第十四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术

1、第十四章免疫细胞的分离及表面标志检测技术第十五章免疫细胞功能检测技术SeparationandAssaysforImmunocyte第一部分目的要求和教学内容一、目的要求掌握：Ficollhypaque分层液分离PBMC勺原理、方法，淋巴细胞亚群分离的原理、方法及应用，T细胞增殖试验的方法，B细胞的数量及功能的检测，NK细胞的活性、中性粒细胞、巨噬细胞功能的检测方法；熟悉：T细胞功能的体内试验、T细胞介导的细胞毒检测的方法；了解：淋巴细胞的纯化与亚群分离的方法、吞噬细胞的分离方法、溶血空斑试验。二、教学内容1 免疫细胞的分离与纯化：细胞的分离，外周血单个核细胞的分离，淋巴细胞的纯化与亚群分离，

2、吞噬细胞的分离。2 淋巴细胞的数量检测：T细胞数量检测，B细胞数量检测。3 淋巴细胞的功能检测：T细胞功能检测，B细胞功能检测，NK细胞活性测定。4 吞噬细胞功能检测：中性粒细胞功能检测，巨噬细胞功能检测。第二部分测试题一、选择题（一）单项选择题（A型题）1 外周血中的单个核细胞主要是指A. 淋巴细胞B. 嗜酸粒细胞C. 单核细胞一淋巴细胞D. 单核细胞E. 中性粒细胞2 .分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为A. 1.030B. 1.035C. 1.092D. 1.020E. 1.0773 .用FicolIhypaque分层液分离PBMC分离的PBMd位于试管的A. 血浆层之上B. 血浆层

3、之中C. 血浆层与分层液之间D. 分层液之中E. 试管底部4. 用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex-G10柱分离细胞时，从柱上洗脱下的细胞主要是A.粒细胞B. 淋巴细胞C. 单核细胞D. T细胞E. B细胞5. 能与SRB（占合形成E花环的细胞主要是A. T细胞B. B细胞C. 单核细胞D. 粒细胞E. 血小板6用小鼠抗人CD3单克隆抗体检测T细胞，其结果代表的是A. T细胞总数B. Th胞数C. Ts细胞数D. cd4细胞数E. cd8胞数7. 用尼龙棉柱分离细胞时，不易黏附尼龙棉纤维而被洗脱的细胞是A. 粒细胞B. B细胞C. 单核细胞D. T细胞E. 血小板8. 表示淋巴细胞的活力常

4、用A. 活淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比B. 活细胞浓度C. 淋巴细胞浓度D. 活细胞和总细胞的比值E. T细胞和B细胞的比例9. 用腹腔渗出法可从动物的腹腔渗出液中分离出A. 血小板B. B细胞C. 单核细胞D. T细胞E. 巨噬细胞10. 活细胞经台盼蓝染色后呈A. 蓝色B. 棕色C. 红色D. 不着色E. 天青色11. 荧光标记法计数外周血B淋巴细胞，检测的特有的表面标志是A. CDl9B. CD20C. 补体受体DSmIgEFcR12. NKffl胞特有的表面抗原是ACD2B. CDl6C. 无特异的表面抗原D. CD23E. CD5613仅能使T细胞发生淋巴母细胞转化的因子是A. PH

5、AB. PWMC. .LPSD. ConAE. EBV14. 能使B细胞和T细胞发生淋巴母细胞转化的因子是A. PHAB. PWMC. .LPSD. SPAE. EBV15. 检查体液免疫功能最常用的方法是A. 血清免疫球蛋白定量测定B. 溶血空斑试验C. B淋巴细胞计数D. 淋巴母细胞转化试验E.SmlgG测定16溶血空斑试验用于检测下列何种细胞的功能A. T细胞B. B细胞C. 中性粒细胞D. 吞噬细胞E. N陸田胞17. 测定T淋巴细胞功能的体内试验是A. 锡克试验B. 狄克试验C. 结核菌素试验D. 天然血型抗体滴度E. 血清：IgG测定18. 正常人外周血T淋巴细胞转化率为A<

6、40B. 40%50%C. 60%80%D80%E>90%19常用检测细胞毒效应的方法是A. 3H-TdR掺人法B125I释放法C. 51Cr释放法D. 形态学检测法E. CD8检测法20. 包被有抗Ig抗体的亲和板，其吸附的是A. T细胞B. B细胞C. NK细胞D. NKT'细胞E. 吞噬细胞21. Ficollhypaque液分离淋巴细胞是一种A. 不连续密度梯度离心法B. 连续密度梯度离心法C. 亲和层析法D. 离子交换层析法E. 自然沉降法22. Ficollhypaque淋巴细胞分离液的主要成分是A. 聚蔗糖B. 泛影葡胺C. 聚乙二醇D. 聚蔗糖+泛影葡胺E. 聚蔗

7、糖+聚乙二醇23. Percoll分离液的主要成分是A. 聚蔗糖B. 泛影葡胺C. 聚乙二醇D. 聚乙烯吡咯烷酮E.经聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒24. 检测中性粒细胞杀菌功能的方法是A. NBT还原试验B. 白细胞计数C. 溶血空斑试验D. 淋巴母细胞转化试验E. 补体介导的细胞毒试验25. MTT比色法检测IL-2活性，下列哪项是错误的A. 需要IL一2依赖细胞株B. 增殖细胞具有吸收MTT勺能力C. 颜色的深浅代表细胞代谢活性的强弱D. 可反映B细胞的功能E.可反映T细胞的功能（二）多项选择题（x型题）1淋巴细胞分离液要求符合的条件有A对细胞无毒B. 高渗C. 不溶于血液D无色E. 有合

8、适的比重2与T细胞计数有关的表面抗原是A.CD2B. CD3C. CD4D.CD8E. CDl93. 与B细胞计数有关的表面标志是A.SmIgB. CDl9C. CD20D.CD21E. CD24. 符合淋巴母细胞转化的形态学特征有A.细胞体积变小B. 核仁明显、核染质疏松C.可见有丝分裂D. 胞浆极少，呈天青色E.胞内可见空泡5. 用酶联免疫斑点试验检测B细胞功能的优点有A.稳定、特异B.可检测抗体分泌细胞C.可检测抗体的分泌量D.可同时进行B细胞计数E.可同时检测不同抗原诱导的不同抗体的分泌6. 细胞免疫功能测定包括以下哪些A. T细胞计数B. B细胞计数C. T细胞功能测定D.Tc细胞效

9、应测定E. 细胞因子测定7检测淋巴细胞亚群常用的方法有A免疫荧光法B. 流式细胞仪测定C. 酶免疫组化法D放射免疫法E. 免疫金染色法8细胞免疫功能体内试验方法有A细胞毒试验B. 混合淋巴细胞反应C. 皮肤试验D淋巴细胞增殖试验E.接触性过敏试验9. T细胞增殖试验常用的检测方法有A流式细胞仪法B. 形态学方法C. 51Cr释放法D.MTT检测法E.3H一FdF掺人法10检测吞噬细胞功能的方法有A. 吞噬试验B. 杀菌试验C. NBT还原试验D. 化学发光测定法E趋化功能测定法11淋巴细胞亚群的分离方法有A. E花环分离法B. 尼龙棉柱分离法c亲和板结合分离法D. 免疫磁珠分离法E. 超速离心

10、分离法12. T细胞数量检测包括A. T细胞增殖试验B. 间接荧光免疫法C. 酶免疫组织化学法D. 微量细胞毒试验E. 花环技术13. 检测T细胞数量的花环试验有A. 酵母菌花环试验B. 补体C3b花环试验C. E花环试验D. 葡萄球菌花环法E. 抗体致敏细胞花环法14. B细胞表面具有、AmIgB. C抗原C. Fc受体D. 补体受体E. EB病毒受体15. B细胞数量检测的方法包括A. mIg的检测法B. C抗原检测法C. Fc受体检测法D. 补体受体检测法E. 小鼠红细胞受体检测法16. B淋巴细胞功能的测定方法有A. B细胞增殖试验B. 溶血空斑试验C. 酶联免疫斑点法D. 体内测定法

11、E. 形态学检查法17. 中性粒细胞吞噬和杀菌功能的测定方法A. 形态学检查法B. 显微镜检查法C. 溶菌法D. NBT还原试验E化学发光测定法18. 巨噬细胞功能的检测方法包括A. 炭粒廓清试验B. 吞噬功能检测C. 巨噬细胞溶酶体酶测定D. 细胞毒作用测定E. 巨噬细胞促凝血活性测定（三）配伍题问题1-3A. 红细胞层B. 粒细胞层C. 单个核细胞层D. 血浆与血小板层E. 淋巴细胞分离液层1. 采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，最上层是2. 采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，最下层是3. 采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，第二层是问题4-6A.淋巴细胞转化试验B.溶血空

12、斑试验C.炭粒廓清试验D.琼脂糖凝胶平板法E. 化学发光测定法4. 巨噬细胞吞噬功能的检测：5. 中性粒细胞趋化功能的检测：6. 中性粒细胞吞噬和杀菌功能的检测：二、填空题1. PBM包括（）和（）。2. 在反相溶血空斑试验中，每一个空斑代表一个（）。3. B细胞表面特异的标志是（）。4. 常用的测定淋巴细胞活力的方法是（）。5. 淋巴细胞转化情况的判定方法有（）、（）和（）。6淋巴细胞转化试验应用的同位素是（7分离外周血白细胞常用的方法是（）8去除白细胞悬液中残留红细胞的常用方法有（9去除单个核细胞悬液中单核细胞的常用方法有（10. 检测T纟田胞数量的花环技术包括（）花环技术主要有（）和（）

13、。11. 淋巴田胞和单核田胞的密度为（）。12. 外周血经Ficoll分离液离心后从上到下分为（），田胞毒试验应用的同位素是（）和（）。）和（）。）和（）。（）和（）；检测B细胞数量的）（）及（）层。三名词解释1 .外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）2. E花环试验（erythrocyterosettetest）3. 淋巴母细胞转化试验（1ymphoblasttransformationassay）4. 溶血空斑试验hemolyticplaqueassay）5. 四唑氮蓝还原试验（nitrobluetetrazoliumrecoverya

14、ssay,NB还原试验）四、简答题1. 简述T淋巴细胞转化的试验原理和镜下淋巴细胞转化形态学特征。2 .叙述T细胞介导的细胞毒试验的原理、意义和方法分类3测定吞噬细胞功能有哪些常用方法?五论述题简述Fic011一hypaque分离液分离PBM的原理、步骤和注意事项。第三部分参考答案与题解、选择题（一）单项选择题（A型题）1C2E3C4B5A6A7D8A9.E10D11D12C13A14B15A16B17C18C19C20-B21A22D23E24A25D（二）多项选择题（X型题）1ACDE2ABCD3ABCD4BCE5ABCDE6ACDE7ABCE8CE9BDE10ABCDE11ABCD12B

15、CDE13CDE14ABCDE15ABCDE16ABCD17BCDE18ABCDE（三）配伍题1.D2.A3.C4.C5.D6.E、填空题1淋巴细胞单核细胞2.分泌Ig的细胞3SmIg4台盼蓝染色法5.形态学方法。HTdR掺入法MTI"检测法3516H，Cr7自然沉降法聚合物加速沉降法&无菌蒸馏水低渗裂解法0.83%氯化铵处理法9黏附去除法，羰基铁粉吞噬去除法10. E花环试验葡萄球菌花环法抗体致敏红细胞花环法EA花环试验EAC花环试验11. 淋巴细胞和单核细胞的密度为1.077+0.001。12. 外周血经Ficoll分离液离心后从上到下分为血清_,_PBM及_粒细胞、红细

16、胞层。三、名词解释1. PBMC:外周血单个核细胞主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群，也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。2. E花环试验：T细胞表面有特异性绵羊红细胞(SRBC)受体，即E受体。将T细胞与SRBc按一定比例混匀，置4h至少2h或过夜，T细胞表面的E受体能与SRBC结合形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的花环样结构，镜检计数可得总花环(Et)形成率，亦即T细胞的百分率。3. 淋巴母细胞转化试验：细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞出现一系列的增殖反应，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，并发生形态返祖变化，如细胞变大、胞质增多、胞质出现空泡、

17、核染色质疏松、核仁明显，这种淋巴细胞增殖反应又称淋巴细胞母细胞转化(1ymphoblasttransformation)。4. 溶血空斑试验：该方法用于检测实验动物抗体形成细胞数目。其基本原理是抗体形成细胞分泌的Ig与SRBc上的抗原结合，在补体作用下出现溶血反应。方法是将SRBC与其免疫的小鼠脾细胞、补体及适量琼脂糖液混合倾注平板，或者将吸附有已知抗原的SRBc与待检B细胞、补体及适量琼脂糖液混合倾注平板，温育一定时间，抗体形成细胞释放的抗体会使周围SRBc致敏，并在补体作用下出现肉眼可见的溶血空斑，每一空斑中央含有一个抗体形成细胞，因此空斑数量即代表抗体形成细胞数。5. NBT还原试验：活

18、化的中性粒细胞与NBT起温育，由于中性粒细胞吞噬杀菌过程中产生超氧阴离子(O2-)，使被吞进细胞内的NBT由原来呈淡黄色还原成不溶性的蓝黑色颗粒，沉积在细胞浆中，称为NBT阳性细胞。光学显微镜下计数NBT阳性细胞，其百分率可反映中性粒细胞的杀菌功能。四、简答题1.T淋巴细胞转化试验原理：T淋巴细胞在受到非特异性有丝分裂原或特异性抗原刺激后能发生增殖反应，细胞代谢旺盛，蛋白质和核酸合成增加；与此同时细胞体积增大，分裂呈母细胞样，此为淋巴细胞转化现象。因此可借助形态学方法观测淋巴细胞形态变化情况，3H胸腺嘧啶核苷(3HFdR)掺入法测定DNA合成情况，或MTT比色法测定线粒体代谢活性即可判定淋巴细

19、胞转化程度。镜下淋巴细胞形态可以见到以下几种类型。(1) 淋巴母细胞胞体比未转化淋巴细胞大34倍，呈圆形或椭圆形，胞浆染色淡蓝，可有伪足、空泡，细胞核增大，核质疏松，呈细网状，可见分裂现象。(2) 过渡型淋巴细胞形态介于淋巴母细胞和正常淋巴细胞之间，体积稍大，多为1215m胞浆稍多，淡蓝色，核稍大，核质疏松。注意与大淋巴细胞区别，后者虽然体积较大，但核质致密，胞浆较少，嗜碱性强。(3) 正常淋巴细胞与未经刺激的淋巴细胞一样，体积小，核质致密，胞浆少，嗜碱性强。3. 细胞毒T细胞(CTL)在体外能特异性杀伤带有相同抗原的某些敏感传代瘤细胞株(靶细胞)。将适当的靶细胞悬液按一定比例与受检淋巴细胞混

20、合，培养数小时后观察靶细胞的破坏情况可判断受检者的CTL杀伤能力，进而判断其细胞免疫状态。常用方法有形态学检查法和51Cr释放法。CTL杀伤功能测定是体外检测机体细胞免疫功能的一种常用方法。利用靶抗原与淋巴细胞的相互关系阐明靶细胞的抗原性；用于判断肿瘤患者的预后及免疫治疗效果；观察药物、肿瘤抗原以及其他抗原对CTL杀伤功能的影响；鉴定淋巴细胞的功能性亚群等。4. 吞噬细胞功能测定从趋化、吞噬和杀菌三个方面进行检测。常用的方法：趋化功能测定的有滤膜渗透法、琼脂平板法，吞噬功能测定的有吞噬试验，杀菌功能测定的有NBT还原试验、杀菌功能试验、化学发光试验等方法。五. 论述题2. Ficollhypaque分离液分离PBMC勺原理：血液单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。人外周血单个核细胞的密度为1.0501.077，而粒细胞和红细胞的密度在1.0901.093。利用密度为1.077±0.001的Ficollhypaque分层液，将待分离的细胞悬液小心铺于其上，经离心后单个核细胞悬浮