第四章_克隆载体的特征及类型

1、第四章 基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA粘粒（cosmid）与噬菌粒人工染色体载体载体的功能及特征载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。第一节 载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；具有筛选转化

2、子的选择性标记基因；分子量小，拷贝数多；具有较高的外源DNA的载装能力；安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。自主复制型载体和附加载体的扩增方式 载体的类型n应用范围：克隆载体、表达载体。n应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。n构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体。克隆载体(cloning vector) 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。表达载体(expression vector) 使目的基因在

3、宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。穿梭载体(shuttle vector) n又称双功能载体，能在两种不同的生物体内复制的载体。n同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(ARS)，它既能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。n主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。第二节 质粒质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；绝

4、大多数的质粒是DNA型质粒常见于原核细菌和真菌中质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。 Plasmid chromosome 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA质粒质粒的基本特征1. 质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒 1 - 5 拷贝 stringent plasmid松弛型复制控制的质粒 1

5、0 - 60 拷贝 stringent plasmid质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合oriE.coli ColE1 plasmid复制方向rop（+）RopRNA IIRNA I3553RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物 质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系质粒质粒的基本特征2. 质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构

6、的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成不相容性群。亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。质粒质粒的基本特征质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内(亲和性质粒)其中

7、拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势质粒质粒的基本特征3. 质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等如Col、R的其它成员非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。在基因工程应用的是重组缺陷型（rec）的质粒和菌株。质粒质粒的基本特征4. 质粒的重组性质粒质粒的基本特征5. 携带特殊的遗传标记野生型的质粒DN

8、A上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义 利用利用抗性抗性基因基因进行进行重组重组子的子的筛选筛选质粒基因编码的特性nFertility /F质粒：只含有tra基因，除了促进接合转移外没有其他功能。nResistance / R质粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因。如RP4，发现于假单胞杆菌。nCol 质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于E. coli 中的CoE1。n降解质粒（Degradative plasmi

9、ds）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。n致瘤质粒（Virulence plasmids）：农杆菌Ti质粒。天然存在的两种质粒colE1colE1宿主细菌大肠杆菌，宿主细菌大肠杆菌，6.5kb6.5kb，松弛型复制，松弛型复制20-20-30/cell30/cellpSC101pSC101宿主细菌沙门氏菌，宿主细菌沙门氏菌，8.8kb8.8kb，严谨型复制，严谨型复制5/cell5/cell，标记基因为，标记基因为TcTcr质粒质粒的构建理想的质粒载体应具备的条件1.分子量较小。 2.松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。3.具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有一个强的选择

10、标记。4.具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。5.能够导入寄主细胞，具备转化的功能。6.操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质粒载体。天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要

11、的片段，提高导入效率，增加装载量）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。质粒人工构建的目的质粒人工构建的目的质粒质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整

12、合等不同性质测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒 装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒 装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选质粒重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322： 氯霉素可扩增拷贝数 50 - 100 / cell用于基

13、因克隆 优点：n分子量小：4363bp, 容易纯化。n含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。n受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素，可达到1000-3000拷贝。缺点：n有被动迁移的可能，不够安全。n抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19： 拷贝数

14、2000 - 3000 / cell用于基因克隆和测序 装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIIIpUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个小片段上。pUC18的优点：1）突变位点位于复制起点，提高了拷贝数。2) 重组子的鉴定

15、可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。3）多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不必连接linker。4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和体外定点突变。质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal质粒重要的大肠杆菌质粒载体pG

16、EM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记 lacZ用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等在重组的在重组的pGEM3ZpGEM3Z载体中载体中加入相应的加入相应的RNARNA聚合酶聚合酶，可以，可以发生外源基因发生外源基因转录。转录。质粒载体总体评价n操作简便n克隆容量有限（ 10kb）第二节 噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率

17、高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来。高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体的生物学特性： 生物结构l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因约有约有20kb的区域为为噬菌体的区域为为噬菌体生长非必需生长非必需的的，可以缺失或被外源，可以缺失或被外源DNA片段所取代。片段所取代。l 噬菌体生物学特性： 生物结构5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos头部

18、合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l l - DNA黏性末端噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特性： 感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特性： 感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kbDA噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl 噬菌体生物学特性： 溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上

19、，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于裂解状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度 野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体取代型载体噬菌体或病毒DNA大

20、肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度 37 kb插入片段大小：0 - 14 kb（51 37）重组与否均可包装重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因必须携带标记基因。噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度 10 kb（51 26）载体长度 26 kb插入片段最大装载长度 25 kb（36 26）噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l

21、-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记 imm434imm434基因编码一种阻止l

22、-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记 lacZlacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA重组分子的体外包装：l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受

23、体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA及其重组分子的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒 密度已达1013 -101

24、4 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放l-DNA 乙醇或异丙醇沉淀l-DNA 噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的 l 噬菌体DNAl-DNA作为载体的优点：l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达 外源基因第三节 考斯质粒 l-DNA载体装载量为25 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。 在包

25、装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。n将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的含有1978年Collins和Hohn发明构建pHC796400 bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体cos site - carrying plasmid1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段装载范围为31 - 4