酶工程5 第八章_酶定向进化

1、酶工程5 第八章_酶定向进化2/1693/1694/169(1) 从大量未知的生物种系中寻找 生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中，并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用。 酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。 天然酶的作用5/1696/1697/1698/1699/16910/16911/169理性设计示意图12/16913/16914/16915/16916/16917/16918/16919/16920/16

2、921/169酶基因随机突变构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶反复进行易错PCRDNA 重排基因家族重排平板筛选法荧光筛选法噬菌体表面展示法细胞表面展示法核糖体表面展示法高通量筛选定向选择22/16923/16924/16925/16926/16927/169酶性质突变方法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCR-内酰胺酶总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN稳定性 盒式诱变对硝基苯酯酶底物专一性/有机相活性易错PCR/DNA改组 胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性盒式诱变-半乳糖苷酶底物专一性DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶

3、活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗活性/专一性/最佳表达DNA改组28/16929/16930/16931/169第二节 酶基因体外随机突变环境样品产酶微生物的筛选微生物发酵产酶酶蛋白的分离纯化酶蛋白的氨基酸序列的测定微生物的分子鉴定数据库中寻找酶蛋白序列酶蛋白序列比对及保守区确定设计简并引物并扩增保守区序列酶基因32/1698.2 酶基因体外随机突变多聚酶链式反应PCR是由美国科学家33/169体内DNA的复制体系 34/169引物引物引物引物35/169dATPdATPdTTPdTTPdGTPdGTPdCTPdCTPMgMg2+2+模板：DNA引物：P1 P2DNA聚合酶：Taq原料：d

4、NTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+36/169PCR反应循环37/16938/16939/169随机突变方法特点易错PCR技术error-prone PCR从酶的单一基因出发，在特定的反应条件下进行PCR扩增，使碱基配对出现错误而引起基因突变基因重排技术DNA shuffling从两条以上的正突变基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变基因家族重排技术DNA family shuffling从基因家族的若干基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变40/1698.2.2 基因体外随机突变方法41/169易错PCR具体反应条件要根

5、据进化目的、DNA聚合酶种类和模版情况等多次试验而确定。8.2.2 基因体外随机突变方法-易错PCR技术42/16943/1698.2.2 基因体外随机突变方法-易错PCR技术44/1698.2.2 基因体外随机突变方法-易错PCR技术45/1698.2.2 基因体外随机突变方法-易错PCR技术46/1698.2.2 基因体外随机突变方法-易错PCR技术47/1698.2.2 基因体外随机突变方法48/1698.2.2 基因体外随机突变方法- DNA重排技术49/1698.2.2 基因体外随机突变方法- DNA重排技术50/169DNA重排技术原理图1. DNaseI产生随机片段；产生随机片段

6、；2. 随机片段变性；随机片段变性；3. 随机片段复性；随机片段复性；4. 延伸延伸 反复重复反复重复2-4步后，可获得全长步后，可获得全长DNA片段片段 8.2.2 基因体外随机突变方法- DNA重排技术51/1698.2.2 基因体外随机突变方法- DNA重排技术52/1698.2.2 基因体外随机突变方法- DNA重排技术DNA重排技术的改进 （1）53/1691个引物个引物2个模板个模板退火结合退火结合延伸产生短片段延伸产生短片段短片段为引物与短片段为引物与模板退火结合模板退火结合继续延伸片段至继续延伸片段至全长的基因长度全长的基因长度分离全长基因，分离全长基因，加入外源引物扩加入外源

7、引物扩增全长基因。增全长基因。8.2.2 基因体外随机突变方法- DNA重排技术54/1698.2.2 基因体外随机突变方法- DNA重排技术DNA重排技术的改进 （1）-交错延伸PCR技术55/1698.2.2 基因体外随机突变方法- DNA重排技术DNA重排技术的改进 （2）56/1698.2.2 基因体外随机突变方法- DNA重排技术DNA重排技术的改进 （2）-随机引物体外重组技术57/1698.2.2 基因体外随机突变方法- DNA重排技术DNA重排技术的改进 （2）-随机引物体外重组技术58/1698.2.2 基因体外随机突变方法（三）基因家族重排技术59/169uDNA shuf

8、fling与Family shuffling：基本过程大致相同出发基因不同8.2.2 基因体外随机突变方法-基因家族重排技术60/169当以单一的酶分当以单一的酶分子基因进行定向子基因进行定向进化时进化时, , 基因的基因的多样化起源于多样化起源于易易错错PCRPCR 等反应中等反应中产生的产生的随机突变随机突变, , 所以采用这种过所以采用这种过程累积有益突变程累积有益突变的的速度比较慢速度比较慢。 从自然界中存在的从自然界中存在的基因家族基因家族出出发发, , 利用它们之间的同源序列利用它们之间的同源序列进行进行DNA DNA 改组。由于每一个天改组。由于每一个天然酶的基因都经过千百万年的

9、然酶的基因都经过千百万年的进化进化, , 并且基因之间存在并且基因之间存在比较比较显著的差异显著的差异, , 所以获得的重组所以获得的重组基因库充分体现了基因库充分体现了基因的多样基因的多样化化，排除了不必要的突变，大，排除了不必要的突变，大大加速了基因的体外进化速度。大加速了基因的体外进化速度。DNA shufflingFamily shuffling8.2.2 基因体外随机突变方法-基因家族重排技术61/169单链化单链化限制性限制性内切酶内切酶消化消化Dnase I 消化消化无外源引物无外源引物PCR重组基因库重组基因库片段化片段化同源基因同源基因常规常规PCR3种基因家族改组方法原理图

10、种基因家族改组方法原理图1.常规基因家族改组。常规基因家族改组。2.单链单链DNA介导的基因家族改组。介导的基因家族改组。3.限制性内切酶介导的基因家族改组限制性内切酶介导的基因家族改组3种基因家族改组方法获得的突变种基因家族改组方法获得的突变基因多样性比较基因多样性比较 Kikuchi采用后采用后2种改组方法，从种改组方法，从儿儿茶酚茶酚2,3-双加氧酶双加氧酶的的2个同源基因出个同源基因出发发, 对其进行体外定向进化的研究。对其进行体外定向进化的研究。最终筛选到的进化酶在最终筛选到的进化酶在50的的半衰半衰期期分别比两种天然酶延长分别比两种天然酶延长12和和26倍。倍。1007550250

11、123产生的杂合基因百分比产生的杂合基因百分比8.2.2 基因体外随机突变方法-基因家族重排技术62/16963/169突变基因基因载体重组DNA突变基因文库目的基因进化酶基因重组组装筛选表达64/1698.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的构建65/1698.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的构建66/1698.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的构建67/169（一）构建基因文库的质量要求8.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的构建68/1698.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的构建69/1698.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的

12、构建（二）构建突变基因文库的主要过程70/1698.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程-载体选择71/169质粒载质粒载体特点体特点1.有自主的有自主的复制起点复制起点2.两种以上的易于检测两种以上的易于检测的的选择性标记选择性标记3.多种限制性内切核酸多种限制性内切核酸酶的单一酶的单一酶切位点酶切位点4.4.适合适合小片段小片段DNADNA的重组的重组8.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程-载体选择（1）质粒载体72/169(2686 bp)73/1698.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的

13、构建（二）构建突变基因文库的主要过程-载体选择74/16975/1698.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程-载体选择76/1698.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程-载体选择黏粒载体的基本属性77/1698.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程-载体选择黏粒载体78/1698.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要过程-载体选择79/1698.3.1 酶基因突变的定向选择-突变基因文库的构建（二）构建突变基因文库的主要

14、过程-载体选择80/16981/1698.3.2 酶基因突变的定向选择-基因重组82/1698.3.2 酶基因突变的定向选择-基因重组83/16984/1698.3.2 酶基因突变的定向选择-基因重组85/16986/1698.3.2 酶基因突变的定向选择-基因重组87/169两端加接头88/1691972年，斯坦福大学的年，斯坦福大学的P. Labban和和P. Kaiser提出。提出。同聚加尾同聚加尾 法法 修饰末端连接（1）-人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端转移酶末端转移酶能在没有模板的情况下能在没有模板的情况下给给DNA的的3-OH端端加上脱氧核苷酸。加上脱氧核苷酸。原理：原理：

15、分别给载体和插入片断加上分别给载体和插入片断加上互补的互补的核苷酸。核苷酸。加尾加尾碱基互补碱基互补8.3.2 酶基因突变的定向选择-基因重组89/169缺点缺点：优点优点：能把任何能把任何片段连接片段连接起来起来不能把不能把插入片插入片段再切段再切下来。下来。非酶切位点非酶切位点90/169用用T4 DNA连接酶连到平端连接酶连到平端DNA上，然上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。后再用酶切，形成一个人工粘性末端。 linker用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限的特定限制性内切酶识别位点序列的制性内切酶识别位点序列的平端双链平端双链。GGAATTCC CC

16、TTAAGGEcoRI linker： linker的作用的作用8.3.2 酶基因突变的定向选择-基因重组修饰末端连接（2）-衔接物(linker)连接91/169u 92/169u 缺点：缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段切下完整的插入片段2）能给载体连接上）能给载体连接上Polylinker:u优点：8.3.2 酶基因突变的定向选择-基因重组94/1691978年康奈尔大学的吴瑞教授发明。年康奈尔大学的吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 Ba

17、mHI adapter用用T4DNA连接酶连到连接酶连到DNA分子的两分子的两端，直接成为人工粘性末端。端，直接成为人工粘性末端。 adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。切位点序列）。 adapter的作用的作用8.3.2 酶基因突变的定向选择-基因重组修饰末端连接（3）- DNA接头 (adapter)连接法95/169Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG- GG

18、CC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接头自我连接接头自我连接96/16997/169接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与影响与DNA片段的连接。片段的连接。优点：优点：连上后就能用。连上后就能用。缺点：缺点：先用小牛肠先用小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶（CIP）处理接头，）处理接头，水解掉其水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用（以后再用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶加上磷酸。）加上磷酸。）防止自我连接防止自我连接8.3.2 酶基因突变的定向选择-基因重组98

19、/1695p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！ 5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP处理处理-OHHO-99/1698.3.3 酶基因突变的定向选择(三)构建突变基因文库100/169E. coli感受态细胞感受态细胞感受态制备感受态制备0，0.1MCaCl2加入质粒加入质粒42热激热激90 s，立即冰浴立即冰浴富裕培养富裕培养抗性筛选抗性

20、筛选LB-抗生素抗生素8.3.3 酶基因突变的定向选择-构建突变基因文库101/169102/1698.3.3 酶基因突变的定向选择-构建突变基因文库103/169104/169突变基因文库质粒载体噬菌体载体转化转导目的基因筛选8.3.4 酶基因突变的定向选择-突变基因的筛选105/1698.3.4 酶基因突变的定向选择-突变基因的筛选106/169细菌细菌诱发突变的诱发突变的因素因素5050 0 0C C培培养养突变体库突变体库选择压力选择压力耐受型突变体耐受型突变体一定浓度的一定浓度的-内酰胺类抗生内酰胺类抗生素素8.3.4 酶基因突变的定向选择-突变基因的筛选107/1698.3.4 酶

21、基因突变的定向选择-突变基因的筛选108/169（二）高通量筛选技术109/1698.3.4 酶基因突变的定向选择-突变基因的筛选高通量筛选方法110/169111/169AmN2H112/169 -galactosidaseuBlue/ white screening or Lac selection诱导物：IPTG底物：X-gal113/169114/169115/169Homogenized activated sludge sample cultured on 1/10-strength LB plates amended with CPQP and viewed with (A) w

22、hite light and (B) fluorescent light revealing colony with halo (arrow 1) and no halo (arrow 2). 116/169uStarch agar AmylaseuSpirit blue agar LipaseuMethylene blue tributyrin Lipase uSkim milk agar Caseinase uNutrient gelatin deep Gelatinase uDNase agar methyl green DNase 117/169豆豉纤溶酶安全性能好，溶栓能力强，而且无

23、毒副作用，不引起内出血，半衰期长。 118/169119/169120/169荧光素酶荧光素酶121/169该蛋白质在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光122/169A fusion of green fluorescent protein (GFP), calmodulin, and M13 Upper part: Structure of Ca2+-saturated GCaMP2 monomerLower part: Structure of calcium-free GCaMP2. 123/169124/169125/169126/169127/169128/169(a)Sche

24、matic of M13 phage with phage DNA modified to display a protein or peptide as a fusion to the coat protein pIII.(b)Representation of M13 phage with nanoparticles (black spheres) nucleated onto pIII (dark blue). (c)Schematic of a metal- or semiconductor-binding peptide is displayed on coat protein pV

25、III129/169噬菌体展示库建立过程重组：重组：不同基因分别被插不同基因分别被插入噬菌体基因组中入噬菌体基因组中分离纯化：分离纯化：纯化噬菌体只纯化噬菌体只是展示一个蛋白，多肽或者是展示一个蛋白，多肽或者抗体。抗体。文库建成：文库建成：收集所有的噬收集所有的噬菌体就构成一个文库将噬菌菌体就构成一个文库将噬菌体文库与靶蛋白相互作用，体文库与靶蛋白相互作用，筛选能与靶蛋白相互作用的筛选能与靶蛋白相互作用的噬菌体噬菌体130/169131/169pIIIForeign DNAMediating protein gene132/169133/169134/169135/169136/169137/

26、169138/169139/169ag1Ag1aga2aga1Aga1Aga2S SMAT细胞中ag1基因编码-凝集素（-agglutinin）Ag1。MATa细胞中aga1和aga2基因分别a-凝集素的两个亚基Aga1、Aga2，二者通过2对二硫键连接。MAT细胞和MATa可以通过Ag1和Aga2的相互作用发生凝集作用（agglutination），在细胞交配中起到重要作用。-cella-cell140/169141/169142/169143/169144/169145/169146/169147/169148/169149/169150/169Flolp C端端GPI 锚定系统锚定系统Flolp N端絮凝结构域系统端絮凝结构域系统151/169152/169153/169uGr