基因工程克隆

1、基因工程克隆主要参考资料*基因克隆和DNA分析(第5版),布朗（英），魏群翻译，高等教育出版社，2008*基因工程原理，吴乃虎编著，北京高等教育出版社，1989，Q75/11*Gene cloning and DNA analysis 6th ed, by T.A. Brown, Wiley Blackwell, 2008 *Genetic engineering，by Desmond S.T.Nicholl, Cambridge, 2008 第1页/共40页主要参考资料 生物技术通报生物技术通报 中国生物工程杂志中国生物工程杂志 农业生物技术学报农业生物技术学报 生物工程学报生物工程学报 植

2、物学报植物学报 遗传学报遗传学报 中国农业科学中国农业科学 作物学报作物学报 Molecular genetics and genomics Plant physiology Plant cell Science Nature第2页/共40页第一章第一章 基因克隆的历史背景基因克隆的历史背景第二章第二章 基因克隆的载体基因克隆的载体第三章第三章 基因克隆的重要酶基因克隆的重要酶第四章第四章 克隆重组体的构建、转化克隆重组体的构建、转化第五章第五章 重组体克隆筛选与鉴定重组体克隆筛选与鉴定第六章第六章 目的基因的分离目的基因的分离第七章第七章 PCR PCR 技术技术第八章第八章 基因和基因组的

3、测序基因和基因组的测序 第九章第九章 基因的表达和功能研究基因的表达和功能研究第十章第十章 基因组的研究基因组的研究第十一章第十一章 蛋白质的表达蛋白质的表达第十二章第十二章 基因工程医学应用基因工程医学应用 第十三章第十三章 基因工程农业应用基因工程农业应用第十四章第十四章 基因工程法医学应用基因工程法医学应用 基本原理基本原理研究研究生物技术第3页/共40页第一章 基因工程的历史背景第一节第一节 基因工程的诞生基因工程的诞生第二节第二节 基因工程的定义基因工程的定义第三节第三节 什么是基因克隆什么是基因克隆第四节第四节 基因克隆的步骤基因克隆的步骤第五节第五节 PCR PCR 技术技术第六

4、节第六节 如何学习这门课如何学习这门课第4页/共40页1865年年 孟德尔孟德尔 豌豆杂交试验豌豆杂交试验1944年年 Avery Avery 肺炎双球菌转化肺炎双球菌转化 遗传物质遗传物质DNA1973年年 伯格伯格- -杰克森杰克森- -考恩考恩- -鲍耶鲍耶 DNA分子体分子体外拼接外拼接 基因工程诞生基因工程诞生1953年年 Watson-crickWatson-crick DNA双螺旋结构双螺旋结构第一节 基因工程的诞生第5页/共40页第一节 基因工程的诞生1865年，孟德尔，“遗传因子”1903, W.Sutton和T.Boveri 遗传因子定位于 染色体，杂交试验-染色体的行为

5、吻和1909年，W. Johansen ，“基因”1910，Morgan果蝇染色体 定位2000个基因第6页/共40页第一节 基因工程的诞生 2020世纪世纪4040年代，年代，AveryAvery等发现了生物遗等发现了生物遗传物质的化学本质是传物质的化学本质是DNADNA。第7页/共40页40年代，证实DNA是遗传物质 早在上世纪20年代，已经知道染色体由DNA和蛋白质构成，但组成蛋白的氨基酸有20种，而组成DNA的核苷酸只有4种，什么是遗传物质？ 1928年，英国微生物学家F. Griffith（格里菲思）著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。 （1）S型：注射小白鼠，死亡。 （2）S型，65

6、加热：注射小白鼠，活。 （3）R型：注射小白鼠，活。 （4） 65 加热S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。 第8页/共40页肺肺炎炎病病菌菌实实验验 第9页/共40页 20 20世纪世纪5050年代，年代，Watson-crickWatson-crick提出了提出了DNADNA 双双螺螺旋旋结结构构模模型型第10页/共40页Watson-crickWatson-crick重温当年重温当年第11页/共40页60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则） 既然，既然，DNADNA是遗传信息的载体，那么它是是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控如何传递遗

7、传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？制生物的表型性状的呢？ 以以NirebergNireberg等为代表的一批科学家等为代表的一批科学家经过艰经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到酸，到19661966年，全部破译了年，全部破译了6464个密码子，个密码子，并提并提出了遗传信息传递的出了遗传信息传递的“中心法则中心法则”。 第12页/共40页60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则） 第13页/共40页60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心

8、法则） 第14页/共40页第一节 基因工程的诞生 基因克隆的成功（基因克隆的成功（Cohen + Berg ) 1973 1972 1972年，年，BergBerg，第一个实现第一个实现DNADNA重组的人重组的人 19731973年，年，CohenCohen等，第一个实现重组体转化等，第一个实现重组体转化 第15页/共40页第一节 基因工程的诞生 基因克隆的成功（基因克隆的成功（Cohen + Berg ) 1973 19731973年，年，CohenCohen和和BergBerg将将E.coil E.coil 的的TerTer质质粒粒psclolpsclol和和NerNer质粒质粒srR6

9、-3srR6-3体外限制酶切割，体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化连接成一个新的质粒，转化E.coilE.coil，在含四，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了环素和新霉素的平板上筛选出了Ter+Ner,Ter+Ner,实实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，上的第一个克隆化并取得成功的例子，19731973被定为被定为基因工程诞生基因工程诞生的元年。的元年。 第16页/共40页CohenCohen等的重组实验示意图等的重组实验示意图TcrNerEco RIEco RI连接酶连接酶TcrNer双抗重组菌落双抗重组菌落

10、基因工程发展史上首次实现了重组基因工程发展史上首次实现了重组DNA的细菌转化的细菌转化第17页/共40页第二节基因工程的定义 （一）基因（一）基因（genegene） 从化学上来说，指的是一段从化学上来说，指的是一段DNADNA或或RNARNA序列，该序列可以产生或影响某种表型序列，该序列可以产生或影响某种表型（genotypegenotype，phenotypephenotype）。）。 从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。第18页/共40页第二节基因工程的定义 （二）基因工程（二）基因工程（ge

11、netic engineeringgenetic engineering） 基因工程是指重组基因工程是指重组DNADNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组即重组DNADNA技术技术）；而下游技术则）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 第19页/共40页第二节基因工程的定义 ( (三三) )与基因工程相关的概

12、念：与基因工程相关的概念： 重组重组DNADNA技术技术（DNA recombination techniqueDNA recombination technique） 是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNADNA体外操作程序体外操作程序，也称为分子克隆技术。，也称为分子克隆技术。 第20页/共40页第二节基因工程的定义 ( (三三) )与基因工程相关的

13、概念：与基因工程相关的概念： 生物工程生物工程（BiotechnologyBiotechnology）也译成生物技术，是人们利用微生物、动植物体对物质原）也译成生物技术，是人们利用微生物、动植物体对物质原料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术，包括：基因工程、细胞工程、发酵工程和料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术，包括：基因工程、细胞工程、发酵工程和酶工程酶工程 。 第21页/共40页第二节基因工程的定义 ( (三三) )与基因工程相关的概念：与基因工程相关的概念： 基因克隆基因克隆（gene cloninggene cloning）：）： 是基因工程的核心技术。是基因工程的核心技术。

14、 第22页/共40页第三节 什么是基因克隆克隆克隆这个术语的几种含义： （1）作为名词 带有相同插入顺序的重组DNA分子的1个群体。 最常用的是描述一个微生物的一个菌落，这些微生物带有插入了特定DNADNA片断的载体分子。（colony clone ) （2 2）作为动词，是“去克隆”，即利用体外DNADNA重组技术将一个特定的基因或DNADNA顺序插入一个载体分子。第23页/共40页第三节 什么是基因克隆1.1. 克隆原意是指单细胞纯系无性繁殖。（克隆原意是指单细胞纯系无性繁殖。（colony clone )colony clone )2.2.基因克隆（基因克隆（gene cloningge

15、ne cloning）是将实验得到的人们所需的微量是将实验得到的人们所需的微量基因基因结构，引入适当的宿主结构，引入适当的宿主细胞中去。在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需细胞中去。在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需要的基因结构，并进行表达。要的基因结构，并进行表达。第24页/共40页第四节 基因克隆的步骤1 1 载体的选择和制备载体的选择和制备分；分；2 2 制备目的基因片段制备目的基因片段切；切；3 3 DNADNA片段的重组连接片段的重组连接接；接；4 4 重组重组DNADNA导入受体细胞导入受体细胞转；转；5 5 重组子的筛

16、选重组子的筛选筛；筛；6 6 重组子的扩增重组子的扩增增；增；7 7 重组子的表达重组子的表达克隆成功完成克隆成功完成第25页/共40页4 基因工程的操作过程切接转增检第26页/共40页Selection of positive cloneIntroduction into a host cell Joining to a vector Generation of DNA fragment Gene cloning 第27页/共40页思考题：思考题：1.1.名词解释：基因克隆，生物工程，重名词解释：基因克隆，生物工程，重组组DNADNA技术。技术。2.2.简述简述 基因克隆的步骤。基因克隆的步

17、骤。第28页/共40页第二章 基因克隆的载体 引言： 载体的概念（introduction）第一节 质粒载体（plasimid vectors）第二节 噬菌体载体（phage vectors）第29页/共40页把一个有用的基因（目的基因研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫载体。作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。 引言：载体的概念第30页/共40页复制起始位点：克隆载体中的一段DNA序列，能够使质粒在宿主细胞内独立复制。多克隆位点：克隆载体中的一段用于插入外源D

18、NA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。第31页/共40页选择标记基因：在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选择得到转化的细胞（菌）。第32页/共40页主要的就业方向教师教师到高等学校从事教学科研工作，起薪到高等学校从事教学科研工作，起薪1500150020002000元元/ /月。月。研究人员研究人员到生物学、农业、医药、食品发酵等机构，到生物学、农业、医药、食品发酵等

19、机构，从事科研工作，起薪从事科研工作，起薪1500150020002000元元/ /月。（地域差别）月。（地域差别） 农科院及下属单位（玉米、谷子、高粱和果树等）农科院及下属单位（玉米、谷子、高粱和果树等）研发人员研发人员到各类生物技术公司或有关企业单位从事生到各类生物技术公司或有关企业单位从事生物新产品开发。起薪一般为物新产品开发。起薪一般为2000200030003000元元/ /月。月。第33页/共40页 20 20世纪世纪5050年代，年代，Watson-crickWatson-crick提出了提出了DNADNA 双双螺螺旋旋结结构构模模型型第34页/共40页60年代，确定了遗传信息的传递方式（中心法则） 既然，既然，DNADNA是遗传信息的载体，那么它是是遗传信息的载体，那么它是如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控如何传递遗传信息的呢？遗传信息又是如何控制生物的表型性状的呢？制生物的表型性状的呢？ 以以NirebergNireberg等为代表的一批科学家等为代表的一批科学家经过艰经过艰苦的努力，确定了遗传信息以密码方式传递，苦的努力，确定了