基因工程操作程序学习教案

1、会计学1基因工程基因工程(jyn gngchng)操作程序操作程序第一页，共42页。补：原核细胞的基因补：原核细胞的基因(jyn)(jyn)结构结构非编码非编码(bin m)(bin m)区区非编码非编码(bin m)(bin m)区区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子 RNA RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。其结合。 转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，并以分子移动，并以DNADNA分子的一条链为模板合成

2、分子的一条链为模板合成RNARNA。 转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚合聚合酶也从酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。第1页/共41页第二页，共42页。不能转录不能转录(zhun l)(zhun l)为信使为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应：能转录相应(xingyng)(xingyng)的信的信使使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码编码(bin (bin m)m)区区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，

3、在该序列中，苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。启动子启动子第2页/共41页第三页，共42页。补：真核细胞的基因补：真核细胞的基因(jyn)(jyn)结结构构编码编码(bin (bin m)m)区区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合结合(jih)(jih)位点位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子第3页/共4

4、1页第四页，共42页。补：真核细胞的基因补：真核细胞的基因(jyn)(jyn)结构结构编码编码(bin (bin m)m)区区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合结合(jih)(jih)位点位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含不能够编码蛋白质的序列叫做内含子子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 第4页/共41页第五页，共42页。第5页/共41页第六页，共42页。真核真核细胞细胞的的 基因基因(jy(jyn)n)结

5、构结构编码编码(bin (bin m)m)区区非编码非编码(bin m)(bin m)区区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子第6页/共41页第七页，共42页。原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和

6、具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构原核细胞与真核细胞的基因结构(jigu)(jigu)比较比较思思考考(s(skkoo) )编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构胞与真核细胞基因结构(jigu)(jigu)一样长一样长吗？吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码第7页/共41页第八页，共42页。基因工程基因工程(jyn gngchng)(jyn gngchng)基本操作的四个基本操作的四个步骤步骤1 1、目的基因、目的基因(jyn)(jyn)的获取的获取2 2、基因、基因(jyn)(jyn)表达载体

7、的构建表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定第8页/共41页第九页，共42页。一、目的一、目的(md)(md)基因的基因的获取获取1 1、目的、目的(md)(md)基因主要是指基因主要是指_编码编码(bin m)(bin m)蛋白质的结构蛋白质的结构基因基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两

8、段第一和二两段第9页/共41页第十页，共42页。基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）1.1.基因文库基因文库第10页/共41页第十一页，共42页。基因组基因组文库文库(wnk)与部分与部分基因文基因文库库(wnk)的关系的关系第11页/共41页第十二页，共42页。2.2.基因文库的构建基因文库的构建(u jin)(u jin)方法方法鸟枪法：鸟枪法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多(xdu)DNA(xdu)DNA片片段段运载运载(ynzi)(ynzi)体体限制酶限制酶与载体连接与载体连接载入载入受体细胞受体细胞产生特定性状产生

9、特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离( (直接分离法直接分离法) )( (一一) )从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因第12页/共41页第十三页，共42页。反转录法：反转录法：cDNA文库文库 以目的基因转录成的信以目的基因转录成的信使使(xnsh)RNA为模板，为模板，反转录成互补的单链反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成，然后在酶的作用下合成双链双链DNA，从而获得所需，从而获得所需的基因。的基因。目的目的(md)(md)基因的基因的mRNAmRNA杂交杂交(zjio)(zjio)双链双链( (单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)

10、DNA)单链单链DNADNA反转录酶反转录酶核酸酶核酸酶H H2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA DNA （cDNAcDNA）( (目的基因目的基因) )第13页/共41页第十四页，共42页。上述上述(shngsh)(shngsh)三种目的基因提取的方法有何优三种目的基因提取的方法有何优缺点？缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简操作简便便(jinbi(jinbin)n)广泛广泛使用使用工作量大，盲目工作量大，盲目(mngm)(mngm)，分离出来，分离出来的有时并非一个基因的

11、有时并非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要求的技很不稳定，要求的技术条件较高术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因第14页/共41页第十五页，共42页。( (二二) )利用利用(lyng)PCR(lyng)PCR技术扩增目技术扩增目的基因的基因第15页/共41页第十六页，共42页。 概念：概念：PCRPCR全称为全称为(chn (chn wi)_wi)_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件条件(tiojin)(tiojin)：_、 _ _、_ _ 、_.

12、_.原理原理(yunl)(yunl)：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物TaqTaq酶酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增( (二二) )利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因第16页/共41页第十七页，共42页。过程过程(guchng)(guchng)：a a、DNADNA变性（

13、变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板(mbn)(mbn) 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（复性、退火（复性 25-65 25-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物物与与DNADNA模板结合模板结合(jih)(jih)，形成局部，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链第17页/共41页第十八页，共42页。第18页/共41页第十九页

14、，共42页。（3 3）人工合成）人工合成(rn (rn n h chn)n h chn)一、目的基因一、目的基因(jyn)(jyn)的获取的获取 条件：如基因比较条件：如基因比较(bji(bji o)o)小，小， 又已知；又已知； 方法：可借助方法：可借助 用化学方法直接人用化学方法直接人 工合成。工合成。核苷酸序列核苷酸序列DNADNA合成仪合成仪第19页/共41页第二十页，共42页。根据根据(gnj)已知的氨基酸序列合成已知的氨基酸序列合成DNA法法 ： 根据已知蛋白质根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测(tuc)(tuc)出相应的信使出相应的信使RNARNA序列，然后按照碱

15、序列，然后按照碱基互补配对原则，推基互补配对原则，推测测(tuc)(tuc)出它的结构出它的结构基因的核苷酸序列，基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成单核苷酸为原料合成目的基因。目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列(xli)(xli)mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法第20页/共41页第二十一页，共42页。1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用

16、用_切断切断(qi dun)(qi dun)目目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。( (二二) )基因表达载体基因表达载体(zit)(zit)的构建的构建 核心核心(hxn)3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同第21页/共41页第二十二页，共42页。质粒质粒DNADNA分子分子(fnz)(fnz)限制限制(xinzh)(xin

17、zh)酶酶处理处理一个切口一个切口(qi ku)(qi ku)两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 核心核心同一种同一种( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建4.4.过程过程: :第22页/共41页第二十三页，共42页。5.5.基因基因(jyn)(jyn)表达载体的组表达载体的组成：成：复制原点复制原点+ +目的目的(md)(md)基因基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记标记基因基因它们有什么它们有什么(shn me)作用？作用？第23页/共41页第二十四页，共4

18、2页。( (三三) )将目的将目的(md)(md)基因导入受体细胞基因导入受体细胞转化转化(zhunhu) (zhunhu) 目的基因进入目的基因进入_内，并且内，并且(bngqi)(bngqi)在在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达第24页/共41页第二十五页，共42页。( (三三) )将目的将目的(md)(md)基因导入受体细胞基因导入受体细胞转化转化(zhunhu) (zhunhu) 方法方法(fngf)(fngf)将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞

19、微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达第25页/共41页第二十六页，共42页。1 1、将目的基因导入植物细胞、将目的基因导入植物细胞(xbo)(xbo)的方法：农杆的方法：农杆菌转化法菌转化法（1 1）农杆菌介绍）农杆菌介绍（2 2）原理及适用范围）原理及适用范围( (三三) )将目的将目的(md)(md)基因导入受体细胞基因导入受体细胞第26页/共41页第二十七页，共42页。( (三三) )

20、将目的将目的(md)(md)基因导入受体细胞基因导入受体细胞第27页/共41页第二十八页，共42页。第28页/共41页第二十九页，共42页。( (四四) )目的目的(md)(md)基因的检测与鉴基因的检测与鉴定定检查是否检查是否(sh fu)成功成功检测检测(jin (jin c)c)检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因方法方法DNADNA分子杂交分子杂交第29页/共41页第三十页，共42页。第30页/共41页第三十一页，共42页。( (四四) )目的基因的检测目的基因的检测(jin c)(jin c)与鉴定与鉴定检查是否检查是否

21、(sh fu)成功成功检测检测(jin (jin c)c)检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交第31页/共41页第三十二页，共42页。第32页/共41页第三十三页，共42页。( (四四) )目的基因的检测目的基因的检测(jin c)(jin c)与鉴与鉴定定检查检查(jinch)是否

22、成功是否成功检测检测(jin (jin c)c)鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交第33页/共41页第三十四页，共42页。DNADNA分子分子(fnz)(fnz)杂交示杂交示意图意图 采用一定的技术手段，将两种生物

23、的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子分子(fnz)(fnz)的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。是两条游离的单链。 P15P15思考思考(sko)(sko)与探究与探究第34页/共41页第三十五页，共42页。1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列序

24、列(xli) B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C C第35页/共41页第三十六页，共42页。2）不属于质粒被选为基因运载体的理由）不属于质粒被选为基因运载体的理由(lyu)是是 A、能复制、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNA第36页/共41页第三十七页，共42页。3）有关基因工程）有关基因工程(jyn gngchng)的叙述中，错误的叙述中，错误的是（的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基