第2章蛋白质(2)

1、蛋白质的结构蛋白质的结构The Molecular Structure of Protein 蛋白质是由许多蛋白质是由许多氨基酸氨基酸单位通过单位通过肽键（酰肽键（酰胺键）胺键）连接起来的，具有连接起来的，具有特定分子结构特定分子结构的的高分子化合物高分子化合物。蛋白质的分子结构包括（人为划分）蛋白质的分子结构包括（人为划分） 一级结构一级结构(primary structure)(primary structure)二级结构二级结构(secondary structure)(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)(tertiary s

2、tructure)四级结构四级结构(quaternary structure)(quaternary structure)蛋白质的空蛋白质的空间结构或间结构或蛋蛋白质的构象白质的构象构象构象是由于有机分子中是由于有机分子中单键单键的旋转所形成的，的旋转所形成的，构象变化并不改变其共价键的结构。蛋白质的构构象变化并不改变其共价键的结构。蛋白质的构象通常由象通常由非共价键（次级键）非共价键（次级键）来维系。来维系。构型构型是指分子中连在手性碳原子或双键上的各是指分子中连在手性碳原子或双键上的各个基团在空间的不同排布，只有共价键的断裂才个基团在空间的不同排布，只有共价键的断裂才会发生构型变化。会发生

3、构型变化。定义：定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列排列顺序顺序。( (包括蛋白质分子中所有的二硫键的位置）包括蛋白质分子中所有的二硫键的位置）一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构主要的维系键：主要的维系键：肽键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。，有些蛋白质还包括二硫键。 一级结构是一级结构是蛋白质空间构象和蛋白质空间构象和特异生物学功能的特异生物学功能的基础。基础。但不是决定但不是决定蛋白质空间构象的蛋白质空间构象的唯一因素唯一因素A链链B链链 氨基酸序列的多样性氨基酸序列的多样性 如：如：20种氨基酸形成的二十肽（每种氨基酸只种氨基酸形成的二十肽（

4、每种氨基酸只用用1次）可以形成的异构体为：次）可以形成的异构体为： 20！=2 1018 又如：又如：283个氨基酸残基组成的蛋白质，含个氨基酸残基组成的蛋白质，含12种种氨基酸，假定在肽链的任一位置，氨基酸，假定在肽链的任一位置， 12种氨基酸出种氨基酸出现的概率相等，则异构体数目为现的概率相等，则异构体数目为: 12283 = 10305蛋白质一级结构的测定测定多肽链的数目测定多肽链的数目蛋白质测序的步骤拆分多肽链拆分多肽链断开多肽链内的二硫键断开多肽链内的二硫键测定每一肽链的氨基酸组成测定每一肽链的氨基酸组成鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-末端和末端和C-末端末端裂解多肽链为较小的肽段裂解多

5、肽链为较小的肽段测定各肽段的氨基酸序列测定各肽段的氨基酸序列利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构确定二硫键的位置确定二硫键的位置1 1 、蛋白质样品的纯化、蛋白质样品的纯化(97%)(97%)2 2、蛋白质分子中多肽链数目测定、蛋白质分子中多肽链数目测定3 3、拆分蛋白质分子的多肽链、拆分蛋白质分子的多肽链4 4、 二硫键的断裂二硫键的断裂蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定二硫桥的断裂 巯基化合物还原法过甲酸氧化法过甲酸2-巯基乙醇碘乙酸溴丙胺 5 5 氨基酸组成的分析氨基酸组成的分析 一般用酸水解，得到氨基酸混合物，一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离

6、测定各种氨基酸残基的数目。目前再分离测定各种氨基酸残基的数目。目前用氨基酸自动分析仪，用氨基酸自动分析仪，2 24 4小时即可完成。小时即可完成。 6. 6.鉴定鉴定N-N-末端和末端和C-C-末端残基末端残基N-N-末端残基的测定末端残基的测定( (1) 1)与与2 2，4- 4-二硝基氟苯的反应二硝基氟苯的反应 (Sanger(Sanger反应）反应） 在在弱碱弱碱性溶液中，氨基酸的性溶液中，氨基酸的- - 氨基很容易与氨基很容易与2 2，4- 4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）作用，生成稳定的作用，生成稳定的黄黄色色2 2，4- 4-二硝基苯基氨基酸（简写为二硝基苯基氨基酸（

7、简写为DNP-DNP-氨基酸）。氨基酸）。 DNFB+NCCR3ONCCR1ONCCR2OHHHHHH2NCCR5ONCCR4OHHHHO2NO2NFO2NO2NFNCCR3ONCCR1ONCCR2OHHHHHHNCCR5ONCCR4OHHHHHClO2NO2NNCR1HHCOOH+other amino acidsDNP-amino acid Sanger法法 DNFB （二硝基氟苯）反应二硝基氟苯）反应黄色:根据它在薄层层析或纸电泳中的迁移特性进行鉴定 丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的简称+HCI 这个反应首先被Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。 在弱碱性条件下，氨基酸中的-氨基

8、还可以与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，产生相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）。在无水酸中，PTC-氨基酸即环化为苯硫乙内酰脲（PTH），后者在酸中极稳定，此法最大优点是水解除去末端标记的氨基酸残基时不会破坏余下的多肽链。 +PITC弱碱中弱碱中(400 C)苯硫乙内酰脲苯硫乙内酰脲(PTH-AA)(PTH-AA)(无水氢氟酸中无水氢氟酸中)H+苯氨基硫甲酰氨基酸苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-PTC-氨基酸）氨基酸）（Edman反应）反应）（4 4）氨肽酶法）氨肽酶法 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的多肽链的N-N-端逐个水解肽链，释放氨基端逐个水解肽链

9、，释放氨基酸。酸。 NHNH2 2 -aa-aa-aa-aa. 据一定时间内释放出的据一定时间内释放出的AAAA的数量和种的数量和种类来推测。类来推测。C-末端的测定末端的测定 羧肽酶法羧肽酶法 将蛋白质在将蛋白质在pH 8.0, 30pH 8.0, 30与羧肽酶一起与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道时间的关系，就可以知道C C末端氨基酸的末端氨基酸的排列顺序。排列顺序。目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；A

10、 A和和B B来自胰来自胰脏；脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母。来自面包酵母。u羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端末端氨基酸残基；氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末端残基的肽末端残基的肽键。通常将二者混合使用键。通常将二者混合使用水解除水解除ProPro以外的任意以外的任意C-C-末末端残基。端残基。u羧肽酶羧肽酶C C和和Y Y可作用于任何氨基酸，因而，除用来可作用于任何氨基酸，因而，除用来测定测定C C末端氨基酸外，还可以用来测定氨基酸的排末端氨基酸外，

11、还可以用来测定氨基酸的排列顺序。列顺序。C-C-末端的测定末端的测定 （1 1）还原法还原法。C C末端氨基酸可用末端氨基酸可用硼氢化锂硼氢化锂还原生成相应的还原生成相应的 氨基醇氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。肽链水解后，再用层析法鉴定。 （2 2）肼解法肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除的肽键，除C C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与化合物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端端氨基酸分离，氨基酸分离，C C

12、末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变成末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。 H2NCHCROHNCHCROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸7 7 多肽链的部多肽链的部分裂解和肽段分裂解和肽段混合物的分离混合物的分离纯化纯化可以用酶水解可以用酶水解法或化学水解法或化学水解法将蛋白质水法将蛋白质水解成肽段解成肽段肽段的分离纯肽段的分离纯化可用层析法化可用层析法或电泳法或电泳法胰蛋白酶溴化氰断裂法羟胺

13、断裂法：断裂羟胺断裂法：断裂Asn-GlyAsn-Gly之间的肽键，但专一性不强，也可之间的肽键，但专一性不强，也可以断裂以断裂Asn-LeuAsn-Leu和和Asn-AlaAsn-Ala之间的键之间的键. .8 8肽段氨基酸序肽段氨基酸序列的测定列的测定 A.Edman化学降解法化学降解法: 用此原理已制成蛋白质序用此原理已制成蛋白质序列分析仪。列分析仪。 B.质谱法质谱法：可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池被裂中经电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的解成

14、离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用谱线，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。C.根据核苷酸序列推定法根据核苷酸序列推定法：分离：分离mRNA，经反转，经反转录测定录测定cDNA的核苷酸序列的核苷酸序列, 再用遗传密码推定氨再用遗传密码推定氨基酸序列。基酸序列。9 肽段拼接肽段拼接10 10 二硫桥位置的确定二硫桥位置的确定用对角线电泳法过甲酸蛋白质测序蛋白质测序举例（胰岛举例（胰岛素的序列测素的序列测定）定）蛋白质序列数据库蛋白质序列数据库 1.欧洲生物信息中心研

15、究所和瑞士生物信息研欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的究所共同管理的SWISS-PROT有有10多万条肽链的多万条肽链的信息；信息； 2.美国国家生物医学基金会主持的美国国家生物医学基金会主持的PIR有近有近30万条万条肽链的信息，但多数由核酸信息翻译而来，有些肽链的信息，但多数由核酸信息翻译而来，有些未经严格检验。未经严格检验。 3.美国政府支持的美国政府支持的Gen Bank、欧洲的、欧洲的 EMBL和日和日本管理的本管理的DDBJ, 有大量的基因序列信息，从其阅有大量的基因序列信息，从其阅读框可以得到蛋白质序列的不少信息。读框可以得到蛋白质序列的不少信息。二、蛋白质的空

16、间结构二、蛋白质的空间结构蛋白质的空间结构也称蛋白质的高级蛋白质的空间结构也称蛋白质的高级结构或构象，是指蛋白质分子中结构或构象，是指蛋白质分子中所有原子所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。在三维空间的排列分布和肽链的走向。定义定义 维系键维系键：盐键、氢键、疏水键和范德华力等盐键、氢键、疏水键和范德华力等研究蛋白质构象的方法：研究蛋白质构象的方法： X X射线衍射法射线衍射法X X射线衍射法射线衍射法 由于由于C=OC=O双键中的双键中的电子云电子云与与N N原子上的未共用电子对原子上的未共用电子对发生发生“电子共振电子共振”，使肽键具有，使肽键具有部分双键部分双键的性质，的性质，不能

17、自由旋转不能自由旋转。肽键平面肽键平面由于肽键具有部分双键的性质，使由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。这一平面称为肽键平面或肽单元。（一）肽平面（酰胺平面）（一）肽平面（酰胺平面）多肽链构象的空间限制多肽链构象的空间限制l由于由于-碳原子与其他原子碳原子与其他原子之间均形成之间均形成单键单键，因此，因此两相邻两相邻的肽键平面的肽键平面能以共同的能以共同的C为为顶点顶点作相对旋转。作相对旋转。l绕绕CN键键旋转的角度称旋转的角度称角，绕角，绕CC键键旋转的角度称旋转的角度称角。角。和和称

18、称二面角二面角。（二）二面角（二）二面角规定规定: :包含同一包含同一C的两个肽单位处于同一平面时的的两个肽单位处于同一平面时的和和为为0,从从C沿键轴方向观察，顺时针旋转的角度为正值，反时针旋转的角沿键轴方向观察，顺时针旋转的角度为正值，反时针旋转的角度为负值。度为负值。u-碳原子的二面角碳原子的二面角( /)( /)决定了相邻肽单位的相决定了相邻肽单位的相对位置，许多对位置，许多-碳原子成对的二面角决定了多肽链主碳原子成对的二面角决定了多肽链主链骨架的构象。链骨架的构象。u二面角可以用来描述多肽链所有可能的构象二面角可以用来描述多肽链所有可能的构象, ,但二面但二面角角( /)( /)所规

19、定的两个相邻肽单位间的构象会受到主所规定的两个相邻肽单位间的构象会受到主链原子空间位阻的限制。链原子空间位阻的限制。可允许的和值：拉氏构象图 由印度学者Ramachandran制作（一）（一）蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链结构，即该段肽链主链骨架原子主链骨架原子的相对空的相对空间位置，间位置，并不涉及氨基酸残基侧链并不涉及氨基酸残基侧链的构象的构象 。定义定义 主要的维系键主要的维系键： 氢键氢键 蛋白质二级结构的主要形式蛋白质二级结构的主要形式 -螺旋螺旋 ( -helix ) -折叠折叠 ( -pleated

20、 sheet ) -转角转角 ( -turn ) -凸起凸起( -bugle ) 无规卷曲无规卷曲 ( random coil ) - -螺旋是螺旋是多肽链中的多肽链中的各个肽平面各个肽平面围绕同一轴围绕同一轴旋转所形成旋转所形成的螺旋结构的螺旋结构 结构特征：结构特征： 大多为大多为右手螺旋右手螺旋，侧，侧链伸向螺旋链伸向螺旋外侧外侧 螺旋每圈包含螺旋每圈包含3.63.6个氨个氨基酸残基基酸残基, ,螺距螺距 0.54nm0.54nm，两两个氨基酸之间的距离个氨基酸之间的距离0.15nm0.15nm 螺旋以螺旋以氢键氢键维系（氨维系（氨基酸的基酸的N-HN-H和相邻第四个氨和相邻第四个氨基酸

21、的羰基氧基酸的羰基氧C=OC=O之间。氢之间。氢键方向与螺旋轴基本平行）键方向与螺旋轴基本平行） 氢键稳定螺旋结构氢键稳定螺旋结构螺旋的肽平面螺旋的肽平面空间填充空间填充模型结构模型结构带状结构带状结构3.613螺旋螺旋其他类型的螺旋4.416螺旋螺旋影响影响 螺旋形成的因素：螺旋形成的因素： R R基太小使键角自由度过大，带同种电荷的基太小使键角自由度过大，带同种电荷的R R基基相互靠近，相互靠近， 碳原子上有分支均碳原子上有分支均不利于形成不利于形成 螺旋，螺旋，含脯氨酸的肽段不能形成含脯氨酸的肽段不能形成 螺旋。螺旋。2. 2. - -折叠折叠 - -折叠折叠是由若干肽是由若干肽段或肽链

22、排段或肽链排列起来所形列起来所形成的扇面状成的扇面状片层构象片层构象结构特征：结构特征： 由若干条肽段或肽链平行或反平由若干条肽段或肽链平行或反平 行排列组成行排列组成片状结构片状结构； 主链骨架伸展呈主链骨架伸展呈锯齿状锯齿状； 借相邻主链之间的借相邻主链之间的氢键氢键维系。维系。-折叠包括折叠包括平行式平行式和和反平行式反平行式两种类型两种类型平行式平行式：所有肽：所有肽链的链的N-N-端都在端都在同一边。同一边。反平行式反平行式，相邻，相邻两条肽链的方向两条肽链的方向相反。反平行式相反。反平行式较稳定。较稳定。3. -转角转角 是多肽链是多肽链180180回折部分回折部分所形成所形成的一

23、种二级结构的一种二级结构 - -转角由四个氨基酸残基组成，弯曲处的第一个转角由四个氨基酸残基组成，弯曲处的第一个氨基酸残基的氨基酸残基的 -C=O -C=O 和第四个残基的和第四个残基的 N-H N-H 之之间形成氢键，形成一个较稳定的环状结构。间形成氢键，形成一个较稳定的环状结构。4. 4. -凸起凸起无一定的规则，但对一定的球蛋白而言无一定的规则，但对一定的球蛋白而言, ,特定的区特定的区域有特定的卷曲方式。域有特定的卷曲方式。5.5.无规卷曲无规卷曲大多为反平行大多为反平行 折折叠的一种不规则叠的一种不规则情况，即其中一情况，即其中一条条 折叠链中额外折叠链中额外插入一个残基，插入一个残

24、基，形成形成1 1个凸起。个凸起。（二）超二级结构和结构域（二）超二级结构和结构域1 1、超二级结构、超二级结构若干相邻的二级结若干相邻的二级结构中的构象单元彼构中的构象单元彼此相互作用，形成此相互作用，形成有规则的，在空间有规则的，在空间上能辨认的二级结上能辨认的二级结构组合体。构组合体。多肽链在超二级结构基础多肽链在超二级结构基础上进一步盘绕折叠成的近似球上进一步盘绕折叠成的近似球状的紧密结构，称为状的紧密结构，称为结构域结构域(domain) (domain) 。2 2、结构域、结构域（三）蛋白质的三级结构（三）蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和范德华力等。疏水键、离子键、氢键和范德

25、华力等。 主要的维系键：主要的维系键：整条肽链中整条肽链中全部氨基酸残基全部氨基酸残基的相对空间位置。的相对空间位置。即肽链中即肽链中所有原子在三维空间的排布位置所有原子在三维空间的排布位置。定义定义 三级结构是蛋白质结构的基础三级结构是蛋白质结构的基础对于对于单一多肽链的蛋白质，单一多肽链的蛋白质，三级结构是三级结构是它的它的最高级结构，最高级结构，只有具有完整的三级只有具有完整的三级结构，才具有全部的结构，才具有全部的生物学功能生物学功能 肌红蛋白肌红蛋白 (Mb) N 端端 C端端 为单肽蛋白质，为单肽蛋白质，含有含有153个氨基酸，个氨基酸，有有8个螺旋区个螺旋区球状蛋白质三维结构的特征球状