第12章电泳技术

1、生物化学技术原理及应用生物化学技术原理及应用第十二章第十二章 电泳技术电泳技术(electrophoresis, EP)电泳技术电泳技术2022-5-11海南海南大学大学 农农学院学院2 带电颗粒在电场作用下，带电颗粒在电场作用下，由于所带电荷及颗粒形由于所带电荷及颗粒形状大小等不同，状大小等不同，向与其电性相反的电极移动的向与其电性相反的电极移动的速度速度不同，从而达到分离目的一种方法不同，从而达到分离目的一种方法称为称为电泳电泳。 电泳技术已被广泛应用于蛋白质、核酸和氨基酸电泳技术已被广泛应用于蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离鉴定。等物质的分离鉴定。v18091809年发现带电粒子在电场作

2、用下向相反电极移动年发现带电粒子在电场作用下向相反电极移动的现象；的现象；v19371937年瑞典科学家年瑞典科学家TiseliusTiselius建立了建立了“移界电泳法（移界电泳法（U U形形管电泳）管电泳）”，成功地分离血清蛋白质各成分；，成功地分离血清蛋白质各成分；v5050年代，不断改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介年代，不断改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物；作为支持物；v6060年代，找到聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在年代，找到聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了此基础上发展

3、了SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。2022-5-11海南海南大学大学 农农学院学院32022-5-114电泳形式的演变电泳形式的演变海南海南大学大学 农农学院学院2022-5-115 电泳基本原理电泳基本原理1 电泳技术分类电泳技术分类2 电泳技术方法电泳技术方法3 电泳检测技术电泳检测技术4主要内容主要内容海南海南大学大学 农农学院学院第一节第一节 电泳基本原理电泳基本原理v在一定在一定

4、pHpH条件下，每种分子都具有特定的电荷、条件下，每种分子都具有特定的电荷、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的行分离、分析和鉴定的基本原理基本原理。第一节第一节 电泳基本原理电泳基本原理v 带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率迁移率或或泳动度泳动度。v 电泳时，带电颗粒在介质中受力平衡匀速运动 则： v = FE/f = F阻阻/f = Eq/f = Eq/(6

5、r)nE 电场强度nq 颗粒所带电荷nr 颗粒半径n 介质黏度n v 泳动度n F阻 颗粒所受阻力n FE 颗粒所受电场力n f 摩擦系数可见泳动度与颗粒所带电荷、颗粒半可见泳动度与颗粒所带电荷、颗粒半径、介质黏度以及电场强度有关。径、介质黏度以及电场强度有关。2022-5-117海南海南大学大学 农农学院学院泳动度泳动度v 染色后，量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。 Rf 谱带迁移距离谱带迁移距离 / 指示剂迁移距离指示剂迁移距离2022-5-118相对迁移率（相对迁移率（Rf） 测量迁移率时，应以谱带的中部位置为准； 电泳时多种因素会影响带电颗粒的迁移速度。为了使试验重复性好，这些因子

6、都应尽可能保持恒定。海南海南大学大学 农农学院学院第一节第一节 电泳基本原理电泳基本原理2022-5-11南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院9迁移距离迁移距离R1溴酚蓝带溴酚蓝带R2胶的界面胶的界面蛋白分离起点蛋白分离起点 1. 电场强度：电场强度：v电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。v根据电场强度的不同，电泳可分为：n常压常压(100-500V)(100-500V)电泳：电泳：其电场强度为2-10V/cm。分离时间较长，从数小时到数十小时 ，适合于分离蛋白质等大分子物质。n高压高压(2000-10000V)(2000-10000V)电泳：电泳

7、：其电场强度为50-200V/cm，电泳时间短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。第一节第一节 电泳基本原理电泳基本原理影响泳动度的因素：影响泳动度的因素：2022-5-1110海南海南大学大学 农农学院学院 2. 溶液溶液pHv 溶液pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的多少。v 对蛋白质而言，溶液pH值离等电点越远，则颗粒所带净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。第一节第一节 电泳基本原理电泳基本原理影响泳动度的因素：影响泳动度的因素：第一节第一节 电泳基本原理电泳基本原理pH值影响蛋白值影响蛋白质的带电性质质的带电性质 3. 溶液的离子强度

8、溶液的离子强度v 缓冲液离子强度越高离子强度越高，则颗粒的电动电势越小，泳动度越小泳动度越小。一般最适合的离子强度在0.02-0.2之间。第一节第一节 电泳基本原理电泳基本原理影响泳动度的因素：影响泳动度的因素：2022-5-1113海南海南大学大学 农农学院学院影响泳动度的因素：影响泳动度的因素：第一节第一节 电泳基本原理电泳基本原理 4. 电渗电渗v 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。v 如纸电泳时，滤纸吸附OH- 离子带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好。 5. 温度温度/焦耳热焦耳热v 电泳时会生热，使介质粘度下降，分子

9、运动加快，迁移率增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，因此电泳时，要控制电压或电流，或安装冷却散热装置。第一节第一节 电泳基本原理电泳基本原理影响泳动度的因素：影响泳动度的因素：影响泳动度的因素：影响泳动度的因素： 6.支持物支持物v 支持物要求均匀、吸附力和电渗小、机械性能好、便于染色或紫外光下检测，故最好透明，无紫外吸收。v 支持物性质不同也会影响泳动速率，如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶都有大小不同的筛孔，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速率快，反之则慢。第二节第二节 电泳技术分类电泳技术分类v按电泳的原理来分，按电泳的原理来分，可分为四种：n区带电泳区带电泳：电泳过程中，不同的离子成分

10、在均一的缓冲液体系中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。n移界电泳移界电泳：是Tiselius最早建立的电泳，它是在U形管中进行的，由于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。n等速电泳等速电泳：需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各组分的区带相随并形成清晰的界面，并以等速移动。n等电聚焦等电聚焦：两性电解质载体在电场中自动形成pH梯度，被分离物移动至各自等电点pH处聚集成很窄的区带。后两种电泳中，带电颗粒在电场作用下迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后电泳区带的宽度保持不变，也称稳态电泳。第二节第二节 电泳技术分类电泳技术分类v 根据电泳是在溶液还是在固体支持物中在溶液还是在固体支持物

11、中进行，可分为：l 自由电泳自由电泳。 显微电泳（也称细胞电泳）； 移界电泳； 柱电泳； 自由流动幕电泳； 等速电泳等。l 支持物电泳支持物电泳。根据支持物的特点又可分为：n纸电泳n薄层电泳n薄膜电泳n凝胶区带电泳（淀粉凝胶、聚丙烯酰 胺电泳、琼脂糖凝胶电泳）n非凝胶性支持物区带电泳 (支持物有： 淀粉、纤维素粉、玻璃粉、硅胶等)v据用途用途不同又可分为：分析电泳、制备电泳、定量电泳、免疫电泳。v电泳槽的形式电泳槽的形式也是多种多样的：垂直形、水平形、柱状、板状、毛细管、湿小室及幕状的。第二节第二节 电泳技术分类电泳技术分类2022-5-1119海南海南大学大学 农农学院学院2022-5-11

12、南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院20第三节第三节 电泳技术方法电泳技术方法v 电泳种类很多，原理基本相同，但又有各自的特点。v 一般生化实验室常用的电泳技术方法介绍如下：1. 纸电泳纸电泳2. 薄层电泳薄层电泳3. 薄膜电泳薄膜电泳4. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 连续密度梯度电泳连续密度梯度电泳6. 毛细管电泳毛细管电泳 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 双向电泳双向电泳1. 纸电泳纸电泳v 纸电泳是以滤纸为支持体的电泳技术。纸电泳是以滤纸为支持体的电泳技术。v 根据电场强度的不同，分为常压、

13、高压纸电泳两类。根据电场强度的不同，分为常压、高压纸电泳两类。n高压电泳速度快，适用于小分子物质，如氨基酸、核昔酸等的分离，由于电压高，发热量大，需附有冷却装置。n常压电泳设备简单，适于大分子分离，电泳速度较慢，区带易扩散。2. 薄层电泳薄层电泳v薄层电泳是将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄薄层电泳是将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层而进行电泳的技术。层而进行电泳的技术。v常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等。常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等。v其中以淀粉最为常用：淀粉易成型、对蛋白质吸附其中以淀粉最为常用：淀粉易成型、对蛋白质吸附少、样品易洗脱、电渗作用低、分离效果好。少、样品

14、易洗脱、电渗作用低、分离效果好。v淀粉板薄层电泳所用缓冲液可用纸电泳的缓冲液，淀粉板薄层电泳所用缓冲液可用纸电泳的缓冲液，如巴比妥缓冲液、如巴比妥缓冲液、Tris-Tris-磷酸盐缓冲液等。但由于淀磷酸盐缓冲液等。但由于淀粉颗粒有离子交换作用，因此必须采用离子强度较粉颗粒有离子交换作用，因此必须采用离子强度较高的缓冲液。高的缓冲液。2022-5-1123海南海南大学大学 农农学院学院3. 薄膜电泳薄膜电泳v以醋酸纤维制成的薄膜作为支撑体的电泳。以醋酸纤维制成的薄膜作为支撑体的电泳。v醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。将之溶于丙酮等

15、有机溶剂，即可涂布成酰化而成。将之溶于丙酮等有机溶剂，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度约以均一细密的微孔薄膜，厚度约以0.1-0.15mm0.1-0.15mm为宜。为宜。v由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其他生物白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其他生物大分子。大分子。 2022-5-1124海南海南大学大学 农农学院学院4. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳v对于分子量大的样品，如大分子核酸，病毒对于分子量大的样品

16、，如大分子核酸，病毒等，一般采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电等，一般采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。泳分离。 天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖( (约约80%)80%)及琼脂及琼脂胶组成。胶组成。琼脂糖是由琼脂糖是由D-D-半乳糖和半乳糖和3,6-3,6-脱水脱水-L-L-半乳糖的残基交替半乳糖的残基交替排列织成的直链多糖，为中性物质，不带电荷。排列织成的直链多糖，为中性物质，不带电荷。 常用于分离蛋白质和同工酶，以及分离、鉴定核酸。常用于分离蛋白质和同工酶，以及分离、鉴定核酸。 由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分由于这种方法操作方便，设备简

17、单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。4.1 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点2022-5-1126海南海南大学大学 农农学院学院v 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子质量及分子构型，以及凝胶的浓度。分子质量及分子构型，以及凝胶的浓度。v 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系nDNA分子的大小：n在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，便可测出未知

18、片段的大小。n但是当DNA分子大小超过20kb时，电泳的迁移率不再依赖于分子大小，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。n琼脂糖的浓度： 不同大小DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 4.2 DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖浓琼脂糖浓度度(%)线型线型DNA分子大小分子大小(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.232.00.124.2 DNA的琼脂糖凝胶电泳：的琼脂糖凝胶电泳：v核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系n不同构型不同构型DNA的移动速度次序为：的移动速度次序为：n共价闭环共价闭环DNA(

19、cccDNA)DNA(cccDNA)直线直线DNADNA开环开环的双链环状的双链环状DNADNAn这这3种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，同时种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，同时也受电流强度、缓冲液离子强度等的影响。也受电流强度、缓冲液离子强度等的影响。 4.2 DNA的琼脂糖凝胶电泳：的琼脂糖凝胶电泳：2022-5-1129海南海南大学大学 农农学院学院v 电泳方法电泳方法： 凝胶类型凝胶类型n琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型(平板型)。n水平型称为潜水式，因为它制胶和加样方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而受到人们的欢迎。4.2 DNA

20、的琼脂糖凝胶电泳：的琼脂糖凝胶电泳：v 电泳方法电泳方法： 缓冲液系统缓冲液系统n离子强度低时，电流太小，DNA迁移慢；离子强度太高，电流太大会大量产热，严重时会造成胶熔化和DNA变性。n常用的电泳缓冲液Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等，浓度约为50mmol/L(pH7.5-7.8)。nTAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。nTBE与TPE缓冲容量高，DNA分离效果更好。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，故应室温下贮存5溶液，用时稀释10倍。TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀。2022-5-1131海南海南大学大

21、学 农农学院学院v 电泳方法电泳方法： 凝胶的制备凝胶的制备n以电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框，插入梳子，自然冷却。n可在溶胶中加入一定量的EB或其它荧光染料，便于连续观察样品的电泳情况，检测效果也更好。 样品配制与加样样品配制与加样nDNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解（内含0.25%溴酚蓝，10%-15%蔗糖或5%-10%甘油）。n为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5% Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。2022-5-1132海南海南大学大学 农农学院学院v 电泳方法电泳方法： 电泳电泳n在低浓度、低电压下，分离效果较好。

22、在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。随着电压增高，分辨率下降，一般电场强度不宜高于5V/cm。n温度对于温度对于DNADNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4，进行电泳。 染色和拍照染色和拍照n常用溴乙锭(EB)染色，在紫外下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片。2022-5-11南京农业大学南京农业大学 生命科学学院生命科学学院342022-5-11海南海南大学大学 农农学院学院35PCR产物的琼

23、脂糖电泳 100 200 300 1,650 1,000 500 850 650 400 5,000 bp 2,000DNA ladderDNA ladderPCR 产物产物1 2 3 4 5 6 7 8胶孔胶孔+ - - + - + + -引物二聚体引物二聚体v 如果需要对电泳分离后的DNA进行分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作v 1975年，Southern创造了将经琼脂糖凝胶电泳后的DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜(NC膜)上，再进行杂交的方法，被称为Southern印迹法。v 随后出现RNA印迹（Northern印迹），蛋白质印迹（Western印迹）等。4.3 印迹转移电泳印迹

24、转移电泳2022-5-1137海南海南大学大学 农农学院学院v 一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使DNA变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而迁移率迁移率与分子大小的关系不大与分子大小的关系不大。v 如此时改变电场方向，则DNA分子必须改变其构象，沿新的泳动方向伸直，而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。v 1983年，Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫时间与DNA分子大小有关的特性，设计了脉冲电场梯度凝胶。Carle等改进了电泳技术，并发现周期性的反转换电场亦能使大分子 DNA 通过电泳分开。4.4 交变脉冲电场凝

25、胶电泳交变脉冲电场凝胶电泳4.4 交变脉冲电场凝胶电泳交变脉冲电场凝胶电泳 4.5 RNA电泳：电泳：v RNARNA电泳基本过程同电泳基本过程同DNADNA电泳一样。电泳一样。v 但应明确一点的是，因为但应明确一点的是，因为RNARNA分子对分子对RNARNA酶的作用非酶的作用非常敏感，因此必须用对常敏感，因此必须用对RNARNA酶有抑制作用酶有抑制作用DEPCDEPC水来水来配置所有溶液，所有与配置所有溶液，所有与RNARNA接触的仪器和装置都要严接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少格处理以尽量减少RNARNA酶对样品的降解。酶对样品的降解。v 另外，因为另外，因为RNARNA分子有二、

26、三级结构可以影响其电泳分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。性剂为甲醛和戊二醛。2022-5-1140海南海南大学大学 农农学院学院5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳v 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE）。v聚丙烯酰胺凝胶电泳又有以下几种：n非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳n变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电

27、泳n连续密度梯度电泳连续密度梯度电泳n聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳n聚丙烯酰胺凝胶双向电泳聚丙烯酰胺凝胶双向电泳5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳2022-5-1142海南海南大学大学 农农学院学院5.1. 凝胶聚合的原理及有关特性凝胶聚合的原理及有关特性5.1.1. 聚合反应聚合反应5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳5.1.1. 聚合反应聚合反应v 聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下合成的。v 催化系统常用有两种： 过硫酸氨过硫酸氨TEMED化学催化聚合系统化学催化聚合系统n此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，微量TEMED的加入，可使过硫

28、酸氨（APS，催化剂）形成自由基。这些自由基的产生可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。 核黄素核黄素TEMED光聚合催化系统光聚合催化系统n此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳5.1.2. 凝胶孔径的可调性及其有关性质凝胶孔径的可调性及其有关性质A. 凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶性能与总浓度及交联度的关系： 凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比。v a/b与凝胶

29、的机械性能密切相关。 当a/b10时，凝胶脆而易碎，坚硬呈乳白色； a/b100时，即使5%的凝胶也呈糊状，易于断裂。 欲制备完全透明而又有弹性的凝胶，应控制a/b=30左右。na Acr克数nb Bis克数5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳n T Acr和Bis总浓度n C 交联剂百分比n V 缓冲液体积(mL)5.1.2. 凝胶孔径的可调性及其有关性质凝胶孔径的可调性及其有关性质v 不同浓度的单体对凝胶性能影响很大。Davis的实验发现Acr2%，Bis0.5%，凝胶就不能聚合。当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。v 通常，T为2-5%时，a/b=20左右；T为5-10%时，a/b=40左右；

30、T为15-20%时，a/b=125-200左右，为此Richard等(1965)提出一个选择c和T的经验公式；C = 6.50.3Tv 此公式适用于T为5-20%范围内的c值(可有1%的变化)。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳2022-5-1146海南海南大学大学 农农学院学院5.2. PAGE原理（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）原理（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）v 据电泳装置不同分为据电泳装置不同分为圆盘电泳圆盘电泳、垂直板电泳垂直板电泳5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.2. PAGE原理原理v 据浓缩效应的有无，分为连续系统连续系统与不连续系统不连续系统两大类。n连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同

31、，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷电荷及分子筛效应；n不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.2. PAGE原理原理v 据缓冲液PH，可分为碱性系统碱性系统、酸性系统酸性系统和中性系统中性系统。v 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶组成。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶利用： 凝胶孔径的不连续性 缓冲液离子的不连续性 PH的不连续性 电位梯度的不连续性使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进行分离。 5.2.1. 样品浓

32、缩效应样品浓缩效应v 凝胶孔径的不连续性：凝胶孔径的不连续性：n浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。n样品在大孔胶中泳动的阻力小，移动快；当进入小孔胶时, 受到的阻力大，移动减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。 v 电位梯度的不连续性：电位梯度的不连续性：n电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。 5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.2.1. 样品浓缩效应样品浓缩效应v 缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：值的不连续性：n在凝胶中有Tris及HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值

33、，是缓冲配对离子。HCl在任何pH溶液中均易解离出Cl ，在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子快离子。n电极缓冲液中的甘氨酸(pI=6.0)，在pH8.3的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.1-1%，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子慢离子。n带负电的蛋白质向正极移动，迁移率介于快、慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；蛋白质分子由于相对分子质量大，被留在后面，逐渐分成多个区带。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳离子缺乏区间离子

34、缺乏区间 5.2.2.分子筛效应分子筛效应v 大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率的程度不同而表现出不同的迁移率 ，这就是，这就是分子筛效应分子筛效应。v 当样品进入分离胶时，pH值和凝胶孔径突然改变，慢离子（Gly-）的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加，超过蛋白质的有效泳动率。这样，高电势梯度不存在了，各种蛋白质仅会由于其分子量或构型的不同，通过一定孔径的分离胶时所受阻滞的程度不同，表现不同的泳动率而被分开。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.3 变性变性PAGE原理原理v 聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝

35、胶和变性凝胶两种。n所谓非变性凝胶非变性凝胶，即在凝胶中不加变性剂，这种凝胶中，蛋白质的迁移率受它的蛋白质的迁移率受它的静电荷静电荷与与分子大小分子大小两个因素的影响两个因素的影响。因此在非变性凝胶中进行电泳是不能测分子量的。n所谓变性凝胶变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS、巯基乙醇、DTT等，破坏或改变蛋白质的结构，把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷，掩盖蛋白质正常带有的电荷。蛋白质蛋白质在这种变性凝胶中的迁移率与它们在这种变性凝胶中的迁移率与它们分子量的对数分子量的对数成直线关成直线关系。系。因此利用变性凝胶进行电泳可以测分子量。5. 聚

36、丙烯酰胺凝胶电泳 5.3 SDS-PAGE原理原理v在蛋白质溶解液中加入在蛋白质溶解液中加入SDS和疏基乙醇：和疏基乙醇：n巯基乙醇可使蛋白质分子中二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳n SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打开，还引起蛋白质构象的改变，并形成SDS-蛋白复合物。2022-5-11海南海南大学大学 农农学院学院565. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.4 连续密度梯度电泳（连续密度梯度电泳（PG-PAGE）v 原理：n连续密度梯度电泳使用的是从上至下呈线性梯度线性梯度的凝胶，点在凝胶顶部的样品在电场中向着凝胶浓度逐渐增高的方向即孔径逐渐缩小的方向迁移。随着电泳的继续进行

37、，蛋白质受到孔径的阻力越来越大。n电泳开始时，样品在凝胶中的迁移速度主要受到本身的电荷密度和样品分子的大小的影响。当迁移所受到的阻力大到阻以使样品分子完全停止前进时，那些跑得很慢的低电荷的样品分子将赶上与它大小相同但具有较高电荷密度的分子并停留下来形成区带。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳v 因此在梯度凝胶电泳中，样品的最终迁移位置仅取决于分样品的最终迁移位置仅取决于分子本身的大小，而与样品分子的电荷密度无关子本身的大小，而与样品分子的电荷密度无关。样品混合物中分子质量大小不同的组分，电泳之后将依分子质量大小停留在不同的凝胶孔径层次中形成相应的区带。 5.4. 连续密度梯度电泳（PG-PAGE）v线性

38、梯度凝胶制备线性梯度凝胶制备n配制低浓度胶配制低浓度胶(2% 或或4%)、高浓度胶、高浓度胶(16% 或或30%)贮贮液液(两者体积比为两者体积比为1:1) ，置梯度混合瓶中，在梯度混，置梯度混合瓶中，在梯度混合器及蠕动泵的协助下，从下至上灌胶。凝胶聚合合器及蠕动泵的协助下，从下至上灌胶。凝胶聚合后，则形成由下到上、从浓至稀依次排列的线性梯后，则形成由下到上、从浓至稀依次排列的线性梯度凝胶。度凝胶。 5.4. 连续密度梯度电泳（PG-PAGE）5.5. 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳（聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳（ IEF-PAGE ）v 原理：原理：n蛋白质是两性电解质，当蛋白质是两性电解质，当p

39、HpHpIpI时带负电荷，在电场中时带负电荷，在电场中向正极移动；当向正极移动；当pHpHpIpI时带正电荷，在电场中向负极移时带正电荷，在电场中向负极移动；当动；当pH=pIpH=pI时净电荷为零，在电场中不向电极移动。时净电荷为零，在电场中不向电极移动。n聚丙烯酰胺凝胶中加入一种两性电解质载体，在电场的聚丙烯酰胺凝胶中加入一种两性电解质载体，在电场的作用下会自发形成一个连续作用下会自发形成一个连续pHpH梯度。梯度。n蛋白质在这种凝胶载体中运动到与其蛋白质在这种凝胶载体中运动到与其pIpI相同的相同的pHpH胶层时胶层时就失去所带电荷而稳定停留在该处，聚焦成带。就失去所带电荷而稳定停留在该

40、处，聚焦成带。n在等电聚焦中，利用各蛋白质组分等电点的差异，并不在等电聚焦中，利用各蛋白质组分等电点的差异，并不利用凝胶的分子筛作用。利用凝胶的分子筛作用。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳2022-5-11海南海南大学大学 农农学院学院61v 蛋白质在这种蛋白质在这种 pH 梯度梯度胶中，无论处于何种位胶中，无论处于何种位置均会向其等电点置均会向其等电点 pH处移动，并最终停留在处移动，并最终停留在该处。该处。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳5.5 IEF-PAGEv 等电聚焦的优点：等电聚焦的优点：n分辨率高，可分开分辨率高，可分开 pI pI 相差相差0.010.010.02PH0.02PH单位的蛋白；单

41、位的蛋白；n一般电泳受扩散作用的影响，随着时间和距离加长，一般电泳受扩散作用的影响，随着时间和距离加长，区带越走越宽，而区带越走越宽，而IEFIEF能使区带变窄；能使区带变窄；n不管样品加在什么部位，都可聚焦到其等电点处，很不管样品加在什么部位，都可聚焦到其等电点处，很稀的样品也可进行分离；稀的样品也可进行分离；n可测定蛋白质的等电点，精确度可达可测定蛋白质的等电点，精确度可达0.01PH0.01PH单位。单位。v 缺点：缺点：n要求无盐溶液，而无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀；要求无盐溶液，而无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀；n不适用于在等电点时发生沉淀或变性的蛋白质。不适用于在等电点时发生沉淀或变

42、性的蛋白质。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳v原理：原理：n双向电泳是在第一向等电聚焦电泳后再在与第一双向电泳是在第一向等电聚焦电泳后再在与第一向垂直的方向上进行第二向电泳的分离方法。向垂直的方向上进行第二向电泳的分离方法。n经过两次电泳分离后，可以得到蛋白质分子的等经过两次电泳分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。电点和分子量信息。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳5.6 聚丙烯酰胺凝胶双向电泳聚丙烯酰胺凝胶双向电泳v电泳方法：电泳方法：n一般第一向IEF用超薄水平板，电泳结束后切取所需泳道用于第二向电泳，或在1mm内径的毛细管中进行第一向IEF，在制胶时要加入2%两性电解质和6mol/L尿素。n第

43、二向电泳，同一般的SDS-PAG。 双向电泳双向电泳2022-5-1165海南海南大学大学 农农学院学院2022-5-11海南海南大学大学 农农学院学院66pH3pH10IEFSDS 双向电泳示意图双向电泳示意图双向电泳双向电泳v 目前，已有目前，已有5000余种蛋白质采用余种蛋白质采用IEF/SDS-PAGE得到很得到很好的分离，其高分辨率是各种类型电泳所无法比拟的。好的分离，其高分辨率是各种类型电泳所无法比拟的。因此，因此，IEF/SDS-PAGE已成为当前分子生物学领域内常已成为当前分子生物学领域内常用的实验技术，是蛋白质组学的基本方法。用的实验技术，是蛋白质组学的基本方法。v 然而，此

44、技术对某些碱性蛋白质的分离却有其局限性，然而，此技术对某些碱性蛋白质的分离却有其局限性，因在第一向因在第一向IEF中，含有高浓度的尿素，它的存在会使中，含有高浓度的尿素，它的存在会使碱性区的碱性区的pH梯度变得很窄而且不稳定，可使碱性蛋白梯度变得很窄而且不稳定，可使碱性蛋白质难以进入凝胶中或者易泳出凝胶外。因此，对碱性蛋质难以进入凝胶中或者易泳出凝胶外。因此，对碱性蛋白质的分离分析应采用其他方法。白质的分离分析应采用其他方法。 双向电泳双向电泳2022-5-1167海南海南大学大学 农农学院学院6. 毛细管电泳毛细管电泳 毛细管电泳原理：毛细管电泳原理：l 毛细管电泳和一般电泳法的区别在于使用

45、毛细管柱。毛细管电泳和一般电泳法的区别在于使用毛细管柱。l 毛细管柱壁的材质是玻璃的，硅酸是主要成分，它可发生毛细管柱壁的材质是玻璃的，硅酸是主要成分，它可发生如下电离如下电离： H2SiO3=HSiO3-+H+ 。结果使管壁带有一定结果使管壁带有一定的负电荷。的负电荷。l 由于静电感应，管中缓由于静电感应，管中缓 冲液中的正离子和偶极冲液中的正离子和偶极 分子水的正极趋向管壁，分子水的正极趋向管壁， 从而形成一个从而形成一个双电层双电层。6. 毛细管电泳毛细管电泳v电渗流：电渗流：2022-5-1169海南海南大学大学 农农学院学院l 双电层中的正离子及双电层中的正离子及定向排列的水分子在电

46、定向排列的水分子在电场力和毛细张力的共同场力和毛细张力的共同作用下，向负极移动，作用下，向负极移动，形成形成电渗流电渗流，其方向与，其方向与电场方向一致。电场方向一致。 毛细管电泳原理：毛细管电泳原理：v 不同组分受到的作用力有差别：n正离子受到同方向电场力和电渗流的推动，前进速正离子受到同方向电场力和电渗流的推动，前进速率较快；率较快；n负离子受电渗流的作用大于电场力，所以负离子也负离子受电渗流的作用大于电场力，所以负离子也是向负极运动但运动速率最慢；是向负极运动但运动速率最慢；n不带电荷的组分不受电场力的作用，但强大的电渗不带电荷的组分不受电场力的作用，但强大的电渗流推动着它从正极向负极运

47、动。流推动着它从正极向负极运动。v 毛细管中的样品中各组分，不管是否带有电荷或带何种毛细管中的样品中各组分，不管是否带有电荷或带何种电荷，都会从正极向负极移动，电荷，都会从正极向负极移动，迁移速率正离子最大，迁移速率正离子最大，负离子最小，中性分子居中负离子最小，中性分子居中。经过一定时间的电泳，各。经过一定时间的电泳，各种组分会实现有效的分离。种组分会实现有效的分离。6. 毛细管电泳毛细管电泳 毛细管电泳原理：毛细管电泳原理：v 如果把单位电场强度下离子在一定的温度下在介质中如果把单位电场强度下离子在一定的温度下在介质中迁移的速率称作淌度的话，那么毛细血管电泳实质上迁移的速率称作淌度的话，那

48、么毛细血管电泳实质上是是以高压电场为驱动力以高压电场为驱动力，以毛细管为分离管道以毛细管为分离管道，依据，依据样品中以样品中以各种组分之间淌度和分配行为上的差别各种组分之间淌度和分配行为上的差别而实而实现分离的一类现分离的一类液相分离液相分离技术，兼有电泳和高效液相色技术，兼有电泳和高效液相色谱两类分离技术原理。谱两类分离技术原理。v 在普通电泳中起破坏作用的电渗流在毛细管电泳中却在普通电泳中起破坏作用的电渗流在毛细管电泳中却变成了有效的驱动力之一。变成了有效的驱动力之一。6. 毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳与毛细管电泳与高效液相色谱的区别：高效液相色谱的区别： 毛细管电泳用高压电源取代了高压

49、泵，改善了流动毛细管电泳用高压电源取代了高压泵，改善了流动相在毛细管中的流型，用塞式流型代替了分析柱中的相在毛细管中的流型，用塞式流型代替了分析柱中的抛物线流型，使得各组分峰宽变窄，提高了分辨率。抛物线流型，使得各组分峰宽变窄，提高了分辨率。v毛细管电泳仪系统：毛细管电泳仪系统：6. 毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳6. 毛细管电泳毛细管电泳2022-5-11海南海南大学大学 农农学院学院75电泳仪工作示意图电泳仪工作示意图6. 毛细管电泳毛细管电泳v 毛细管电泳仪系统：毛细管电泳仪系统：v 进样系统n压力进样和电动进样n进样体积一般在纳升级，须控制在毛细管总长的1%2%，否则将影响分

50、离效率v 分离系统n毛细管：由石英制成,内径2575m,外径350400m，有效长度为80100cm；n恒温系统：控制柱温变化在0.1； n高压电源：电流0300A电压030KV,电压稳定性在0.1%v 检测系统n常用的检测方式是紫外-可见光吸收。检测器位于距样品盘约毛细管总长的2/34/5处,对毛细管壁内部分进行光聚焦；n此外，荧光，质谱等检测方法也被应用于毛细管电泳;6. 毛细管电泳毛细管电泳2022-5-11海南海南大学大学 农农学院学院77高效毛细管电泳仪高效毛细管电泳仪(紫外检测紫外检测) 可用于对有机化合物、无机可用于对有机化合物、无机离子、中性分子、手性化合离子、中性分子、手性化

51、合物、蛋白质和多肽、物、蛋白质和多肽、DNADNA和和核酸片段的分析。核酸片段的分析。 高效毛细管电泳液相色谱一体机高效毛细管电泳液相色谱一体机 集成集成HPLCHPLC和和HPCEHPCE的所有功能，的所有功能，高分辨地分离各种离子或大分子，高分辨地分离各种离子或大分子，尤其在多肽、蛋白质、核酸等方面尤其在多肽、蛋白质、核酸等方面的分离显示出优越性能。的分离显示出优越性能。 6. 毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳 分类分类6. 毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳有多种分离模式，给样品分离提供了毛细管电泳有多种分离模式，给样品分离提供了不同的选择机会。不同的选择机会。v 毛细管电泳的优点：毛细管电泳的优点：n热效应低：电泳时使用电流很小，产热少，且散热快。n分辨率高：理论塔板数一般几万/m，高者可达千万/m。n速度快：最快可在 60s内完成。有报道在 250s内分离 10种蛋白。n样品用量少：进样量为 nL量级，且不破坏生物样品。n检测灵敏度高：激光诱导荧光检测器达 10-1310-15mol。n结构简单：自动化程度高，操作方便，成本低。只需少量（每天几毫升）流动相和价格低廉的毛细管。6. 毛细管电泳毛细管电泳第四节第四节 电泳检测技术电泳检测技术v经电泳分离的各种生物分子需用染色法使其在支经电泳分离的各种生物分子需用染色法使其在支持持 物相应位置上显示