产甲烷菌菌落特性及分子生物学研究

1、产甲烷菌菌落特性及分子生物学研究第一页，共26页。厌氧发酵微生物概述产甲烷菌分类及代谢途径产甲烷菌富集与纯化微生物群落研究方法分子多样性研究内内 容容第二页，共26页。厌氧发酵微生物概述厌氧发酵微生物概述不产不产甲烷菌甲烷菌产甲烷产甲烷菌菌纤维素降解细菌半纤维素降解细菌淀粉降解细菌脂肪降解细菌产琥珀酸丝状菌溶纤维丁酸弧菌白色瘤胃球菌牛链球菌溶脂厌氧弧菌产氢产乙酸菌同型产乙酸菌挥发酸生成菌群挥发酸生成菌群基质分解菌群基质分解菌群沃尔夫互营单细胞菌中温丙酸氧化菌伍德乙酸杆菌乙酸梭菌嗜热自养梭菌嗜甲基丁酸杆菌提供生长和产甲烷所需要的基质创造适宜的氧化还原电位条件为产甲烷菌清除有害物质第三页，共26页

2、。厌氧发酵微生物的发展史厌氧发酵微生物的发展史1901-1903年巴斯德研究所的Maze马氏甲烷球菌.1936 H A Barker发现沼气发酵分为产酸和分解酸形成甲烷两个阶段1950 美国R. E .Hungate发明厌氧培养技术1868 Bechamp甲烷形成是微生物学过程1899 俄国 奥姆良将厌氧分解纤维的微生物分为两类1916奥氏甲烷杆菌1901荷兰 Sohngen氢和二氧化碳的混合气能发酵成甲烷1967 Bryant采用改进Hungate技术纯化产甲烷菌1972 三阶段理论1974 Bryant首次提出了产甲烷菌(Methanogen)一词更先进的技术更完善的体系第四页，共26页。

3、产甲烷菌的生物学特性产甲烷菌的生物学特性专性厌氧专性厌氧生长繁殖困难生长繁殖困难-320mV下正常生长 -160mV 下生长缓慢 遇氧停止生长甚至死亡十几天几十天才出现菌落菌落一般圆形、透明、边缘整齐菌落特别小，很容易遗漏。可利用的底物很少：可利用的底物很少：CO2、H2、乙酸、甲醇、乙酸、甲醇、甲基胺等甲基胺等第五页，共26页。产甲烷菌的生物学特性产甲烷菌的生物学特性特殊的细胞壁结构特殊的细胞壁结构独特的产甲烷菌辅酶独特的产甲烷菌辅酶甲烷吠喃(MFR)甲烷喋呤辅酶M(CoM)辅酶F430辅酶F420HS-HTP无肽聚糖骨架蛋白质亚基和大量杂多糖组成不受青霉素抑制细胞内无细胞色素C脂蛋白肽聚糖

4、脂多糖孔道蛋白第六页，共26页。产甲烷菌的分类产甲烷菌的分类根据可利用底物根据生长温度氢营养型：利用氢气和二氧化碳氢营养型：利用氢气和二氧化碳乙酸盐营养型：乙酸乙酸盐营养型：乙酸甲基营养型：甲醇、三甲基胺、二甲肽硫化合物以及其他的一些甲基营养型：甲醇、三甲基胺、二甲肽硫化合物以及其他的一些醇如异丙醇、异丁醇、乙醇、环戊醇醇如异丙醇、异丁醇、乙醇、环戊醇嗜冷产甲烷菌：嗜冷产甲烷菌：T Toptopt 25 8080第七页，共26页。产甲烷菌甲烷生产途径产甲烷菌甲烷生产途径H H2 2/CO/CO2 2途径途径乙酸途径乙酸途径甲基途径甲基途径CO2 + H2 CH4 + 2H2O G0= -131

5、 kJ 4CH3OH 3CH4 + CO2 + 2H2O G0= -319 kJ CH3COO- + H2O CH4 + HCO3- G0= -31 kJ CO2 + H2 CH4 + 2H2O G0= -131 kJ 4CH3OH 3CH4 + CO2 + 2H2O G0= -319 kJ CH3COO- + H2O CH4 + HCO3- G0= -31 kJ 第八页，共26页。产甲烷菌的分类产甲烷菌的分类颗粒污泥外观特征颗粒污泥外观特征颗粒污泥表面的菌群颗粒污泥表面的菌群马氏甲烷球菌马氏甲烷球菌巴氏甲烷八叠球菌巴氏甲烷八叠球菌甲酸甲烷杆菌甲酸甲烷杆菌第九页，共26页。产甲烷菌的分类产甲烷

6、菌的分类第十页，共26页。产甲烷菌显著影响因子产甲烷菌显著影响因子微量元素缺乏会导致VFA高，气体产率下降。对毒性物质具有拮抗作用使反应器内优势菌种发生变化使乙酸利用率提高数倍。微量元素硫酸盐还原细菌和产甲烷细菌存在竞争关系，二者都以氢、乙酸、乳酸等为电子供体。硫化氢致害浓度为50 mgL-1，驯化后的500 mgL-1。硫酸盐最适pH值6.8 7.4pH值的变化可引起微生物体表面的电荷变化，影响培养基中有机化合物的离子化作用酶只有在最适宜的pH 值时才能发挥最大活性。产甲烷菌最适宜的Eh为-350 mV 或更低，过高则停止生长甚至死亡。中温Eh 应低于-300-380 mV高温厌氧消化系统-

7、500-600 mVpH值氧化还原电位(Eh)第十一页，共26页。产甲烷菌富集与纯化方法产甲烷菌富集与纯化方法样品采集样品采集繁殖培养繁殖培养纯化分离纯化分离纯度检验纯度检验水沉积物、沼泽、苔原、稻田、瘤胃、盲肠、地热温泉等碳源、氮源、维生素、微量元素、还原剂、指示剂培养基配好后先煮沸数分钟厌氧操作箱中进行接种操作，充入体积比4:1的H2/CO2培养10天后，重复上述过程四次。滚管分离 涂片染色检验 滚管观察在荧光显微镜下观察看其是否有蓝绿色荧光在荧光显微镜下标记产甲烷菌菌落，在厌氧操作箱中挑取菌落。菌种保存菌种保存 进行沼气发酵试验看其是否产生沼气4:1的H2/CO2 ，放置在4保存用悬浮液

8、冷冻保存法保藏产甲烷菌第十二页，共26页。微生物群落研究方法进展微生物群落研究方法进展原位杂交原位杂交菌落杂交菌落杂交Southern Southern 印迹杂交印迹杂交斑点印迹杂交斑点印迹杂交狭线印迹杂交狭线印迹杂交荧光原位杂交荧光原位杂交核酸探针杂交技术 复性复性RNADNA利用能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段作探针；探针可以是长探针(100 1000 bp)，也可以是短的寡核苷酸(10 50 bp)。根据所用的探针和靶核酸的不同，杂交可分为DNA-DNA 杂交，DNA-RNA (核糖核酸)杂交，RNA RNA杂交3类第十三页，共26页。微生物群落研究方法进展微生物群落研究

9、方法进展核酸探针杂交技术 荧光原位杂交荧光原位杂交p能快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊的核酸序列p定性、定量分析微生物的存在、分布、丰度和适应性等荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)是目前单个细胞水平上分析微生物群落结构的常用分子生态学方法。用荧光标记探针，原位鉴定单个细胞, 可原位分析它们的空间及数量分布。第十四页，共26页。微生物群落研究方法进展微生物群落研究方法进展PCR-DEEG变性梯度凝胶(DGGE)和温度梯度凝胶(TGGE)：在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺(DGGE) ，从正极到负极梯度递加，或是形成温度梯度(TGGE )。电

10、泳中的DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到分离效果。而且染色后的凝胶用成像系统分析。 PCR-DEEG可以半定量地测定样品DNA浓度的大小，反映微生物群落组成的变化。第十五页，共26页。微生物群落研究方法进展微生物群落研究方法进展PCR-DEEG16S rRNA的基因是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大(约占细菌RNA含量的80)，分子大小适中，存在于所有的生物中 ，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故而被普遍用来菌种分析与鉴定过程中。第十六页，共26页。微生物群落研究方法进展微生物群落研究

11、方法进展RFLP分析7.6kb13kb物种物种II物种物种IHap7.6kb13kbSouthernSouthern印迹杂交印迹杂交 I 杂合子杂合子 II分子探针分子探针DNA剪辑序列基因点突变、易位、倒位、缺失和转座等产生的改变会导致限制性内切酶(RE)的识别位点发生变化，进而使得部分具有同源序列的限制性片段大小发生变化，并在凝胶电泳中表现为不同的电泳迁移率。对每个DNA、RE组合来说，所产生的片段是特异的。第十七页，共26页。微生物群落研究方法进展微生物群落研究方法进展RFLP分析设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物；

12、应用特定的核酸内切限制酶切割有关的DNA 分子，经过电泳，原位转膜印迹，探针杂交，放射性自显影后，分析与探针互补的DNA 片段在长度上的简单变化。它可以在群落水平上提供几乎无穷尽的、反映基因型多样性的可靠证据，可作为一种能高度灵敏检测污染环境下微生物种群变化的方法。由于由于16S rDNA的限制性片段长度多态性的限制性片段长度多态性(RFLP)分析分析(ARDRA)所产生的片段多，分析起来工作所产生的片段多，分析起来工作量大。人们又在此基础上发展了一种高效、灵敏的方法末端标记限制性片段长度多态性分析量大。人们又在此基础上发展了一种高效、灵敏的方法末端标记限制性片段长度多态性分析(T-RFLPs

13、 )。该方法在用通用引物。该方法在用通用引物PCR扩增扩增16SrDNA时，在其中一条引物的时，在其中一条引物的5末端用荧光素进行标末端用荧光素进行标记，对标记了的末端片段进行多态性分析。这种方法有效而快速。记，对标记了的末端片段进行多态性分析。这种方法有效而快速。第十八页，共26页。RAPD分析QR3355上游引上游引物物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物PCR-SSCP实时荧光定量PCR利用随机引物对目的基因组DNA进行PCR扩增，产物经电泳分离后显色，分析扩增产物DNA片段的多态性，此即反应了基因组相应片段由于碱基发生缺失、插入、突变、重排等所引发的DNA多态性。DNA 的突变造成

14、DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。微生物群落研究方法进展微生物群落研究方法进展第十九页，共26页。菌株的系统分类学分析方法菌株的系统分类学分析方法产甲烷菌16S rDNA序列分析：由于16S rDNA序列的保守性及物种之间的差别性，产甲烷菌目前系统分类的主要依据为16S rDNA序列的分析。16S rDNA序列的分析分为以下几个过程：DNA的制备的制备16S rDNA序列的扩增序列的扩增扩增片段扩增片段的纯化的纯化制备感受态大肠杆菌制备感受态大肠杆菌扩增片段扩增片段的转化的转化质粒质粒DNA

15、的提取的提取测序及结果分析测序及结果分析第二十页，共26页。产甲烷菌的基因组特征产甲烷菌的基因组特征产甲烷菌基因组大小一般介于1.61065.7106 bp之间甲烷杆菌目、甲烷球菌目和甲烷火菌目的基因组均为1.7106 bp左右。甲烷八叠球菌目的基因组大小有较大差异，长度在3.4106 bp、5.7106 bp，也有的基因组大小仅为2.2106 bp。甲烷微菌目和甲烷胞菌目的基因组大小在2.81063.5106 bp之间。产甲烷菌的基因组一般由一条环状染色体组成,也有一些产甲烷菌除了含一条染色体之外，还存在环状染色体外元件ECE，而且染色体和ECE 的GC 含量有较大差别产甲烷菌基因组的GC

16、含量在30%65%之间，这与产甲烷菌所生存的环境有密切的关系，产甲烷菌生长所处的环境温度越高，一般GC 含量也越高。值得注意的是，甲烷球菌目的菌株GC 含量均较低，基本介于30%35%第二十一页，共26页。产甲烷菌的基因组特征产甲烷菌的基因组特征目Order科Family种Genus基因组(bp)Genome (bp)G+C (%)基因Gene阅读框ORF登录号Number甲烷杆菌目Methanobacteriales甲烷杆菌科Methanobacteriaceae热自养甲烷热杆菌Methanothermobacter thermautotrophicus str. Delta H1 751

17、37749.51 9211 873NC_000916马堡甲烷热杆菌Methanothermobacter marburgensis str. Marburg1 639 13548.61 8061 757NC_014408甲烷球菌目Methanococcales甲烷球菌科Methanococcaceae詹氏甲烷球菌Methanococcus jannaschii DSM26611 739 93331.31 8231 771NC_000909海沼甲烷球菌Methanococcus maripaludis C51 780 761331 8891 822NC_009135海沼甲烷球菌Methanoco

18、ccus maripaludis C61 744 19333.41 8881 826NC_009975海沼甲烷球菌Methanococcus maripaludis C71 772 69433.31 8551 788NC_009637海沼甲烷球菌Methanococcus maripaludis S21 661 13733.11 7721 722NC_005791海沼甲烷球菌Methanococcus maripaludis X11 746 69732.91 8901 848NC_015847甲烷火菌目Methanopyrales甲烷火菌科Methanopyraceae坎氏甲烷火菌Methan

19、opyrus kandleri AV191 694 96961.21 7291 687NC_003551甲烷八叠球菌目Methanosarcinales甲烷八叠球菌科Methanosarcinaceae噬乙酸甲烷八叠球菌Methanosarcina acetivorans C2A5 751 49242.74 7214 540NC_003552马泽氏甲烷八叠球菌Methanosarcina mazei Go14 096 34541.53 4343 368NC_003901马泽氏甲烷八叠球菌Methanosarcina mazei Tuc013 427 94942.53 4443 252NC_02

20、0389调查甲烷盐菌Methanohalobium evestigatum Z-73032 242 31736.42 4372 254NC_014253甲烷鬃毛状菌科Methanosaetaceae理事会甲烷鬃毛状菌Methanosaeta concilii GP63 026 645512 9272 850NC_015416甲烷微菌目Methanomicrobiales甲烷微菌科Methanomicrobiaceae居泥甲烷盘菌Methanoplanus limicola DSM 22793 200 94642.23 1292 942NZ_CM001436甲烷规则菌科Methanoregula

21、ceae甲酸甲烷规则菌Methanoregula formicicum SMSP2 828 85855.22 9242 816NC_019943甲烷螺菌科Methanospirillaceae亨氏甲烷螺菌Methanospirillum hungatei JF-13 544 73845.13 2943 131NC_00779617甲烷胞菌目Methanocellales甲烷胞菌科Methanocellaceae稻田甲烷胞菌Methanocella arvoryzae MRE503 179 91654.63 1703 089NC_009464第二十二页，共26页。产甲烷菌的基因组特征产甲烷菌的基

22、因组特征图 3 基于多基因组序列比对生成的产甲烷菌进化树 第二十三页，共26页。产甲烷菌群落结构的演替产甲烷菌群落结构的演替克隆编号系统类群在文库中包含的克隆数占文库总克隆的比例(%)Y1-2Methanomicrobium mobile1211.01Y1-4Methanocorpusculum bavaricum1211.01Y1-25Mbr. Ruminantium2220.18Y2-9Methanospirillum hungatei1514.15Y4-9Uncultured rumen methanogen1412.84F3-5Methanosarcina barkeri2820.37

23、F3-99Methanocorpusculum bavaricum2119.44F3-112Methanobacterium bryantii65.56F4-17Methanococcus vannielii76.48S1-9Methanocorpusculum parvum2118.42S1-13Methanobacterium bryantii1210.53S3-3Methanosarcina barkeri2723.68T1-2Methanosarcina barkeri1514.15T2-3Methanocorpusculum bavaricum1514.15W2-7Methanosa

24、eta concilii2825.93W2-13Methanobacterium bryantii2926.85W3-15Methanoculleus bourgensis2220.37W4-45Methanocorpusculum parvum2321.30沼气发酵过程中主要类群分布频率 第二十四页，共26页。1 彭喜曦, 张明青, 不产甲烷菌低温降解秸秆粪便试验研究 J. 环境科学与管理, 2012, 37(1): 57-60. 2 崔晓光, 沼气池中产甲烷菌的分离鉴定及其分布的研究 D. 大连理工大学, 2007. 3 B.K. Ince, O. Ince, G.K. Anderson,

25、 et al., Assessment of biogas use as an energy source from anaerobic digestion of brewery wastewater J. Water Air Soil Pollut., 2001, 126(3-4): 239-251. 4 李美群, 邓洁红, 熊兴耀, 等, 产甲烷菌的研究进展 J. 酿酒科技, 2009, (5): 90-93. 5 吕映辉, 提高产甲烷菌活性的应用研究 D. 山东轻工业学院, 2007. 6 R.E. Hungate, THE ANAEROBIC MESOPHILIC CELLULOLYT

26、IC BACTERIA J. Bacteriological Reviews, 1950, 14(1): 1-49. 7 T.C. Stadtman, H.A. Barker, studies on the methane fermentation X: A new formate decomposing bacterium, methanococcus vannielii J. J. Bacteriol., 1951, 62(3): 269-280. 8 P.H. Smith, R.E. Hungate, ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF METHANOBACTERIUM-RUMINANTIUM N-SP J. J. Bacteriol., 1958, 75