转录组相关实验技术

1、- -实验七 聚合酶链反响PCR技术体外扩增 DNA目的1、学习 PCR 反响的根本原理和实验技术。2、了解引物设计的一般要求。原理聚合酶链反响 polymerase chain reaction， PCR 是体外酶促合成 DNA 片段的一种技术。利用 PCR 技术可在数小时之内大量扩增目的基因或 DNA 片段，以用于基因工程操作。PCR 进展的根本条件：DNA 模板在 RT-PCR 中模板是 RNA ；引物；dNTPdATP、dTTP、dGTP、dCTPTaq DNA 聚合酶PCR 循环由三个步骤组成：变性 使模板 DNA 解离成单链；退火 使引物与模板 DNA 所需扩增序列结合；延伸 DN

2、A 聚合酶利用 dNTP 合成与模板碱基序列互补的 DNA 链。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过 30 个左右循环后，目的片段的扩增可达 106 倍。引物设计：要保证 PCR 反响能准确，特异，有效的对引物 DNA 进展扩增，通常引物设计要遵循以下原那么：引物长度：1525 个核苷酸；CG 含量为 40%60%；Tm 值为 55Tm=4C+G+2A+T计算；引物与非特异配对位点的配对率小于 70%；引物自身配对形成的茎环构造，茎的碱基对小于 3，两条引物间配对碱基数小于 5 个。由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。本实验以实验一中提取的质粒 DNA 为模板

3、， 进展 PCR 扩增， 大量得到目的 DNA 片段。试剂与器材一、试剂1、 Taq DNA 聚合酶 2、 10×反响缓冲液含 25mmol MgCl23、 dNTP 4、 引物P1、P25、 溴乙啶染色液(EB)： 10mg/ml 溴乙啶。 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。6、 点样缓冲液 Loading buffer10× ：0.25%溴酚蓝，40%甘油。二、器材1、 PCR 扩增仪 2、 电泳仪 3、 台式离心机4、 紫外分析仪 5、 恒温水浴 6、 凝胶成像系统操作步骤一、PCR 扩增1、按下表参加试剂，并小心混匀。模板为实验一中提取的质粒 DNA。试剂 体积

4、50ulddH2O 35ul10 x buffer 5ul10×dNTP 5ulPrimer P1 1ulPrimer P2 1ul模板 2ulTaq 酶2.5U 1.0ul2、设置 PCR 程序： 94 180s 94 45s35 cycles: 55 45s 72 60s 72 600s3、运行 PCR 程序二、PCR 产物鉴定反响完毕后，取 20ul PCR 产物进展 1.2%琼脂糖电泳分析。实验八 RNA 提取与纯化一、目的掌握 RNA 提取的根本技术，了解 RNA 提取过程中的各种本卷须知。二、原理RNA 提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。RNA 提取和 DNA 提

5、取有类似的地方， 因为它们都是核酸， 都具有较好的水溶性。 提取 RNA首先破碎细胞，然后用提取液将 RNA 溶出，反复抽提去除蛋白质，参加乙醇沉淀 RNA，将 RNA沉淀溶解备用。那么如何区分 DNA 和 RNA 分开？DNA 和 RNA 的溶解性不同，DNA 在 1M 的盐溶液中具有最好的溶解度，而 RNA 在 0.14M 的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进展区分。另外，RNA 的分子量一般比较小，而 DNA 分子很大且和蛋白结合成复合体，所以 DNA 更容易随蛋白沉淀，而 RNA 具有较好的溶解性。RNA 提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中 RNA 酶

6、。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在 180×6 h 以上。所有的塑料器皿用 0.1的 DEPC 水 37过夜浸泡，然后湿热灭菌80烘干备用。配制溶液所需的水也要用 DEPC 处理过的水，而配置 Tris 相关的缓冲液时Tris 会与 DEPC 发生反响，应防止用 DEPC 处理。另外操作过程中应戴手套。判断 RNA 的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性是否被降解 。RNA 的纯度可以通过分光光度计进展测定的 A260A280 值来判断。RNA 的完整性主要通过电泳分析来说明，未降解的总 RNA 电泳时在凝胶中会出现 18S 和 28SrRNA 对应的条带如果有 DNA 污染那么在 R

7、NA 后会发现基因组 DNA 对应的条带 。RNA 电泳系统也要严格对 RNA 酶进展处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳，那么用尽量减少电泳时间。三、试剂与器材一试剂1、暗培养 7 天的小麦苗，用前光照诱导 3 h2、DEPC3、DEPC 处理的 ddH2O4、RNA 提取液： 每 1000 毫升中含有Tris 6.06 克 (最终浓度为 50 mM )LiCl 6.03 克 (LiCl -H2O 9.06 克) (最终浓度为 150 mM )EDTA0.5 M 10 毫升 (最终浓度为 5 mM )SDS 50 克 (最终浓度为 5 % )5、8 M Li Cl：33.92 克 Li Cl 溶于

8、 100 ml DEPC 处理的 ddH2O6、 水饱和酚7、 氯仿8、 0.5M NaCl9、 溴乙啶(EB)： 10mg/ml 溴乙啶。 注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。10、点样缓冲液 Loading buffer10× ：0.25%溴酚蓝，40%甘油。三、器材1、 分光光度计 2、 电泳仪 3、 台式离心机4、 手提式紫外监测仪 5、 恒温水浴 6、 凝胶成像系统四、操作步骤1、取植物叶片 1-3 克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分装，小量提取试剂量可减至 110)2、液氮挥发完之前，倒入含有 10 毫升 RNA 提取液的离心管中，迅速反复倒置混匀，直至看不

9、见任何团状物为止。3、 立即参加 10 毫升的等体积 酸性 酚/氯仿， 剧烈 ！ 反复倒置混匀 5 至 10min如在震荡器上震荡，要确保混匀而不能仅仅是振动！ 。4、13000g×5min，吸管取上清注意防止吸取界面上的蛋白 。5、重复步骤 3 和 4，三次左右注意观察界面上白色物质 。6、取上清，参加等体积的氯仿，反复倒置混匀 2-5min。7、13000g×5min。8、取上清，参加 1/3 体积 8 M 的 LiCl 即 8 M LiCl 应占最后体积的 25% ， 沉淀 RNA，4过夜。9、离心 13000g × 10 min。10、 弃上清,保存沉淀

10、此时应把 RNA 沉淀转入 Eppendorf 管中， 以便于操作 , 参加 70%无水乙醇+30% 0.5 M NaCl 的混合液 0.5 毫升洗涤沉淀数分钟和缓地反复倒置混匀 ，离心 13000g × 2 min 。重复洗涤沉淀数次。11、用 70%乙醇再洗涤 2 次沉淀，去掉盐离子。12、用枪头吸去残留的液体，真空枯燥 2min。13、参加 200 ul DEPC 处理过的水溶解 RNA。14、取用 5 ul 电泳检测 RNA 完整性, 用 TEB 缓冲液, 200V× 20-30min。15、取 5 ul 稀释 40 倍测定 RNA 纯度和浓度，A260 nm /A

11、280 nm 应在 2.0 左右。16、将 RNA 分装,放在-70长期保存备用. 辅助方案：试剂盒提取法Trizol一试剂：1.Ttizol Reagent 2. 氯仿 3. 异丙醇 4. 70%无水乙醇5.DEPC二器材：1、 研钵 2、 离心机三实验步骤1、 称取小麦叶片 50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到 1.5ml 离心管中。2、 参加 1 ml Trizol Reagent，1530×5min。3、 参加 0.2ml 氯仿，剧烈振荡 15 sec，1530×3min。4、 冷冻离心 12 000 rpm×15min。5、 将上清液转

12、移到另一个离心管中，加 0.5ml 预冷异丙醇,混匀 ，-20放置20min。6、 冷冻离心 12 000 rpm×10min。7、 参加 0.5ml 70% 乙醇洗 RNA 沉淀，悬浮，7500 rpm×2min，除去乙醇。8、 参加 30 ul DEPC 处理过的 ddH2O 溶解 RNA。实验九 RT-PCR 扩增目的基因 cDNA目的学习从细胞或组织的 RNA 中用逆转录 PCR 扩增目的基因的技术及操作。原理普通 PCR 方法可以以 DNA 为模板扩增基因， 但真核生物的基因组中通常分为可转为 mRNA的外显子和不转录的成 mRNA 的内含子，所以从染色体 DNA

13、 用 PCR 方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的 DNA 分子，不能用于基因工程的直接表达。如果用人工的方法把内含子去除，是极其烦琐费力的事。逆转录 PCR 利用逆转录病毒依赖于 RNA 的 DNA 逆转录合成酶，在反义引物或 oligod T的引导下合成 mRNA 互补的 DNAplementalDNA ，再按普通的 PCR 的方法用两条引物以 cDNA 为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一 DNA 的 5，和 3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR 成为了目前获取目的基因的一条重要途径。试剂与器材一、试剂1、 RNA 模板 2、 cDNA 引物 3、

14、 反转录缓冲液4、 dNTP 5、 AMV 反转录酶6、 RNA 抑制剂RNasin 7、 Taq 酶8、 10×PCR 缓冲溶液 9、 引物P1、P2二、器材1、PCR 扩增仪 2、电泳仪 3、台式离心机 4、恒温水浴5、紫外分析仪 6、微量移液器操作步骤一、RNA 的反转录1、在小管中依次参加5 ul RNA6 ul DEPC H2O混合后,65×5 min(破坏二级构造).2、 置于冰浴 5 min.3、在管中依次参加: (反响体系为 20 ul)RT buffer ( 5×) 4 ulRNasin 0.5 uldNTP ( 10mM) 2 ulOligo T17AGC 50-100 uM 1 ulAMV 反转录酶 1 ul置于 42× 1 h。4、70× 5 min使酶失活，可省略 。5、参加 100ul ddH2O (从总 RNA 开场制备)或 1000 ulddH2O从 mRNA 开场制备 。6、置于-20保存备用.二、