基的基因产物，因此，能够克服氨基碟呤的阻断作用，通过次黄嘌呤的补偿途径合成碟呤的阻断作用，通过次黄嘌呤的补偿途径合成DNA，而在，而在HAT选择培养液中生长繁殖。选择培养液中生长繁殖。 融合

12、后融合后34天后，可天后，可见外形似骨髓瘤细胞，浑见外形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮的克隆。圆透亮的克隆。 融合后第融合后第79天取培养上天取培养上清，检测特异性抗体。清，检测特异性抗体。细胞生长情况细胞生长情况杂交瘤分泌单克隆抗体的检测方法杂交瘤分泌单克隆抗体的检测方法 免疫酶技术免疫酶技术间接间接ELISA 包被抗原、培养上清、酶标抗体、加底物显色包被抗原、培养上清、酶标抗体、加底物显色 阴性对照：阴性对照：骨髓瘤细胞培养上清骨髓瘤细胞培养上清 阳性对照：阳性对照：免疫鼠血清免疫鼠血清 免疫荧光技术免疫荧光技术间接免疫荧光（或酶）测定法：靶细胞铺片、间接免疫荧光（或酶）测定法：靶细胞铺片、 固定

13、细胞、加待测样品、加荧光标记抗体（或固定细胞、加待测样品、加荧光标记抗体（或 加酶标抗体和显色底物）、镜检加酶标抗体和显色底物）、镜检 活细胞免疫荧光技术：流式细胞术分析活细胞免疫荧光技术：流式细胞术分析 杂交瘤细胞的克隆化杂交瘤细胞的克隆化 在在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。此，必须进行筛选和克隆化。 克隆化克隆化即把培养孔中的细胞从单个细胞即把培养孔中的细胞从单个细胞进行培养繁殖，使之成为单克隆，其分泌的抗进行培养繁殖，使之成为单克隆，其分泌的抗体达

14、到均一性。体达到均一性。有限稀释法有限稀释法 免疫球蛋白类别及亚类的鉴定免疫球蛋白类别及亚类的鉴定 小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合形小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞，其分泌的特异性成的杂交瘤细胞，其分泌的特异性McAb的本的本质仍是小鼠的不同类型及其亚类的免疫球蛋白质仍是小鼠的不同类型及其亚类的免疫球蛋白（Ig），其中以），其中以IgG（IgG1、 IgG2a、IgG2b和和IgG3等亚类）最常等亚类）最常見見，其次为，其次为IgM。 抗体亲和力是指抗体与抗原或半抗原结抗体亲和力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，其高低主要是由抗体分子结合表合的强度，其高低主要是由抗体分子

15、结合表位部位和抗原决定簇之间的互补程度决定。位部位和抗原决定簇之间的互补程度决定。特异性特异性 是否与其他抗原有交叉反应是否与其他抗原有交叉反应敏感性敏感性 对腹水和培养上清进行效价测定对腹水和培养上清进行效价测定 亲和力测定亲和力测定 动物体内诱生法动物体内诱生法 取取Balb/c小鼠小鼠, 首先腹首先腹腔注射腔注射0.5ml液体石腊或液体石腊或降植烷进行预处理。降植烷进行预处理。 12周后周后, 腹腔内接种杂交腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体单克隆抗体约约12周周, 可见小鼠可见小鼠腹部膨大。用注射器腹

16、部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。大量单克隆抗体。 将杂交瘤细胞置于培将杂交瘤细胞置于培养瓶（或灌）中进行培养。养瓶（或灌）中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体。收产生并分泌单克隆抗体。收集培养上清液，离心去除细集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体，不含无关要的单克隆抗体，不含无关Ig，但成本，但成本髙髙。体外培养法体外培养法 早期研究阶段早期研究阶段全军单克隆抗体研究协作组（单克隆抗体通迅）全军单克隆抗体研究协作组（单克隆抗体通迅）应用和市场化应用和市场化HLDA

17、HCDM功能基因组研究中的重要地位功能基因组研究中的重要地位国家重大科技项目（国家重大科技项目（973、863等）主要研究等）主要研究 内容之一内容之一基础理论研究（生命科学）基础理论研究（生命科学）发病机理的研究发病机理的研究疾病的预防（紧急预防）疾病的预防（紧急预防）疾病的诊断（传染性疾病、肿瘤、自身免疫疾病的诊断（传染性疾病、肿瘤、自身免疫 性疾病、过敏性疾病、免疫缺陷病）性疾病、过敏性疾病、免疫缺陷病）疾病的治疗（治疗性抗体）疾病的治疗（治疗性抗体） 一项重要的生物技术和一项重要的生物技术和 一类生物高科技产品一类生物高科技产品 传染性疾病传染性疾病 HIV: 急性感染期和晚期急性感染

18、期和晚期: 核心抗原核心抗原p24升高升高; 检测抗检测抗HIV抗体初筛抗体初筛; 免疫印迹进一步确认免疫印迹进一步确认; CD4+T 细胞细胞200/ l病情严重病情严重 HAV、HBV、HCV: 抗体抗体 HFRS: 免疫荧光，免疫荧光，ELISA（特异性（特异性IgM） 肿瘤肿瘤 多种肿瘤的标志物多种肿瘤的标志物 直肠结肠癌直肠结肠癌:CEA 前列腺癌前列腺癌:PSA 原发性肝癌原发性肝癌:AFP 淋巴瘤和白血病淋巴瘤和白血病:CD分子分子 自身免疫性和过敏性疾病自身免疫性和过敏性疾病 自身抗体（抗核抗体、类风湿因子）自身抗体（抗核抗体、类风湿因子） 放射免疫测定法（放射免疫测定法（RI

19、A）检测特异性）检测特异性IgE 甲状腺素、胰岛素、生长激素甲状腺素、胰岛素、生长激素 其他其他 血型检测：凝集反应（直接和间接）血型检测：凝集反应（直接和间接） 早孕早孕: 人绒毛膜促性腺激素（人绒毛膜促性腺激素（hCG） 男性不育男性不育: 抗精子抗体抗精子抗体Fabmurine antibodychimeric mouse antibody FvdAbengineeredbispecific AbScFvHumanizedF(ab )2HumanizedantibodyScFv-toxinintrabodyNumber of therapeutic mAbs entering clini

20、cal study per yearTherapeutic categories for mAbs in clinical study通用名通用名批准时间批准时间类型类型识别抗原识别抗原适应症适应症Muromonab-CD31986mouseCD3急性肾移植移植排斥急性肾移植移植排斥Daclizumab; Basiliximab1997;1998humanized/ chimericIL-2R(CD25) 急性肾移植移植排斥急性肾移植移植排斥Rituximab; Tositumomab; Ibritumomab1997;2002; 2003mouse/chimericCD20B细胞细胞-非何杰

21、金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、类风湿性关节炎类风湿性关节炎Alemtuzumab2001humanizedCD52慢性慢性B淋巴细胞性白血病淋巴细胞性白血病Gemtuzumab ozogamicin2000chimericCD33急性粒细胞性白血病急性粒细胞性白血病Edrecolomab*1995mouseEP-CAM结、直肠癌结、直肠癌Trastuzumab1998humanizedHER-2HER-2过表达的转移性乳腺癌过表达的转移性乳腺癌Cetuximab2004humanizedEGFR转移性结肠癌、头颈部癌症转移性结肠癌、头颈部癌症Bevacizumab2004;2006humani

22、zedVEGF转移性结肠癌转移性结肠癌,年龄相关性黄斑病变年龄相关性黄斑病变Infliximab1998; 2002chimeric/ humanTNF-节段性回肠炎、类风湿关节炎节段性回肠炎、类风湿关节炎,银屑病性关节炎银屑病性关节炎;强直性脊柱炎强直性脊柱炎Efalizumab2003humanizedCD11a银屑病银屑病Natalizumab2004human4整合素整合素多发性硬化症多发性硬化症Omalizumab2003humanizedIgE过敏性哮喘过敏性哮喘Abciximab 1994 chimeric GPb/a 冠心病血小板冠心病血小板Palivizumab 1998 h

23、umanized RSV 呼吸道合胞病毒感染呼吸道合胞病毒感染 Characteriztion of mAbs against EpCAM by IHC and IF肿瘤肿瘤 器官移植排斥器官移植排斥自身免疫性疾病自身免疫性疾病其他其他CD20, CD52, CD33, HER-2EGFR, VEGF, EP-CAMCD3, IL-2R（CD25）TNF-, CD11a, 4整合素整合素, CD20 GPb/a, IgE, RSVgpFMechanisms of mAb-mediated killing CD20 表达于表达于B 淋巴细胞，其抗体可促进细胞对化疗淋巴细胞，其抗体可促进细胞对化疗

24、 的敏感性，诱导细胞凋亡、的敏感性，诱导细胞凋亡、ADCC、CDC CD33 表达于表达于90% 以上的急性髓样白血病以上的急性髓样白血病 (AML)细胞，细胞， 但不表达于骨髓但不表达于骨髓CD34+造血干细胞，其抗体可造血干细胞，其抗体可 诱导双链诱导双链DNA断裂和细胞死亡断裂和细胞死亡 CD52 可诱导可诱导ADCC和和CDC，治疗慢性，治疗慢性B淋巴细胞淋巴细胞 白血病、白血病、T细胞白血病和细胞白血病和T细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤 抗抗HER2/CD340 ADCC，抑制肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞增殖 和血管形成和血管形成 抗抗EGFR 阻断阻断EGFR与与EGF结合，诱导结合，诱导AD

25、CC， 抑制细胞增殖，抑制肿瘤血管形成，抑制细胞增殖，抑制肿瘤血管形成， 诱导凋亡诱导凋亡 抗抗VEGF 阻断阻断VEGF与与VEGF受体结合，抑制受体结合，抑制 肿瘤的血管生长和转移部位的发展肿瘤的血管生长和转移部位的发展 抗抗CD3 补体依赖的细胞毒作用（补体依赖的细胞毒作用（CDC），）， 清除清除T细胞，阻断细胞，阻断T细胞功能细胞功能 抗抗CD25 补体依赖的细胞毒作用（补体依赖的细胞毒作用（CDC），）， 阻断阻断IL-2受体受体 抗抗TNF 阻断阻断TNF- 与受体结合与受体结合, 降低或消除降低或消除 由由TNF- 刺激细胞所发生的炎症反应刺激细胞所发生的炎症反应 抗抗CD11

26、a 抑制抑制LFA-1与配体结合与配体结合, 抑制白细胞抑制白细胞 黏附黏附, 治疗斑状牛皮癣治疗斑状牛皮癣 抗抗 4整合素整合素 抑制抑制VLA-4与配体结合与配体结合, 抑制白细胞黏附抑制白细胞黏附 CD20 治疗治疗RA 抗抗IgE 阻断阻断IgE与与IgE受体结合受体结合, 抑制肥大细胞和抑制肥大细胞和嗜碱性嗜碱性 粒细胞脱颗粒和释放介质，治疗持续性哮喘粒细胞脱颗粒和释放介质，治疗持续性哮喘 抗抗gpb/a 抑制血小板凝血，止血，预防冠状动脉抑制血小板凝血，止血，预防冠状动脉 血管形成术中血栓血管形成术中血栓 抗抗RSVgpF 中和病毒，抑制病毒融合和复制，中和病毒，抑制病毒融合和复制

27、， 预防儿童在高危期预防儿童在高危期RSV感染感染 抗抗IgE mAb 治疗过敏性疾病的信号传导途径治疗过敏性疾病的信号传导途径通用名通用名类型类型识别抗原识别抗原治疗疾病治疗疾病CatumaxomabRomovab 双特异性双特异性anti-CD3/Epcam结肠癌结肠癌Zanolimumab Humax-CD4人抗体人抗体, IgGCD4皮肤性皮肤性T细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤EpratuzumabLymphocide人源人源, IgG1CD22非何杰金淋巴瘤和某些自身免非何杰金淋巴瘤和某些自身免疫性疾病疫性疾病(如如SLE), 与与CD20mAb联用可能会提高临床效果联用可能会提高临床效果MD

28、X-010ipilimumab人抗体人抗体, IgGCTLA-4黑素瘤黑素瘤WX-G250Rencarex嵌合嵌合, IgG1抗碳酸酐酶抗碳酸酐酶晚期肾癌晚期肾癌AMG-162 denosumab人抗体人抗体, IgG2RANKL绝期后骨质疏松症和防止治疗绝期后骨质疏松症和防止治疗肿瘤过程中激素部分切除治疗肿瘤过程中激素部分切除治疗引起的骨丢失引起的骨丢失Anti-MRSAmAbAurograb人抗体人抗体, scFv抗甲氧苄青链素的金抗甲氧苄青链素的金黄色葡萄球菌黄色葡萄球菌(MRSA)金黄色葡萄球菌感染金黄色葡萄球菌感染PexelizumabAlexion;Eculizumab人源人源,单

29、链可变区单链可变区, scFv补体补体C5治疗心血管术后合并症治疗心血管术后合并症,膜性肾炎膜性肾炎,急性心肌梗塞急性心肌梗塞,RAMepolizumab人源人源, IgG1IL-5特应性皮炎特应性皮炎,嗜酸细胞过多综合征嗜酸细胞过多综合征靶分子靶分子抗体种类抗体种类治疗疾病治疗疾病商品名商品名公司公司批准时间批准时间CD分子分子 IL-6R人源化抗体人源化抗体（IgG1）阻断阻断IL-6与与IL-6R结合，结合，治疗治疗RA, Castelman病病RoActemra/TocilizumabChugai/Roche2009(US2009(EU)日本日本CD80/CD86CTLA4-Fc阻断阻断T细胞活化，细胞活化，治疗治疗RAOrencia/