专题三真核生物基因表达修改

1、第三章第三章 真核生物基因表达调控真核生物基因表达调控 THE CONTROL EUKARYOTIC GENE EXPRESSION第一节第一节 概述概述 真核基因表达调控的最显著特征是能真核基因表达调控的最显著特征是能在在特定时间特定时间和和特定的细胞特定的细胞中激活中激活特定的基因特定的基因，从而实现从而实现“预定预定”的、有序的、不可逆转的的、有序的、不可逆转的分化、发育过程，并使生物的组织和器官在分化、发育过程，并使生物的组织和器官在一定的环境条件范围内保持正常功能。一定的环境条件范围内保持正常功能。 真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类：真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类：

2、 第一类是第一类是瞬时调控瞬时调控或称或称可逆性调控可逆性调控，它相当，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。酶活性和浓度的调节。 第二类是第二类是发育调控发育调控或称或称不可逆调控不可逆调控，是真核，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。分化、发育的全部进程。多级调控多级调控RNA水平水平转录水平调控转录水平调控RNARNA的转录后加工的转录后加工mRNAmRNA向

3、胞浆转运向胞浆转运mRNAmRNA稳定性稳定性DNA水平水平基因丢失基因丢失基因扩增基因扩增基因重排基因重排甲基化修饰甲基化修饰染色质的结构状态染色质的结构状态蛋白质蛋白质水水 平平翻译过程翻译过程翻译后加工翻译后加工蛋白质的稳定性蛋白质的稳定性第二节第二节 转录前的调控转录前的调控（DNADNA水平的调控）水平的调控）1 DNA的甲基化与去甲基化的甲基化与去甲基化2 染色质结构对真核基因转录的调控染色质结构对真核基因转录的调控3 基因重排和基因扩增对基因表达的影响基因重排和基因扩增对基因表达的影响1.DNA1.DNA的甲基化与去甲基化的甲基化与去甲基化真核真核DNADNA中的中的胞嘧啶胞嘧啶

4、约有约有5%5%被甲基化为被甲基化为5-5-甲基甲基胞嘧啶胞嘧啶(5-methylcytidine,m5C)(5-methylcytidine,m5C)，而，而活跃活跃转录转录的的DNADNA段落中胞嘧啶段落中胞嘧啶甲基化程度常较低甲基化程度常较低。甲基化可使基因失活，去甲基化又可使基因恢甲基化可使基因失活，去甲基化又可使基因恢复活性。复活性。 DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。研究证实，CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化导致了人体1/3以上由于碱基转换而引起的遗传病。 DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中。 实验证明

5、，这个过程不但与DNA复制起始及错误修正时的定位有关，还通过改变基因的表达参与细胞的生长、发育过程及染色体印迹、X染色体失活等的调控。 DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。 在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中。因为高等生物CpG二核苷酸序列中的C 通常是甲基化的，极易自发脱氨，生成胸腺嘧啶。 由于这些CpG二核苷酸通常成串出现在DNA上，这段序列往往被称为CpG岛岛。 真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一种被称为甲基转移酶，另一种是甲基转移酶。 前者主要在甲基化

6、母链（模板链）指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。该酶催化特异性极强，对半甲基化的DNA有较高的亲和力，使新生的半甲基化DNA迅速甲基化，从而保证DNA复制及细胞分裂后甲基化模式不变。 后者催化未甲基化的后者催化未甲基化的CpGCpG成为成为mCpGmCpG，它不需要母链指导，但速度很，它不需要母链指导，但速度很慢。慢。1.1 DNA甲基化抑制基因转录的机理甲基化抑制基因转录的机理 DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。 研究表明，当组蛋白H1与含CCGG序列的甲基化或非甲基化DN

7、A分别形成复合体时，DNA的构型存在着很大的差别，甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡。由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始入大沟而不利于基因转录的起始。 有实验用序列相同但甲基化水平不同的DNA为材料，比较其作为RNA聚合酶转录模板的活性，发现甲基的引入不利于模板与甲基的引入不利于模板与RNA聚聚合酶的结合合酶的结合，降低了其体外转录活性。 在生殖细胞形成或胚胎发育过程中在生殖细胞形成或胚胎发育过程中DNA的甲基化修的甲基化修饰是引起父源和母源基因活性差异的关键。饰是引起父源和

8、母源基因活性差异的关键。 高度甲基化的等位基因常不被表达或表达活性减低，高度甲基化的等位基因常不被表达或表达活性减低，称为被称为被印迹的基因印迹的基因。如果在卵子形成过程中被印迹，就。如果在卵子形成过程中被印迹，就会在后代细胞中表现出来自母方的该基因会在后代细胞中表现出来自母方的该基因 “沉默沉默”，称，称为为母源印迹母源印迹；若在精子形成过程中被印迹，则来自父方若在精子形成过程中被印迹，则来自父方的该基因表现的该基因表现“沉默沉默”, 称为称为父源印迹父源印迹。目前在人类和鼠身上已辨明了目前在人类和鼠身上已辨明了2020种印迹基因。种印迹基因。 对于来说，稀少的甲基化就能使其完全失去转录活性

9、。当这一类启动子被增强时（带有增强子），即使不去甲基化也可以恢复其转录活性。 若进一步提高甲基化密度，即使增强后的启动子仍无转录活性。因为甲基化对转录的抑制强度与结合DNA的能力成正相关，甲基化CpG的密度和启动子强度之间的平衡决定了该启动子是否具有转录活性。HpaHpa只能切非甲基化的只能切非甲基化的CCGGCCGG，所以只有一个切点，产生两条带；，所以只有一个切点，产生两条带；MspMsp可以切甲基化和未甲基化的可以切甲基化和未甲基化的CCGGCCGG，因此有两个切点，产生，因此有两个切点，产生3 3条电泳带条电泳带。Hpa同裂酶判断甲基化位点的存在同裂酶判断甲基化位点的存在甲基化的研究2

10、. 染色质结构对真核基因转录的调控染色质结构对真核基因转录的调控2.1 2.1 染色质结构影响基因转录染色质结构影响基因转录 常染色质中的基因可以转录，异染色质无基因转录表达。常染色质中的基因可以转录，异染色质无基因转录表达。2.2 2.2 组蛋白的作用组蛋白的作用 组蛋白扮演了非特异性阻遏蛋白的作用，组蛋白扮演了非特异性阻遏蛋白的作用， 非组蛋白成分起到特异性的去阻遏促转录作用非组蛋白成分起到特异性的去阻遏促转录作用 核小体结构影响基因转录。核小体结构影响基因转录。3. 基因重排和基因扩增对基因表达的影响基因重排和基因扩增对基因表达的影响3.1 基因扩增基因扩增(gene amplifica

11、tion) : 在没有发生细胞分裂，整在没有发生细胞分裂，整条染色体几乎没有复制的情况下，细胞内某些特定基因条染色体几乎没有复制的情况下，细胞内某些特定基因的拷贝数专一性增加的现象。的拷贝数专一性增加的现象。（1） 为满足正常的生长发育需要为满足正常的生长发育需要 如两栖类和昆虫卵母细胞如两栖类和昆虫卵母细胞rRNA基因基因的扩增的扩增: 卵母细胞中卵母细胞中的的rDNA拷贝数比体细胞中增加了拷贝数比体细胞中增加了4000倍。倍。 在果蝇滤泡细胞中，编码卵壳在果蝇滤泡细胞中，编码卵壳蛋白蛋白的卵壳基因的扩增。的卵壳基因的扩增。（2） 外界环境因素引起基因扩增外界环境因素引起基因扩增 基因扩增与

12、基因扩增与肿瘤形成及细胞衰老肿瘤形成及细胞衰老有关。在原发性的视网有关。在原发性的视网膜细胞瘤中，含膜细胞瘤中，含myc 原癌基因的原癌基因的DNA区段扩增区段扩增10-200倍。倍。许多致癌剂可诱导许多致癌剂可诱导DNA扩增。扩增。 3.2 基因丢失基因丢失v在细胞分化过程中，通过在细胞分化过程中，通过丢掉某些基因丢掉某些基因而去除其活而去除其活性。例如某些原生动物，线虫、昆虫、甲壳类动物，性。例如某些原生动物，线虫、昆虫、甲壳类动物，体细胞常丢掉部分或整条染色体，只保留将来分化体细胞常丢掉部分或整条染色体，只保留将来分化产生生殖细胞的那套染色体。产生生殖细胞的那套染色体。v例如在蛔虫胚胎发

13、育过程中，有例如在蛔虫胚胎发育过程中，有27DNA丢失。丢失。在在高等动植物中，尚未发现类似现象。高等动植物中，尚未发现类似现象。v许多生物各类不同的细胞或细胞核都具有全能性。许多生物各类不同的细胞或细胞核都具有全能性。 小麦瘿蚊（小麦瘿蚊（Mayetiole destructor）受精卵的细胞核分裂，）受精卵的细胞核分裂，而受精卵不分裂，形成合胞体（而受精卵不分裂，形成合胞体（syncytium）。当核第）。当核第3次分次分裂后，有两核移向卵后端的一个特殊区域，叫做极细胞质，裂后，有两核移向卵后端的一个特殊区域，叫做极细胞质，在极细胞质中的核保持了全套的染色体（在极细胞质中的核保持了全套的染

14、色体（2n =40），将来分），将来分化为生殖细胞。而在一般的细胞质中，染色丢失了化为生殖细胞。而在一般的细胞质中，染色丢失了32条，只条，只保留保留8条，将来分化为体细胞。条，将来分化为体细胞。第三节第三节 真核基因真核基因转录水平的调控转录水平的调控 1 基因转录的顺式作用元件基因转录的顺式作用元件(cis-acting elements)2 反式作用因子（反式作用因子（trans-acting factors，TF） 1 基因转录的顺式作用元件基因转录的顺式作用元件(cis-acting elements)顺式作用元件：顺式作用元件：基因周围能与特异转录因子结合而影响转基因周围能与特异转

15、录因子结合而影响转录的一段录的一段DNADNA序列。序列。 1.1 启动子启动子 (1) 核心启动子成分，核心启动子成分，如如TATA框；框； (2) 上游启动子成分上游启动子成分（UPEUPE），如，如CAAT框，框，GC框，八聚体框，八聚体（octamet）ATF结合位点；结合位点； (3) 远上游顺序远上游顺序（UAS） ：如增强子，酵母中的：如增强子，酵母中的UAS（upstream activator seguences）减弱子、静息子等。）减弱子、静息子等。 (4) 特殊细胞中的启动子成分特殊细胞中的启动子成分：如淋巴细胞中的：如淋巴细胞中的Oct（octamer）和和B。 一个完

16、整的基因，不但包括编码区（coding region），还包括5和3端长度不等的特异性序列，它们虽然不编码氨基酸，却在基因表达的过程中起着重要作用。UPE: upstream promotor elementUAS: upstream activating sequence1981年Benerji,Rusconi和Chambom等发现，又称远上游序远上游序列列（far upstream seguence）。最早最早SV40病毒中发现长约病毒中发现长约200bp的一段的一段DNA，可使旁，可使旁侧的基因转录提高侧的基因转录提高100倍。倍。100-200bp长度，由若干组件构成，其基本核心组件常

17、长度，由若干组件构成，其基本核心组件常为为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。1.2 增强子增强子 增强子的作用特点：增强子的作用特点： 远距离发挥作用远距离发挥作用 (100500bp，10Kb) 促进转录，不具有启动子专一性促进转录，不具有启动子专一性 功能与方向，位置无关功能与方向，位置无关 组织或细胞特异性组织或细胞特异性增强子的作用原理是什么呢？增强子的作用原理是什么呢？ 增强子的功能是可以累加的增强子的功能是可以累加的。SV40增强子序列可以被分为两半，每一半序列本身作为增强子功能很弱，但合在一起，即使其中间插入一些别的序列，仍然是一个有

18、效的增强子。因此，要使一个增强子失活必须在多个位点上造成突变。对SV40增强子而言，没有任何单个的突变可以使其活力降低10倍。负性调控元件负性调控元件，它与转录抑制因子结合抑制转录。，它与转录抑制因子结合抑制转录。最早在酵母中发现，以后在最早在酵母中发现，以后在T淋巴细胞的淋巴细胞的T抗原受体基因抗原受体基因的转录和重排中证实其存在。的转录和重排中证实其存在。沉默子的作用特点沉默子的作用特点：不受序列方向的影响不受序列方向的影响，能能远距离发挥远距离发挥作用，作用，并可对并可对异源基因异源基因的表达起作用。的表达起作用。1.3 沉默子沉默子 silencer1.4 上游激活序列（上游激活序列（

19、upstream activating seguences ，UASs）类似于增强子。作用：|影响转录程度，对位点选择不起作用。|有方向性有方向性，不能在启动子的下游起作用。|结合的转录因子是GCN4和GAL4，识别位点为ATGACTCAT。v一组受到共同调控的基因，都有一个相同的元件（序一组受到共同调控的基因，都有一个相同的元件（序列），此元件能与某一个列），此元件能与某一个(类类)专一蛋白结合，使基因对其作专一蛋白结合，使基因对其作出反应。出反应。v特点：特点：有短的保守顺序；有短的保守顺序；是启动子或增强子的上游元件。是启动子或增强子的上游元件。在不同基因中，拷贝相似，有时有多个拷贝；在

20、不同基因中，拷贝相似，有时有多个拷贝；与转录起点距离不固定。与转录起点距离不固定。1.5 效应元件效应元件(Response element):真核生物的效应元件真核生物的效应元件调节剂调节剂元元件件保守顺序保守顺序DNADNA长长度度因子因子大小大小（DaDa）热休克热休克HSEHSECNNGAANNTCCNCNNGAANNTCCNNGNG27bp27bpHSTFHSTF93,00093,000糖皮质激糖皮质激素素GREGRETGGTACAAATGTTGGTACAAATGTTCTTCT20bp20bp受体受体94,00094,000弗波酯弗波酯TRETRETGACTCATGACTCA22bp

21、22bpAP1AP139,00039,000血清血清SRESRECCATATTAGGCCATATTAGG20bp20bpSRFSRF52,00052,0001.6 转座因子转座因子（1 1）转座子：能独立插入无序列相关性的基因组新位点上的）转座子：能独立插入无序列相关性的基因组新位点上的一段一段DNADNA序列。参与转座子易位整合的酶称为转座酶，它通常序列。参与转座子易位整合的酶称为转座酶，它通常能特异的识别转座子两端的能特异的识别转座子两端的DNADNA序列。序列。（2）1932年，美国玉米遗传学家年，美国玉米遗传学家B.McClintock发现玉米籽粒色斑发现玉米籽粒色斑不稳定遗传现象，于

22、不稳定遗传现象，于1951年，第一次提出转座因子的概念。年，第一次提出转座因子的概念。糊粉层颜色：糊粉层颜色： A C R Pr I/Ds 花色素花色素 颜色颜色 红红 紫紫 抑制因子抑制因子 解离因子解离因子 I/Ds：解离因子：解离因子 Ac：激活因子：激活因子DNA transposable element 2 反式作用因子（反式作用因子（trans-acting factors，TF） 反式作用因子反式作用因子（trans-acting factor） ：能调节与它们接：能调节与它们接触的基因的表达的各种扩散分子（通常是触的基因的表达的各种扩散分子（通常是蛋白质蛋白质），如转），如转录

23、因子；其编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不在录因子；其编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不在同一个同一个DNA分子上。分子上。转录因子转录因子(transcription factor)(transcription factor)是起正调控作用的反式作是起正调控作用的反式作用因子。用因子。v 转录因子是转录起始过程中转录因子是转录起始过程中RNARNA聚合酶所需的辅助因子。聚合酶所需的辅助因子。v 真核生物基因在无转录因子时处于不表达状态，真核生物基因在无转录因子时处于不表达状态，RNARNA聚合聚合酶自身无法启动基因转录。酶自身无法启动基因转录。 调控蛋白质包括调控蛋白质包括负调控负调

24、控因子（阻遏蛋白）因子（阻遏蛋白） 正调控正调控因子（转录因子）因子（转录因子） 原核生物调控蛋白种类较少（由于启动子或操作子原核生物调控蛋白种类较少（由于启动子或操作子 结构简单）结构简单） 真核生物调控蛋白种类较多，主要是真核生物调控蛋白种类较多，主要是转录因子转录因子2.1 TF的分类：的分类：(1) 通用反式作用因子通用反式作用因子，在一般细胞中普遍存在，主要识别，在一般细胞中普遍存在，主要识别一些启动子的核心启动成分一些启动子的核心启动成分TATA框，如框，如TBP；上游启动子；上游启动子成分成分CAAT框，如框，如CTF/NF-1；GC框如框如SP1；识别八聚体核；识别八聚体核苷酸

25、的苷酸的Oct-1等；等；(2) 特异反式作用因子：特异反式作用因子：特殊组织与细胞中的，如淋巴细胞特殊组织与细胞中的，如淋巴细胞中的中的Oct-2 ；(3) 诱导型因子：诱导型因子：和反应性元件（和反应性元件（response elenents）相结合）相结合的反式作用因子。的反式作用因子。 2.2 反式作用反式作用因子活性调节的主要方式因子活性调节的主要方式A 蛋白质和蛋白质和DNA相互作用；相互作用；B 蛋白质和配基结合；蛋白质和配基结合；C 蛋白质之间的相互作用蛋白质之间的相互作用;D 蛋白质的修饰。蛋白质的修饰。DNA binding domain，BD：100aa，氢键，大沟，氢键

26、，大沟transcription active domain，AD：30-100aaregular domain：与其它因子或调控蛋白结合：与其它因子或调控蛋白结合不与不与DNA直接结合的转录因子没有直接结合的转录因子没有DNA结合域，通过转结合域，通过转录激活域直接或间接作用与转录复合体而影响转录效率。录激活域直接或间接作用与转录复合体而影响转录效率。2.3 TF结构特征结构特征1） motif 基序，基元，花式基序，基元，花式构成任何一种特征序列或结构的基本单位，是超二构成任何一种特征序列或结构的基本单位，是超二级结构。级结构。与与DNA结合的功能域常见以下几种结构花式结合的功能域常见以下

27、几种结构花式/ /基元基元：锌指（锌指（Zinc finger region）亮氨酸亮氨酸“拉链拉链”式二聚体（式二聚体（leucine zipper）；）；螺旋螺旋-环环-螺旋结构（螺旋结构（helix-loop-helix，HLH） ：螺旋螺旋-转角转角-螺旋结构（螺旋结构（helix-turn-helix，HTH） ；螺旋转角螺旋锌指结构亮氨基拉链螺旋环螺旋 锌指（锌指（zinc finger）Zn2+与与4个个Cys 、或、或2个个Cys和和2个个His相结合。相结合。整个蛋白质分子有整个蛋白质分子有2-9个锌指重复单位。个锌指重复单位。每一个单位的指部伸入每一个单位的指部伸入DNA双

28、螺旋的深沟，接双螺旋的深沟，接触触5个核苷酸。个核苷酸。23aaCys- X2-4- Cys-X3-Phe- X5 -Leu- X2 -His- X3 -HisCys，His与与Zn2+结合形成结合形成4面体结面体结构，使中部的氨基酸回折成环，凸构，使中部的氨基酸回折成环，凸出如手指出如手指中部芳香族氨基酸保守，疏水中部芳香族氨基酸保守，疏水串联重复排列，两指间串联重复排列，两指间7-8aa锌指数目多少不等锌指数目多少不等A A. Cys2/His2, 经典经典SP1SP1与与GC盒结合的转录因子盒结合的转录因子SP1中有连续中有连续的的3个锌指重复结构。个锌指重复结构。B. Cys2/Cys

29、2 zinc fingerB. Cys2/Cys2 zinc fingerCys- X2- Cys-X13-Cys- X2- CysZn2+与与4个个Cys结合结合DNA结合序列较短，对称结合序列较短，对称无大量重复性锌指无大量重复性锌指 Cys2/Cys2与与 Cys2/His2不同不同例如例如GAL4，酵母的转录因子，酵母的转录因子 哺乳类的固醇类激素受体哺乳类的固醇类激素受体糖皮质激素特异性糖皮质激素特异性雌激素特异性雌激素特异性v 类固醇激素受体是以二聚体形类固醇激素受体是以二聚体形式发挥其促进转录作用的。它们式发挥其促进转录作用的。它们的两个锌指的功能不同。的两个锌指的功能不同。v第

30、第1个锌指的右侧是控制与个锌指的右侧是控制与DNA结合的，第结合的，第2个锌指的左侧个锌指的左侧则是控制形成二聚体的能力的。则是控制形成二聚体的能力的。 螺旋螺旋-环环-螺旋结构（螺旋结构（helix-loop-helix，HLH）4050aa含含2个个 -helix（1516aa）, 由连接区（由连接区（1228aa）连接；两亲性）连接；两亲性, amphipathic；通过疏水面作用形成二聚体；通过疏水面作用形成二聚体；NH2端为端为碱性碱性结合区，结合区，16aa，其中其中6aa6aa为保守序列为保守序列。Basic region6个共有aa不在IdMyoD 和Id的HLHMyoD-DN

31、A HOOC COOH HOOC COOH LL LL LL LL + + + + + + + + + + + + NH2 NH2 + + NH2 NH2 亮氨酸拉链 螺旋环螺旋(HLH)-COOH，每隔，每隔7个氨基酸出现一个氨基酸出现一个个Leu，后所有，后所有Leu出现在同一出现在同一侧面，成直线排列，形成疏水面侧面，成直线排列，形成疏水面依靠依靠Leu的疏水作用的疏水作用,2个个helix 相互缠绕，形成拉链结构相互缠绕，形成拉链结构-NH2,富含碱性氨基酸，富含碱性氨基酸，螺旋状，碱性螺旋状，碱性DNA结合域，结合域， 与与DNA双螺旋双螺旋链上带负电荷的磷酸基链上带负电荷的磷酸基团

32、结合团结合碱性碱性-亮氨酸拉链亮氨酸拉链（leucine zipper，ZIP）base ZIP motif Y形结构形结构GCN4 HOOC COOH HOOC COOH LL LL LL LL + + + + + + + + + + + + NH2 NH2 + + NH2 NH2 亮氨酸拉链 螺旋环螺旋(HLH)在真核生物中广泛存在在真核生物中广泛存在C/EBP 家族：与增强子蛋白家族：与增强子蛋白、CAAT盒结合（位于肝脏、小肠上皮、脂肪细胞和某些脑细胞）GCN4 酵母激活因子酵母激活因子CREB（cAMP应答元件结合蛋白）应答元件结合蛋白）原癌基因原癌基因jun, fos编码产物编码产

33、物Leu拉链可以拉链可以homodimer（同型二聚体）（同型二聚体）, heterodimer（异（异源二聚体）源二聚体）起作用，说明用各种不同组合，可产生不同的起作用，说明用各种不同组合，可产生不同的调控蛋白，能阅读多种序列（功能的灵活性）。调控蛋白，能阅读多种序列（功能的灵活性）。 螺旋螺旋-转角转角-螺旋螺旋（helix-turn-helix，HTH）至少有两个至少有两个螺旋，其间由短肽段形成的螺旋，其间由短肽段形成的转角或环连接，转角或环连接，二聚体形式存在，二聚体形式存在，距离正好相当于距离正好相当于DNA一个螺距（一个螺距（3.4nm），两个），两个螺旋刚螺旋刚好分别嵌入好分别嵌

34、入DNA的深沟。的深沟。许多调控蛋白都有许多调控蛋白都有HTHHTHLacO的的R蛋白蛋白阻遏蛋白与阻遏蛋白与cro蛋白蛋白CAP酵母接合型调控蛋白酵母接合型调控蛋白1，2玉米的玉米的Kn1水稻的水稻的OSH1 2） 转录激活域转录激活域酸性酸性-螺旋螺旋(acidic -helix) 谷氨酰胺丰富区谷氨酰胺丰富区(glutamine-rich domain)脯氨酸丰富区脯氨酸丰富区(proline-rich domain)不规则的，含双性不规则的，含双性 -helix2.3.2 蛋白质的修饰蛋白质的修饰蛋白质的磷酸化和去磷酸化是其转录活性调节的一种蛋白质的磷酸化和去磷酸化是其转录活性调节的一

35、种普遍形式。普遍形式。（1）蛋白质磷酸化、信号转导及基因表达）蛋白质磷酸化、信号转导及基因表达 蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导调节方式，几乎涉及所有的生理及病理过程，如糖代谢、光合作用、细胞的生长发育、神经递质的合成与释放甚至癌变等等。 蛋白质的磷酸化蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程。其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。 已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。 （2）蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用）蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用在胞

36、内介导胞外信号时具有专一应答特点。与信号传递有关的蛋白激酶类主要受控于胞内信使，如cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油，diacyl glycerol）等，这种共价修饰调节方式显然比变构调节较少受胞内代谢产物的影响。蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶“活性”。与酶的重新合成及分解相比，这种方式能对外界刺激做出更迅速的反应。对外界信号具有级联放大作用；蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应。被磷酸化的主要氨基酸残基：丝氨酸丝氨酸、苏氨酸苏氨酸和酪氨酸酪氨酸。组氨组氨酸酸和赖氨酸赖氨酸残基也可能被磷酸化。第四节第四节 转录起始和转录后加转录起始和转录后加工水平的调控工水平的

37、调控 1 mRNA前体的可变剪接前体的可变剪接 2 mRNA前体的反式剪接前体的反式剪接 3 rRNA和和tRNA的加工成熟的加工成熟 4 RNA编辑编辑 除了转录水平调控外，除了转录水平调控外，mRNA水平还决定于水平还决定于hnRNA加工、加工、mRNA运输，但对其机制了解不多。运输，但对其机制了解不多。hnRNAhnRNA 核内不均一核内不均一RNA RNA hnRNPhnRNP 与与RNARNA结合蛋白形成核糖核蛋白，蛋白质结合蛋白形成核糖核蛋白，蛋白质3/43/4 加工加工 5-capping, 3-polyA, splicing 5-capping, 3-polyA, splici

38、ng ，RNPRNP复合复合物中的蛋白质组分可能包含了各步骤所需的酶物中的蛋白质组分可能包含了各步骤所需的酶 mRNA mRNA mRNPmRNP 在细胞质中与蛋白质结合存在在细胞质中与蛋白质结合存在hnRNA 是是mRNA 的前体的前体hnRNA选择加工及运输选择加工及运输实验发现，在海胆囊胚细胞中，约有实验发现，在海胆囊胚细胞中，约有2万万种不同序列的种不同序列的hnRNA，其中，其中1.3万万种加工形成种加工形成mRNA；在成体肠细胞；在成体肠细胞中，约有中，约有2.5万万种种hnRNA，只有，只有3000种加工成种加工成mRNA。在囊胚中存在，而肠细胞中没有的在囊胚中存在，而肠细胞中没

39、有的mRNA序列，大多序列，大多数可在肠数可在肠mRNA中发现。中发现。说明海胆中许多基因的转录并不因组织的不同而有很说明海胆中许多基因的转录并不因组织的不同而有很大的差异。大的差异。不同组织调控自己不同组织调控自己mRNA水平的主要方式水平的主要方式似乎不在转录水平，而在对似乎不在转录水平，而在对hnRNA的选择加工，的选择加工，似乎似乎只有一小部分基因的调控发生在转录水平。只有一小部分基因的调控发生在转录水平。1、 mRNA前体的可变剪接前体的可变剪接1.1 mRNA剪接的种类：剪接的种类：组成型拼接组成型拼接: 一个基因的一个基因的mRNA前体按一种方式前体按一种方式剪切，产生一种剪切，

40、产生一种mRNA，一种蛋白质。，一种蛋白质。可变剪接（选择性拼接）可变剪接（选择性拼接） ：有些基因的：有些基因的mRNA前前体，按不同方式剪切，产生两种以上体，按不同方式剪切，产生两种以上mRNA，翻，翻译产生多种蛋白质。译产生多种蛋白质。组成型剪接组成型剪接可变剪接可变剪接选用不同的剪接位点产生不同的蛋白质选用不同的剪接位点产生不同的蛋白质（1）选用不同的起始位点，得到不同的蛋白质；（）选用不同的起始位点，得到不同的蛋白质；（酵酵母蔗糖酶母蔗糖酶Suc基因基因 ，小鼠小鼠-淀粉酶淀粉酶基因基因）；）；（2）选用不同的加尾位点产生不同的蛋白质（如免疫）选用不同的加尾位点产生不同的蛋白质（如免

41、疫球蛋白）；球蛋白）；（3）选用不同的剪接位点；）选用不同的剪接位点；（4）同时采用以上两种方式；）同时采用以上两种方式；1.2 可变剪接的方式：可变剪接的方式：v酵母蔗糖酶基因，有酵母蔗糖酶基因，有6 6个基因（个基因（SucSuc1-5,71-5,7）位于不同的染色体上。每一个）位于不同的染色体上。每一个基因都可以转录合成蔗糖酶，有胞内酶和胞外酶两种不同形式。基因都可以转录合成蔗糖酶，有胞内酶和胞外酶两种不同形式。v 前者的合成不受葡萄糖存在的影响，但含量低；前者的合成不受葡萄糖存在的影响，但含量低；v后者的合成受到葡萄糖的抑制。后者的合成受到葡萄糖的抑制。v胞外酶仅多了信号序列，经切除后

42、胞外酶比胞内酶在胞外酶仅多了信号序列，经切除后胞外酶比胞内酶在N-N-端仅多了一个端仅多了一个SerSer。不同的起始位点不同的起始位点小鼠小鼠- -淀粉酶基因存在淀粉酶基因存在2 2个不同启动子个不同启动子使得使得amyamy-1-1和和amyamy-2-2，amyamy-1-1在唾腺和肝中表达，在唾腺和肝中表达，amyamy-2-2在胰脏中表达在胰脏中表达 。不同的起始位点不同的起始位点不同的加尾位点不同的加尾位点剪接选择不同的剪接选择不同的5端内含子端内含子剪接选择不同的剪接选择不同的3端，内含子端，内含子 Intron的功能之一是使同一个基因表达出多种蛋白质，即的功能之一是使同一个基因

43、表达出多种蛋白质，即扩大扩大DNA中遗传信息的含量。中遗传信息的含量。 人类编码蛋白的基因人类编码蛋白的基因27000个，蛋白种类个，蛋白种类90000。 4060人类编码蛋白的基因发生可变剪接；人类编码蛋白的基因发生可变剪接； 高等真核生物基因组很大，完全能容纳更多的基高等真核生物基因组很大，完全能容纳更多的基因。为什么一方面它的许多基因非常分散，而另因。为什么一方面它的许多基因非常分散，而另一方面它又使一个基因产生出多种产物？一方面它又使一个基因产生出多种产物？1.3 可变剪接的意义可变剪接的意义令人不解令人不解 ！？！？ 由于可变剪接机制的多样化，一个基因可以由于可变剪接机制的多样化，一

44、个基因可以在转录后通过在转录后通过hnRNA的剪接加工而产生两个或的剪接加工而产生两个或更多的蛋白质。因此基因的定义也应随之扩展更多的蛋白质。因此基因的定义也应随之扩展，即不应以多肽产物为单位，应以，即不应以多肽产物为单位，应以独立转录的独立转录的一段一段DNA作为确定一个基因的标准？作为确定一个基因的标准？2、 mRNA前体的反式剪接前体的反式剪接顺式剪接（顺式剪接（cis-splicing）：内含子的剪接一般都：内含子的剪接一般都是发生在同一个基因内，切除内含子，相邻的外是发生在同一个基因内，切除内含子，相邻的外显子彼此连接。显子彼此连接。反式剪接（反式剪接（trans-splicing）

45、：不同基因的外显子：不同基因的外显子剪接后相互连接。剪接后相互连接。v 反式剪接的反式剪接的5端外显端外显子称为子称为剪接前导剪接前导RNA（spliced leader RNA，SL RNA） vSL RNAs存在于几种存在于几种锥虫和线虫锥虫和线虫(C.elagan)中，它们具有共同的特中，它们具有共同的特点；点；其结构类似于其结构类似于U1的的Sm结合位点。即结合位点。即SL RNA和和U1 snRNA一样一样具有可以和内含子具有可以和内含子5端端剪接位点识别和结合的剪接位点识别和结合的功能。功能。3、rRNA和和tRNA的加工成熟的加工成熟rRNA加工有两个内容，一个是分子内的切割，另

46、一个是化学修饰。真核生物的rRNA基因转录时，先产生一个45S的前体rRNA，然后被核酸酶逐渐降解，形成成熟的18S、28S和5.8S rRNA。 rRNA基因转录主要在细胞核仁内进行，初级转录产物45S前体rRNA很快就会被加工降解，生成不同相对分子质量的成熟rRNA。 rRNA的化学修饰主要是甲基化，原核生物rRNA主要是碱基碱基甲基化，而真核生物rRNA则主要是核糖核糖甲基化。 tRNA基因转录时也可能先生成前体tRNA，然后再进行加工成熟。一般认为，tRNA基因的初级转录产物在进入细胞质后，首先经过核苷的修饰，生成4.5S前体tRNA，再行剪接成为成熟tRNA（4S）。第五节第五节 翻

47、译水平的调控翻译水平的调控1 mRNA运输控制运输控制2 mRNA稳定性的调控稳定性的调控3 mRNA结构结构4 翻译的起始调节翻译的起始调节5 选择性翻译选择性翻译 6 翻译的自我调节翻译的自我调节7 RNA调控调控1 、mRNA运输控制运输控制 运输控制（运输控制（transport control）是对转录本从细胞是对转录本从细胞核运送到细胞质中的数量进行调节。核运送到细胞质中的数量进行调节。 合成的合成的RNA大约有大约有1/12能被运出核能被运出核进入细胞质，进入细胞质，50左右的在核内降解，还有一些留在核。左右的在核内降解，还有一些留在核。 2、 mRNA稳定性的调控稳定性的调控

48、mRNA的寿命；的寿命；原核生物原核生物mRNA的半衰期很短，平均大约的半衰期很短，平均大约3min。高等真核生物迅速生长的细胞中高等真核生物迅速生长的细胞中mRNA的半衰期平均的半衰期平均3h。在高度分化的终端细胞中许多在高度分化的终端细胞中许多mRNA极其稳定，有的寿命长极其稳定，有的寿命长达数天。达数天。 在细胞质中所有的在细胞质中所有的RNA都要受到都要受到降解控制（降解控制（degradation control）。 不同不同mRNA降解效率的不同。降解效率的不同。 加入调节物加入调节物可以增加可以增加mRNA稳定性，并使相关基因转录速稳定性，并使相关基因转录速率增加。率增加。 mR

49、NA的选择性降解主要由于的选择性降解主要由于核酸酶核酸酶和和mRNA内部结构内部结构相相互作用的结果。互作用的结果。 表表 特殊效特殊效应应分子分子对对于各于各种组织种组织和和细细胞中的胞中的mRNA稳稳定性的定性的调节调节mRNA组织或细胞调控因子mRNA的半衰期有 调 节因子无调节因子卵黄蛋白原肝（蛙）雌激素500h16h卵黄蛋白原肝（母鸡）雌激素24h3h极低密度脂蛋白原肝（母鸡）雌激素 2 0 -24h24h2-5h酪蛋白乳腺（大鼠）促乳素92h5h前列腺甾类结合蛋白前 列 腺（大鼠）雄激素增 加 3 0倍 mRNAmRNA的选择性降解在很大程度上是由于核酸酶和的选择性降解在很大程度上

50、是由于核酸酶和mRNAmRNA内部结构相互作用的结果内部结构相互作用的结果 3 、mRNA的结构的结构3.1 mRNA53.1 mRNA5前导序列对翻译水平的影响前导序列对翻译水平的影响 55m7m7G G帽结构是否存在和是否易于接近帽结构是否存在和是否易于接近eIF-4FeIF-4F的程度对翻译效率有着的程度对翻译效率有着明显的影响。明显的影响。起始密码子起始密码子AUGAUG的位置和其侧翼的序列对翻译的效率也有影响。的位置和其侧翼的序列对翻译的效率也有影响。 55端非翻译区的长度也会影响到翻译的效率和起始的精确性，当此端非翻译区的长度也会影响到翻译的效率和起始的精确性，当此区长度在区长度在

51、171780Nt80Nt之间时，体外翻译效率与其长度变成正比。之间时，体外翻译效率与其长度变成正比。在在5 5UTRUTR中存在碱基配对区时，可以形成发夹式或茎环二级结构，这中存在碱基配对区时，可以形成发夹式或茎环二级结构，这类结构会阻止核糖体类结构会阻止核糖体40S40S亚基的迁移，对翻译起始有抑制作用。亚基的迁移，对翻译起始有抑制作用。3.2 mRNA33.2 mRNA3端的结构对翻译速率和端的结构对翻译速率和mRNAmRNA寿命的影响寿命的影响mRNA 3端的端的poly(A)不仅和不仅和mRNA穿越核膜的能力有穿越核膜的能力有关，而且影响到关，而且影响到mRNA的稳定性和翻译效率。的稳

52、定性和翻译效率。poly(A)越长越长mRNA作为模板的使用的半衰期越长。作为模板的使用的半衰期越长。Poly(A)对翻译的促进作用是需要对翻译的促进作用是需要PABP（poly(A)结合结合蛋白）的存在。蛋白）的存在。 第六节第六节 翻译翻译后水平的调控后水平的调控翻译后产生的多数蛋白质无生物活性，必须经过切割翻译后产生的多数蛋白质无生物活性，必须经过切割加工、水解、化学修饰、剪接加工、水解、化学修饰、剪接;某些蛋白质有选择的受到抑制某些蛋白质有选择的受到抑制;某些蛋白质必须位于细胞内特定位置，如溶酶体、线某些蛋白质必须位于细胞内特定位置，如溶酶体、线粒体、叶绿体粒体、叶绿体;需同其他蛋白质

53、结合，组装成功能单位，如血红蛋白、需同其他蛋白质结合，组装成功能单位，如血红蛋白、微管蛋白、核糖体等，都是由多条蛋白质分子结合在微管蛋白、核糖体等，都是由多条蛋白质分子结合在一起形成的功能单位。一起形成的功能单位。 从核从核糖糖体释放出的新生多肽链不具备蛋白质体释放出的新生多肽链不具备蛋白质生物活性，必需经过不同的翻译后复杂加工过程生物活性，必需经过不同的翻译后复杂加工过程才转变为具有天然构象的功能蛋白。才转变为具有天然构象的功能蛋白。再经过再经过靶向靶向输送到特定细胞部位发挥生物输送到特定细胞部位发挥生物学学作用作用。1.1.蛋白质的正确折叠（分子伴侣）蛋白质的正确折叠（分子伴侣）多肽链折叠

54、为天然功能构象的蛋白质多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成，新生肽链新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成，新生肽链N端在核糖体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序端在核糖体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模序、结构域到形成完整空间构象。序、结构域到形成完整空间构象。 一般认为，多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋白质折叠的一般认为，多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋白质折叠的信息，即信息，即一级结构是空间构象的基础一级结构是空间构象的基础。细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是

55、自动完成，而需要细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶、蛋白辅助。其他酶、蛋白辅助。 几种有促进蛋白折叠功能的大分子几种有促进蛋白折叠功能的大分子（助折叠蛋白）（助折叠蛋白）（1）分子伴侣）分子伴侣 (molecular chaperon) （2）蛋白二硫键异构酶）蛋白二硫键异构酶 (protein disulfide isomerase, PDI)（3） 肽肽-脯氨酰顺反异构酶脯氨酰顺反异构酶 (peptide prolyl cis-trans isomerase, PPI) 热休克蛋白热休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和和G

56、reE族族 伴侣素伴侣素(chaperonins) GroEL和和GroES家族家族分子伴侣分子伴侣分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，可分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。整体蛋白质的正确折叠。 HSP的基本结构与功能的关系的基本结构与功能的关系伴侣素伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程系统促进蛋白质折叠过程 伴侣素的主要作用伴侣素的主要作用为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境的微环境。 蛋白二硫键异构酶蛋白二硫键异构酶 多肽链内或

57、肽链之间二硫键的正确形成多肽链内或肽链之间二硫键的正确形成对稳定分泌蛋白、膜蛋白等的天然构象十分对稳定分泌蛋白、膜蛋白等的天然构象十分重要，这一过程主要在重要，这一过程主要在细胞内质网细胞内质网进行。进行。 二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象学最稳定的天然构象。 肽肽- -脯氨酰顺反异构酶脯氨酰顺反异构酶 多肽链中肽酰多肽链中肽酰- -脯氨酸间形成的肽键有顺反脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体

58、，空间构象明显差别。在肽链合成两种异构体，空间构象明显差别。在肽链合成需形成需形成顺式构型顺式构型。肽酰肽酰- -脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。种异构体之间的转换。 肽酰肽酰- -脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶。成的限速酶。伴侣素伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程系统促进蛋白质折叠过程 伴侣素的主要作用伴侣素的主要作用为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境然空间构象的微环境。 蛋白质合成后需要经过复杂机制，定蛋白质合成后需要经

59、过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。这一过程称为蛋白质的靶向输送。 蛋白质的靶向输送蛋白质的靶向输送2.2.通过信号肽分拣、运输、定位通过信号肽分拣、运输、定位所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列信号序列 。 信号序列信号序列(signal sequence)靶向输送蛋白靶向输送蛋白信号序列或成分信号序列或成分分

60、泌蛋白分泌蛋白N端信号肽端信号肽内质网腔蛋白内质网腔蛋白N端信号肽，端信号肽，C端端-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-(KDEL序列序列)线粒体蛋白线粒体蛋白N端信号序列（端信号序列（2035氨基酸残基）氨基酸残基）核蛋白核蛋白核定位序列（核定位序列（-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-，SV40 T抗原）抗原）过氧化体蛋白过氧化体蛋白-Ser-Lys-Leu-（PST序列）序列）溶酶体蛋白溶酶体蛋白Man-6-P（甘露糖（甘露糖-6-磷酸）磷酸）靶向输送蛋白的信号序列或成分靶向输送蛋白的信号序列或成分 （1）分泌蛋白的靶向输送）分泌蛋白的靶向输送真核细胞