遗传的物质基础

1、专题讲座遗传的物质基础 黄更生（广东第二师范学院生物系讲师、实验室主任） 讲座一 遗传的物质基础的发现 ( 问题 why) 人类进化到一定阶段，不再像向其他动物仅为生存的而挣扎，开始关注自身与外部环境的相关因素的时候，人类即彻底与动物拉开距离，有了自己独特的思考。 人类思考的三个问题，也是我们生物学包括遗传与分子生物学要解决的三大问题，即 1.Where? 我们是从哪里来的，即生命的起源问题。 2.Why ? 为什么老鼠只能生老鼠，不能生出一头大象来？即生命特征的延续的控制，即遗传方式的问题。这个问题的解决有助于我们了解物种遗传的本质。 3.How ? 老鼠是如何把自己的物种特征传递下去的，又

2、是怎么保持这些特征的稳定性的，即遗传机制的问题。这个问题的解决有助于我们理解遗传的机理并依此了解相关疾病的发病机制和展开基因工程的研究和应用。 遗传学和现代分子生物学的发展史几乎可以说就是对这三个问题的认识和发现的逐步深入的过程。 1865 年，孟德尔 (G.Mendel) 提出生物的性状由“遗传因子”决定的。 1910 年，摩尔根 (T.Morgen) 提出“遗传粒子”学说并总结出“基因”这一概念，并首次将代表某一性状的基因同相对应的染色体联系起来。 “基因”是什么？相当长一段时间，人们公认，只有体积够庞大、结构够复杂的蛋白质才堪担当传递遗传信息的“基因”这一重任。 1869 年，J.T.M

3、iescher 医生从伤员绷带的脓细胞中提取到一种富含磷元素的酸性化合物 ( 其实是白细胞中的核酸 ) 并称之为“核素 (muclein) ”。 18851900 年间， Kossel、 Johnew、 Levene 研究发现碱基是构成核酸的基本结构。构成方式是碱基 - 核糖 - 磷酸形成核酸的基本单位核苷酸。 1929 年 Levene 确定核酸有两种，一种是脱氧核糖核酸 (DNA) ，另一种是核糖核酸 (RNA) 。 证实遗传物质的三个经典实验 一、肺炎双球菌的转化实验 1928 年格里菲斯 (Frederick Griffith) 肺炎双球菌 转化实验提示了遗传物质的本质是核酸。 192

4、8 年，Griffith 在研究 肺炎双球菌致病机制的时候意外发现，将肺炎球菌 S在特殊条件下进行离体培养，从中分离出 R 型。把这种 R 型的少量活细菌和大量已被杀死的 S 混合注射到小家鼠体内以后，小家鼠被致死。肺炎双球菌可导致人类的肺炎和老鼠的败血症，分有毒的光滑型 (smooth,S) 和无毒的粗糙型 (rough,R) 两类，S 型细菌细胞被由多糖构成的荚膜包被，可保护其不被受感染的动物体内的白细胞杀死。R 型的细菌因为其控制 UDPG - 脱氢酶的基因发生了突变，无法产生荚膜，无法在受感染动物体内存活而不具备感染能力。细菌必需借助其完整的细胞结构才能完成其在宿主细胞内的分裂增殖而不

5、能像病毒那样借助宿主的染色体合成组装自身的蛋白质成分，故单独注射 S 或 R 型的 DNA 都不能致死老鼠。合理的解释是 R 型细菌从杀死的 S 型细菌获得了某种物质(核酸)，即转化，恢复了合成荚膜的能力从而有了毒性。其机制可解释为同时注射入老鼠细胞的加热致死的 S 型细菌的细胞释放出 S 型肺炎双球菌的基因片段，在细胞最易接受外来核酸的感受态 ( 多为对数生长期的细胞，此时细胞生长力最为旺盛 ) 进入 R 型细菌细胞与 R 型细菌的 DNA 重组，修复了其控制 UDPG - 脱氢酶的基因使其转化为 S 型细菌从而重获生成荚膜的能力而具有了致死性。Griffith 的这一实验为核酸是生物性状遗

6、传的物质的认识奠定了基础。 1944 年，艾弗里 (O.Avery) 及其同事麦克劳德（CMMcleod）和麦卡蒂（MJMccarty）通过离体的转化实验，从 S型活体细菌中分馏、提取荚膜多糖、脂类、RNA、蛋白质 将它们分别和 R 型活菌混合均匀后注射人小白鼠体内，结果只有注射 S 型菌 DNA 和 R 型活菌的混合液的小白鼠才死亡，这是一部分 R 型菌转化产生有毒的、有荚膜的 S 型菌所致，并且它们的后代都是有毒、有荚膜的。由此说明 RNA、蛋白质和荚膜多糖均不引起转化，而 DNA 却能引起转化。 如上图所示，为了证实引起转化的确实是 DNA 而非未除尽的蛋白质等，Avery 等人还做了一

7、组在 DNA 中加入 DNA 酶 (DNase) 的对照组，DNA 酶可以降解 DNA 而对蛋白质等无效，该组实验中的 DNA 被降解掉了，却没有引起 R 型菌转化出 S 型细菌而杀死小鼠，说明即使残留有蛋白质等物质也不能引 起 R 型细菌向 S 型细菌的转化，反证了发生遗传物质转化重组事件的是 DNA 而不是蛋白质。这一实验的结果是无可辩驳的，但是由于当时对核酸的认识有限且蛋白质遗传说的主流观点的影响，人们依然认为是 Avery 的实验中 DNA 未能完全提纯或 DNA 仅是辅助多糖形成荚膜的次要因素而非遗传物质。 二、T2 噬菌体感染实验 1952 年赫尔希 (Hershey) 和他的学生

8、蔡斯 (Chase) 利用 T2 噬菌体感染大肠杆菌进一步证实了 DNA 而不是蛋白质是遗传物质。T2 噬菌体侵染细菌的方式是将其遗传物质注入受害细菌细胞并利用细菌的染色体材料复制和表达自身的基因和蛋白，噬菌体的基本架构就是蛋白质的衣壳加核酸物质。其核酸是 DNA 。DNA 有大量磷酸基团而蛋白质中的胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸都是含硫氨基酸。分别以放射性同位素 32P 标记 DNA、35S 标记蛋白质，分别感染大肠杆菌，十分钟后用搅拌器 (waring blender) 捣碎细胞并离心，受感染的大肠杆菌细胞会沉降在离心管底部而噬菌体的残余物质在上清液中。通过对再次离心物的沉淀和上清的测试，在 3

9、2P 标记过的 T2 噬菌体感染的大肠杆菌的离心管的沉淀中检测到了放射性，说明是 T2 噬菌体的 DNA 进入到了大肠杆菌细胞里。而用 35S 标记过的 T2 噬菌体感染过的大肠杆菌的离心管则在上清液中检测到了放射性，说明 T2 噬菌体蛋白质并未进入大肠杆菌细胞参与遗传，如下图。 该实验因为用到了厨房里的搅拌器 blender 捣碎细胞因而又被戏称为 blender 实验，Hershey 也因雄辩地证明了 DNA 是遗传的物质基础而于 1962 年获得了诺贝尔奖。 三、RNA 病毒重建实验 1956 年 A.Gierer 和 G.Schraman 发现烟草花叶病毒（tobacco mosaic

10、 virus,TMV），其遗传物质是 RNA 。 1957 年美国的 Heinz Fraenkel Conrat 和 B.Singre 用重建实验证实了这一结论。 烟草花叶病毒 (Typical tobacco mosaic virus,TMV) 的基本结构是螺旋状的 RNA 核心和包裹在外面的蛋白质亚基颗粒，整个病毒呈管状。 Heinz Fraenkel Conrat 和 B.Singre 用两种烟草花叶病毒 A 类和 B 类，以苯酚处理使蛋白质与核酸分离，用 B 类蛋白质包裹 A 类 RNA ，即重建混合了 A 类 RNA 和 B 类蛋白质的病毒。用此病毒感染烟草后在烟草叶上出现的是 A

11、类病斑，取该混合病毒培养后新的病毒仍由 A 类蛋白包裹，说明决定病毒性状的是 A 类病毒的 RNA ，在下一代病毒中又由 A 类病毒 RNA 产生 A 类病毒的蛋白质。 另一组 B 类病毒包裹 A 类蛋白的实验取得同样结果。 RNA 病毒重建实验又一次有力地证明了遗传物质是核酸而不是蛋白质。 讲座二 核酸遗传的机制 ( 问题 how) 核酸是遗传的物质基础的问题 ( 问题 why) 解决后，人们又关注的目光投放到了其作用的机制的问题上。 DNA 复制后遗传信息被拷贝，随细胞分裂而分配到子细胞中，使得子细胞都具有母细胞相同的基因。首先要清楚的就 DNA 在复制时半保留模型（semioconser

12、vetive model）全保留复制模型 (conservative model) 和分散模型 (Dispersive model) 三种猜想的验证。经典的实验有 Meselson-Stahl 实验、Taylar 实验、姐妹染色单体差别染色方法 （sister-chromatid differential staining）、5 溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine ，简称 BUdR）及斑色染色体 （Harlequin chromosome）、Cairns 复制模型 - 型复制等，这里就不展开叙述。在研究 DNA 在复制时 半保留时，并不需要严格控制 DNA 复制时是子一代还

13、是子二代，因为在 CsCl 密度梯度离心时不论复制进行到第几代，在离心管上总是 14 N、14 N/ 15 N 和 15 N 这三条带， ( 如下图 ) 足以说明半保留复制的情况。如果要控制复制代数的话，在以前的条件下可以通过观察电镜下放射自显影的图像来分析控制，或用现代的 PCR 技术通过控制循环次数进行控制。 由 DNA 保存的遗传信息通过 mRNA 指导蛋白质的合成的过程由 1957 年 Crick 总结为中心法测 (central dogma) 1970 Crick 又作了部分修改： 在生物的遗传信息流中，mRNA、rRNA 和 tRNA 都是由 DNA 指导合成的，即转录。DNA 上

14、负责 RNA 合成的基因常常聚集在一起，转录成一条 RNA 链，再分别剪切成不同类别的 RNA 。在由 mRNA 转录自 DNA 的遗传密码指导合成相应的蛋白质的过程中，需要有不同的辅助因子 (factor) 的帮助，翻译的过程可以人为地分为起始、延伸和终止三个过程。在原核生物中，以大肠杆菌为例，存在着三种辅助因子 (IF-1、IF-2 和 IF-3) ，它们帮助翻译启动的大致过程和作用分别为： (1) IF-3 和核糖体 30S rRNA 结合，使 16S RNA 上的反 S-D 序列和 mRNA 的 S-D 序列结合 a. 使 30S 保持游离 b. 形成起始复合体 I (2) IF-2

15、+ GTP + 氨酰甲硫氨酸 中间复合体 复合体 II (3) IF-1 置换出 IF-3, 50S 亚基可和 30S 亚基结合。 (4) 50S+30S 复合体 III ，释放 IF-1,IF-2 。 在延伸阶段即蛋白质多肽链合成的过程中，有三种延伸因子 (EF-Tu、 EF-Ts 和 EF-G) ，其中 EF-Tu 能够帮助携带氨基酸残基的 tRNA 进入到核糖体的 A 位点与 mRNA 的密码子相互配对，其中消耗一分子 GTP 的能量并失去活性，而 EF-Ts 则帮助失去活性 EF-Tu 将 GDP 置换为 GTP ，重新获得活性去带动下一下 tRNA 。 EF-G 则可将完成转肽的 A

16、 位点上的 tRNA 由 A 位点推至 P 位点，P 位点上空载的 tRNA 进入 E 位点随后脱离核糖体去结合下一个氨基酸残基。 在翻译的终止阶段有三种释放因子 (RF-1、RF-2 和 RF-3) ，RF-1 能识别终止密码子 UAG 和 UAA ，RF-2 识别 UGA 和 UAA ，属类释放因子，可竞争性地与 mRNA 上的终止密码子结合而使翻译过程中断， RF-3 属类释放因子，可解离核糖体，使整个翻译复合体瓦解而终止翻译。 真核生物中参与翻译的辅助因子与原核生物不尽相同，数量和种类相对较多也较复杂，但基本功能与原核生物大体相当。 能够编码蛋白质的基因称为结构基因，并不是所有的基因都

17、能够编码蛋白质如编码 RNA 的基因和真核生物染色体中的内含子，还有一些基因没有编码功能，但是可以控制其他基因的表达，所以一个完整的基因是由调控基因和结构基因组成。一个单倍体细胞中所有遗传物质，包括细胞核内的 DNA 和各种细胞器中的 DNA 的总合称之为该生物的基因组。 基因组学研究的范围包括对基因表达的研究、蛋白质功能的研究和蛋白质间相互作用的研究，其研究内容可总结为以全基因组测序为目标的结构基因组学 (structural genomics) 和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学 (functional genomics) 。结构基因组学通过构建遗传图谱、物理图谱、转录图谱达到对染色体的

18、深入认识；功能基因组学则通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。人类基因组计划 (human genome project;HGP) 的设想在 1985 年由美国科学家率先提出，1990 年正式启动，2000 年 6 月 26 日 中、美、日、德、法、英 6 国共同发表人类基因组第一张草图，2001 年 1 月 12 日 6 国科学家和美国塞莱拉公司分别在 Science 和 Nature 杂志上公布了人类基因组图谱和初步分析结果。宣布全部人类基因组约有 2.91Gbp ，约有 3.9 万多个基因。2004 年

19、 10 月国际人类基因组计划合作组织在 Nature 杂志公布误差小于 10 万分之 1 的人类基因组完成图己绘制完毕，将原来 15 万个“缺隙”减少到 341 个，完成图显示，人类基因组只含有 2 2.5 万个基因，少于原来的估计。 讲座三 基因工程技术 七十年代末年国内曾闹过长牛皮的西红柿的笑话，但是随着对基因及及作用机理研究的深入，我们基因及其对生命的形式和形态的控制机制了解渐多，运用技术手段进行研究和应用已经成为可能，这就诞生了基因工程技术。基因工程技术是利用生物 ( 动物、植物或微生物 ) 或其产物来生产对人类生命科学有用的物质甚至是生物本身，它以生物化学和分子生物学的操作方法，改变

20、生物或其分子的遗传形式，以达到预期目的。其中对基因的操作主要是 利用 DNA 体外重组或 PCR 扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组 DNA 分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程。 基因工程技术的基本模式可以总结如下： 大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统。大肠杆菌遗传背景清楚,容易培养,能大规模发酵,以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体,使之成为人们克隆和表达外源基因的首选菌株。但实际上许多外源蛋白特别是真核基因在大肠杆菌内表达时,往往不能自发折叠生成有一定空间结构和特定生物

21、功能的蛋白质,而是以一种不可溶的沉淀即包涵体的形式存在于胞内。虽然以包涵体形式表达具有易于纯化、表达产物较稳定等优点,但位于包涵体中的重组蛋白没有生物活性,进一步的包涵体体外复性产率低。包涵体的形成某种程度上限制了大肠杆菌表达系统的应用,主要的障碍在于真核基因与原核基因在结构上存在巨大差异，原核细胞无法识别真核基因的内含子和外显子；它们的转录信号也不相同；真核 mRNA 的分子构造也有别于原核，无法在原核细胞内稳定存在；原核细胞也不具备真核生物后翻译加工体系，无法正确折叠和组装成正确的蛋白质结构；原核细胞的蛋白酶有可能会把新生成的真核蛋白当做外来异物降解掉。但是大肠杆菌仍具有其他表达体系无法比

22、拟的优势，人们 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；经过多年实践证明它 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；从工业生产和经济的角度看，大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。一些真核蛋白如人胰岛素可以通过选用适当的酶切位点，重组成可以在大肠杆菌中表达的重组质粒，以 IPTG 诱导，以非融合、可溶性表达的方式在大肠杆菌中大批量生产人胰岛素。对于真核基因中的内含子，可采用以先在真核体系中剪切加工中的成熟 mRNA 逆转录成 cDNA ，再构建重组子置入原核表达

23、系统中表达的策略加以解决。 在基因在染色体上的定位中，可利用荧光原位杂交技术 (Fluorescence insite hybridization ， FISH) 利用荧光标记的 DNA 或 RNA 分子,根据 DNA - DNA 和 DNA - RNA 碱基的配对原则与染色体上相对应的序列,先用 DNA 标记物 ( 如生物素、地高辛 ) 标记探针,然后制备其荧光抗体,待探针与标本杂交后,再用抗体进行反应,根据荧光信号所在的部位以确定目的 DNA 的位置。荧光原位杂交的操作步骤可概括为 (1) 制备染色体；(2) 标记探针；(3) 将探针与实验材料的靶序列进行杂交；(4) 检测杂交的结果。 基

24、于 RFLP 基础上的 DNA 指纹技术在基因工程、遗传学研究、工业、农林、法医和医学等方面有着广泛的应用，其基本操作步骤是：将待检生物样品的 DNA 提取，PCR 或扩增片段长度多态性 (AFLP) 扩增后用电泳等方法检测分子质量，检测其降解情况，如果能够降解，用与探针配对的限制性内切酶酶切，电泳后通过 Southern blot 转膜，将放射性同位素标记的探针与膜上的 DNA 样本杂交，得到的放射自显影图谱即为 DNA 指纹图谱。 DNA 分子杂交技术鉴定生物的亲缘关系是利用 DNA 分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，通过不同来源的 DNA 分子间碱基互补配对的重合度来判断其生

25、物学上的亲疏。两种生物的 DNA 单链之间互补程度越高，通过分子杂交形成双螺旋片段的程度也就越高，二者的亲缘关系就越近；反之，亲缘关系就越远。早期曾使用放射性同位素标记其中的一条单链，通过对杂交 DNA 放射性的定量检测判定两条 DNA 链的重合程度或通过检测固定 DNA 与洗脱液中放射性物质的量比来加以判断。由于放射性同位素具有一定的危险性，后来采取了一些非同位素的方法，如双链 DNA 变性后的增色效应，即双链 DNA 开链后对 260nm 范围的紫外吸收值 (OD 值 ) 增加，通过两种生物的双链 DNA 的 OD 值与杂交双链 DNA 的 OD 值的比较来判断两条 DNA 的重合度。还可以通过双链 DNA 的熵变与焓变来判定两条 DNA 链的重合度，即两条链的碱基配对越吻合，打开双链所需能量越大，现在我们还可以用计算机模拟的方法，如果知道两种生物的 DNA 序列，直接计算出打开双链所需的能量。 DNA 测序仪的工作原理仍是基于 Sanger 的双脱氧中止法，Sanger 法测序的原理是利用一种 DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有