SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量(精)

1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量一.实验目的1学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。2. 掌握垂直板电泳的操作方法。3运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。二实验原理带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成1225个组分。因此适用于不同相对分子

2、质量物质的分离，且分离效果好。SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS,好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：Acr:丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵化学催化剂TEMED:四甲基乙二胺加速剂SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）,SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质

3、在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下

4、进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：1溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4,如果单休浓度降到0.5mmol/L以下时，两者的结合比仅为1:0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:32样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10100mmol/L3二硫键是否完全被还原采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，

5、只有完全打开二硫键，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。一般至少采用两种

6、方法测定未知样品的分子量，互相验证。PAGE电泳中各种成分及其作用过硫酸铵：凝胶聚合的催化剂（过量会使离子强度升高。），四甲基乙二胺：加速剂。（碱性条件下容易聚合）丙烯酰胺与双丙烯酰胺（P133）二者总浓度及相对比例决定凝胶的孔径、交联度，硬度及弹性。浓缩胶与分离胶浓缩胶：胶浓度低，交联度低，pH=6.7，蛋白带负电荷少，大孔胶。pH=6.7时，电极缓冲液中甘氨酸负离子解离较少（慢离子），氯离子是快离子，蛋白迁移速率介于两者中间，局部电位梯度大，（快离子移动快，形成局部低电导区，产生高电位，使移动加快）从而产生浓缩效应。分离胶：胶浓度高，交联度高，pH=8，蛋白带负电荷多，小孔胶，pH=8.0

7、时，电极缓冲液中甘氨酸负离子解离较多，与氯离子一样，迁移速度加快，蛋白迁移速率最慢，部电位梯度小。不连续性：孔径大小不连续，离子成分不一样，移动速度不一样三.实验试剂和器材2.实验试剂）（30%丙烯酰胺（Acr）:称Acr30g,甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g,加蒸馏水至100ml,过滤后置棕色瓶中，4°C贮存可用1-2月。（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）（约0.28M）（3）1.5mol/LpH8.9Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。（分离胶缓冲液，含0.4%SDS）（4）0.5mol

8、/LpH6.8Tris-HCl缓冲液:称取Tris12.1g,力口入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml。（浓缩胶缓冲液）（5）（7）10%过硫酸铵（AP）（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品缓冲液液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。（11）染色液：称取考马斯亮蓝R2500.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用。（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml,加蒸馏水

9、定容至1000ml。（13）SDS电极缓冲液（内含0.1%SDS,0.025mol/LTris-0.192mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）:称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至2000ml。3.实验器材垂直板电泳装置直流稳压电源移液管滤纸微量注射器大培养皿浓缩胶5%浓缩胶缓冲液：3.0ML丙烯酰胺贮备液：1.0ML四.实验过程各部分凝胶配制分离胶12.5%分离胶缓冲液：3.0毫升丙烯酰胺贮备液：5.0ML10%过硫酸胺：120微升水4.0MLTEMED:12微升10%过硫酸胺：60微升2ML6微升混匀后灌胶，水封1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个

10、干净的锥形瓶.2.把玻璃板在灌胶支架上固定好.3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.5.在上槽内加入缓冲液后，拔出样梳。6、加样（1）取10卩1标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10卩12倍样品缓冲液，上样量为10卩1。（2）取10卩1样品溶液，再加入10卩12倍样品缓冲液，上样量分别为5卩1和3卩1。7用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前，样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。沉时会发生扩散.8.电泳槽中加入缓冲液，接通电

11、源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。11.实验结果分析。绘制标准曲线：按公式计算相对迁移率：以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。五.分析计算绘制标准曲线：SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。在含有强还原剂的SDS

12、溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。实验结果好应按公式计算相对迁移率：以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。'从图中选取第二泳道的条带来作为未知蛋白，求箕分子量大小。标准蛋白质量lgMW4.994.824.634.494.304.16X相对迁移率0.060.150.250.580.820.930.534栢对迁務率J5.2*54.

13、84.6柜对迁移率与蛋白贡分子虽关系图00.20.40.60.81y=-0.8383x+4.95484.44.2践性（店応0由以上数据求得标准曲线,由标准曲线知相对迁移率为0.53时,lgMW=4.51求得X的相对分子质量MW=31622六.思考题1. 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?2. 样品溶解液中各种试剂的作用是什么?3.在不连续体系SDS-PAGE中，分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用？答：1.水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气，凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.2：（1）SDS能断裂分子内和分子间氢键，破

14、坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异;（2）溴酚蓝作位蛋白质的染色剂，指示电泳的进行；（3）Tris作为缓冲液，为电泳提供良好的缓冲体系；（4）四甲基乙二胺：作为加速剂，加快电泳的进行。3.答：sds-page预混液里加入TEMED和AP，可以使丙烯酰胺凝；，过硫酸铵AP）的作用主要是提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行，然后在促凝剂TEMED的作用下使丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺聚合。1丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的最大暴露量不超过0.5“g/kg皮肤接触可致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作机能失调、四肢无力等。2. 丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤，不要接触皮肤，戴手套、口罩操作3. 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板，凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.4. 没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近，一定要催化