现代生物技术在发酵中的应用

1、现代生物技术在发酵中的应用 （biotechnology）又称生物工程或生物工艺学等。它是近代发展非常迅速的一门综合性又称生物工程或生物工艺学等。它是近代发展非常迅速的一门综合性科学技术，涉及许多科学领域。但从发展过程来看，它也是建立在微生物发酵工程的基础上，吸收新科学技术，涉及许多科学领域。但从发展过程来看，它也是建立在微生物发酵工程的基础上，吸收新发展起来的基因工程、细胞融合和固定化菌（酶）等新技术，形成今日的生物技术。发展起来的基因工程、细胞融合和固定化菌（酶）等新技术，形成今日的生物技术。 生物技术是应用生物科学的理论、方法以和技术，按照人们设计的蓝图，改良和加工生物或生物技术是应用生

2、物科学的理论、方法以和技术，按照人们设计的蓝图，改良和加工生物或用生物及其制备物作为加工原料，提供所需的生物制品，为人类服务的综合性科学技术。它涉及许多用生物及其制备物作为加工原料，提供所需的生物制品，为人类服务的综合性科学技术。它涉及许多基础学科和工程学科，也是上述新技术的具体开发和应用。它不仅是一门综合性的技术。它涉及许多基础学科和工程学科，也是上述新技术的具体开发和应用。它不仅是一门综合性的技术。它涉及许多基础学科和工程学科，也是述新技术的具体开发和应用。它不仅反映着当代生物科学中最新科研成果基础学科和工程学科，也是述新技术的具体开发和应用。它不仅反映着当代生物科学中最新科研成果，也不断

3、赋工程科学以新的生命。它不仅是一门综合性的技术，也是一个知识密集的新产业，应用领，也不断赋工程科学以新的生命。它不仅是一门综合性的技术，也是一个知识密集的新产业，应用领域很宽，包括农业、食品工业、化工、药品制造、发酵工业、能源和社会服务等。域很宽，包括农业、食品工业、化工、药品制造、发酵工业、能源和社会服务等。 生物技术的内容大致分为两个方面：直接型生物细胞的利用技术和模拟型生物细胞的生物技术的内容大致分为两个方面：直接型生物细胞的利用技术和模拟型生物细胞的利用技术。以现代前沿技术来说，一般认为有四方面：即基因操作技术；细胞融合技术；利用技术。以现代前沿技术来说，一般认为有四方面：即基因操作技

4、术；细胞融合技术；细胞大量培养技术和生物反应器技术。可概括为基因工程，细胞工程，发酵工程和酶工程细胞大量培养技术和生物反应器技术。可概括为基因工程，细胞工程，发酵工程和酶工程，与生化工程关系也很密切，也可并入，构成五大工程。，与生化工程关系也很密切，也可并入，构成五大工程。 生物技术的应用，已经取得相当大的成果，特别是在医药方面，已经开发展出了生物技术的应用，已经取得相当大的成果，特别是在医药方面，已经开发展出了不少的新药，见表不少的新药，见表1 1。 生物技术中，当前人们最感兴趣的是基因工程和细胞工程，它们是生物技术的主导领域，也是热生物技术中，当前人们最感兴趣的是基因工程和细胞工程，它们是

5、生物技术的主导领域，也是热点。形成独特产业的发酵工程和酶工程等也是生物技术中的重要组成部分。这几方面的内容是相互联点。形成独特产业的发酵工程和酶工程等也是生物技术中的重要组成部分。这几方面的内容是相互联系和互相促进的。基因工程和细胞工程常常是发酵工程和酶工程的基础，所以现代发酵工程包括整个系和互相促进的。基因工程和细胞工程常常是发酵工程和酶工程的基础，所以现代发酵工程包括整个生物工艺过程。作为发酵工业来说，除了传统的利用天然微生物发酵生产初级代谢产物和次级代谢产生物工艺过程。作为发酵工业来说，除了传统的利用天然微生物发酵生产初级代谢产物和次级代谢产物外，由于生物技术的出现，发酵工业所涉及的范围

6、得到扩大，生产技术得到改造，因而发酵生产能物外，由于生物技术的出现，发酵工业所涉及的范围得到扩大，生产技术得到改造，因而发酵生产能力和控制水平大为提高。力和控制水平大为提高。 DNADNA重组技术获得的部分药品重组技术获得的部分药品 药物名称药物名称 适应性适应性 胰岛素胰岛素 糖尿病糖尿病 生长激素生长激素 侏儒症侏儒症 血清白蛋白血清白蛋白 外科外科 休克休克 烧伤烧伤 蛋白因子蛋白因子 血友病血友病 尿激酶尿激酶 心脏病发作、中风心脏病发作、中风 组织血纤维蛋白溶酶原活化剂组织血纤维蛋白溶酶原活化剂 血栓症血栓症 干扰素干扰素 癌症癌症 病毒感染病毒感染 淋巴激活素淋巴激活素 癌症癌症

7、自动免疫病自动免疫病 感染感染 白细胞介素白细胞介素 是一种淋巴因子具多种功能是一种淋巴因子具多种功能 肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子 (TNF) 抗李斯特菌致死攻击、血管生成等抗李斯特菌致死攻击、血管生成等 心钠素心钠素 （ANP） 具有强利尿、扩张血管和降压作用等具有强利尿、扩张血管和降压作用等 像基因工程所获得的工程菌一样，许多哺乳动物的基因克隆在大肠杆菌等宿主中像基因工程所获得的工程菌一样，许多哺乳动物的基因克隆在大肠杆菌等宿主中能够得到表达等等。使用小鼠体内法生产单克隆抗体，产品常含有毒性杂质和不易大能够得到表达等等。使用小鼠体内法生产单克隆抗体，产品常含有毒性杂质和不易大量生产等缺点，目

8、前也采用同微生物发酵一样的发酵罐的生物反应器来进行催化反应量生产等缺点，目前也采用同微生物发酵一样的发酵罐的生物反应器来进行催化反应，获得所需的产物。酶工程中的固定化细胞（或酶）也可用类似发酵罐的生物反应器，获得所需的产物。酶工程中的固定化细胞（或酶）也可用类似发酵罐的生物反应器来进行催化反应，获得所需的产物。这些事实都说明它们之间的密切关系，也说明发来进行催化反应，获得所需的产物。这些事实都说明它们之间的密切关系，也说明发本酵（或类似发酵）技术在制得产品中的地位。另外，计算机技术用于发酵控制也已本酵（或类似发酵）技术在制得产品中的地位。另外，计算机技术用于发酵控制也已趋于广泛。趋于广泛。一一

9、. . 工程菌的发酵工程菌的发酵1. 1. 工程菌的来源和应用工程菌的来源和应用 基因工程是在生物体外对基因工程是在生物体外对DNADNA分子进行重新组合，然后克隆到适合的宿分子进行重新组合，然后克隆到适合的宿生细胞，进行增殖和表达的遗传操作。所得重组体菌株即是工程菌。获得它生细胞，进行增殖和表达的遗传操作。所得重组体菌株即是工程菌。获得它的基本过程如图。的基本过程如图。 基因工程的关键问题在于目的基因在宿主细胞中能否表达，即基因工程的关键问题在于目的基因在宿主细胞中能否表达，即DNADNA在宿在宿 主细胞中能否转录和翻译，表达形成的产物在胞内不被分解，并能分泌到胞主细胞中能否转录和翻译，表达

10、形成的产物在胞内不被分解，并能分泌到胞外。而基因表达过程是多层次的，因此影响基因表达的因素也是多方面的。外。而基因表达过程是多层次的，因此影响基因表达的因素也是多方面的。比较理想的、能够成为工业使用的基因工程菌应具备下列条件：比较理想的、能够成为工业使用的基因工程菌应具备下列条件：1 1）发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，当然也是分泌型菌株；）发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，当然也是分泌型菌株；2 2）菌株能利用常用的碳源（如糖蜜、淀粉等），并可进行连续培养；）菌株能利用常用的碳源（如糖蜜、淀粉等），并可进行连续培养；3 3）菌株是不致病的，也不产生内毒素；）菌株是不致病的，也不产生

11、内毒素；4 4）发酵所产生的热量和需氧量都较低，发酵温度也适当；）发酵所产生的热量和需氧量都较低，发酵温度也适当；5 5）代谢控制容易进行；）代谢控制容易进行；6 6）能进行适当的重组）能进行适当的重组DNADNA，并且稳定，重组的，并且稳定，重组的DNADNA不易丢失。不易丢失。 基因工程技术已趋于成熟，所得工程菌已得到应用，并已开发出不少产品投入市基因工程技术已趋于成熟，所得工程菌已得到应用，并已开发出不少产品投入市场如胰岛素、干扰素、生长激素和乙型肝炎疫苗等，还有几十种可能成为药物的产品场如胰岛素、干扰素、生长激素和乙型肝炎疫苗等，还有几十种可能成为药物的产品正在开发中。在氨基酸工程菌组

12、建上，也获得了成功，如高产的苏氨酸工程菌。在抗正在开发中。在氨基酸工程菌组建上，也获得了成功，如高产的苏氨酸工程菌。在抗生素生物合成上，在分析和分离生物合成基因结构特点和表达调节的基础上，已成功生素生物合成上，在分析和分离生物合成基因结构特点和表达调节的基础上，已成功地把基础因工程技术用于提高抗生素的产量上，如将头孢菌素生物合成的限制性扩环地把基础因工程技术用于提高抗生素的产量上，如将头孢菌素生物合成的限制性扩环酶基因克隆到产生菌中，使头孢菌素酶基因克隆到产生菌中，使头孢菌素C C的产量提高了的产量提高了15%15%。我国在基因工程研究开发上，也。我国在基因工程研究开发上，也取得了不少成就：已

13、获得青霉素酰化酶基因工程菌，并中试成功，达取得了不少成就：已获得青霉素酰化酶基因工程菌，并中试成功，达195u/ml195u/ml水平；利用工水平；利用工程菌也中试成功人程菌也中试成功人a a型干扰素等。型干扰素等。2 2、工程菌的培养、工程菌的培养（1 1）基因重组细胞的种类）基因重组细胞的种类 宿主细胞可以采用原核的大肠杆菌和枯草杆菌、真核细胞的酵母菌和哺乳动物细胞等。所以宿主细胞可以采用原核的大肠杆菌和枯草杆菌、真核细胞的酵母菌和哺乳动物细胞等。所以，生产基因重组产物就有不同的菌体或细胞。但当前生产上使用多的仍以大肠杆菌为主，因为在大肠，生产基因重组产物就有不同的菌体或细胞。但当前生产上

14、使用多的仍以大肠杆菌为主，因为在大肠杆菌中，多种哺乳动物和其他微生物的蛋白基因能够得到高效表达，产物能得到过量生产、产量可达杆菌中，多种哺乳动物和其他微生物的蛋白基因能够得到高效表达，产物能得到过量生产、产量可达大肠杆菌菌体总蛋白的大肠杆菌菌体总蛋白的50%50%（如人胰岛素）。这就为生产多种蛋白药物（如白细胞介素（如人胰岛素）。这就为生产多种蛋白药物（如白细胞介素-2-2，人生长，人生长激素、干扰素等），提供了基础。但大肠杆菌不具备分泌系统，产生的产物以包含体（激素、干扰素等），提供了基础。但大肠杆菌不具备分泌系统，产生的产物以包含体（inclusion bodyinclusion body

15、）形式存在于细胞质中，这给分离纯化造成了困难。因此，人们才研究能）形式存在于细胞质中，这给分离纯化造成了困难。因此，人们才研究能分泌蛋白的酵母系统和枯草杆菌系统分泌蛋白的酵母系统和枯草杆菌系统（2 2）工程菌的培养）工程菌的培养 工程菌的培养与普通微生物的好气培养无大差异，但有其特点。从培养工程来看，其主工程菌的培养与普通微生物的好气培养无大差异，但有其特点。从培养工程来看，其主要因素有：营养源（碳源、氮源、氨基酸、溶解氧等）浓度的控制和有毒代谢产物的排除。在要因素有：营养源（碳源、氮源、氨基酸、溶解氧等）浓度的控制和有毒代谢产物的排除。在生物学上还应考虑：质粒的稳定性、质粒拷贝数的控制、转录

16、效率的提高与控制、翻译效率的生物学上还应考虑：质粒的稳定性、质粒拷贝数的控制、转录效率的提高与控制、翻译效率的提高以及菌体向外分泌产物等因素。因此，工程菌的开发研究仍须重视培养技术，才能获得大提高以及菌体向外分泌产物等因素。因此，工程菌的开发研究仍须重视培养技术，才能获得大量产物。量产物。 培养装置培养装置 在进行以工业化为目的在进行以工业化为目的DNADNA重组实验，以及为生产异种基因产物而培养重组菌，应采用重组实验，以及为生产异种基因产物而培养重组菌，应采用简便易行的培养系统。以大肠杆菌为主的宿生的培养多使用一般的通气搅拌罐。基因重组动物简便易行的培养系统。以大肠杆菌为主的宿生的培养多使用

17、一般的通气搅拌罐。基因重组动物细胞的培养，实际上与过去动物细胞培养一样，所用的培养装置和措施与微生物培养并不相同细胞的培养，实际上与过去动物细胞培养一样，所用的培养装置和措施与微生物培养并不相同。 工程菌的基础实验仍使用常规的培养皿、试管、玻璃瓶等培养器。实验者应按实验准则工程菌的基础实验仍使用常规的培养皿、试管、玻璃瓶等培养器。实验者应按实验准则的要求，谨慎进行操作，应使用移液抢处理重组体，操作应在安全柜（或室）中进行，目前已的要求，谨慎进行操作，应使用移液抢处理重组体，操作应在安全柜（或室）中进行，目前已有规定的细则，以防止工程菌外漏和扩散。有规定的细则，以防止工程菌外漏和扩散。 中间试验

18、或大量提纯产物时，必须进行重复性好的稳定培养。要取得大量培养液或培养中间试验或大量提纯产物时，必须进行重复性好的稳定培养。要取得大量培养液或培养数据，要用带各种传感器的培养罐，以测定和控制数据，要用带各种传感器的培养罐，以测定和控制pHpH值、溶解氧、底物浓度等参数。许多培养数值、溶解氧、底物浓度等参数。许多培养数据还可通过联机取得，或经自动分析记录下来，这样自动化系统能有效地减少实险操作者与基因重组据还可通过联机取得，或经自动分析记录下来，这样自动化系统能有效地减少实险操作者与基因重组体的接触机会。密闭型通气搅拌培养罐按采用高压蒸气灭菌。工程菌的培养装置既要防止外界微生物体的接触机会。密闭型

19、通气搅拌培养罐按采用高压蒸气灭菌。工程菌的培养装置既要防止外界微生物侵入罐内，污染杂菌，又必须不使重组体外漏。这是与沿用的通气搅拌式培养罐的区别所在。侵入罐内，污染杂菌，又必须不使重组体外漏。这是与沿用的通气搅拌式培养罐的区别所在。 培养基和高密度发酵培养基和高密度发酵 微生物生产的蛋白质类产物，常是一种粗品，因此可以使用各种复杂培养基。但工程菌的产物微生物生产的蛋白质类产物，常是一种粗品，因此可以使用各种复杂培养基。但工程菌的产物多属于人或畜体内蛋白质，需要有很高的纯度，否则，不能在体内使用，所以，发酵生产须要有严格多属于人或畜体内蛋白质，需要有很高的纯度，否则，不能在体内使用，所以，发酵生

20、产须要有严格的要求。工程菌发酵有两条基本要求，首先是要使菌体生长良好，获得高浓度菌体（即高密度发酵）的要求。工程菌发酵有两条基本要求，首先是要使菌体生长良好，获得高浓度菌体（即高密度发酵），这样才能得到最多的产物；其次是发酵所用培养基的成分必须保持尽可能的简单，以便分离产物。，这样才能得到最多的产物；其次是发酵所用培养基的成分必须保持尽可能的简单，以便分离产物。 据报道，培养大肠杆菌最高可得干重菌体据报道，培养大肠杆菌最高可得干重菌体125g/L125g/L，酿酒酵母可得，酿酒酵母可得145 g/L145 g/L。枯草杆菌大。枯草杆菌大概可得干菌体概可得干菌体20-40 g/L20-40 g/

21、L。这些数值还不是工程菌培养的结果。我国对人。这些数值还不是工程菌培养的结果。我国对人a a1 1型干扰素工程菌（大型干扰素工程菌（大肠杆菌肠杆菌K K1212系系BMH71-18BMH71-18株），进行高密度发酵，得到株），进行高密度发酵，得到100.25 g/L100.25 g/L的菌体。这与培养非工程菌的菌的菌体。这与培养非工程菌的菌量相接近。量相接近。 大肠杆菌、其他细菌和酵母菌在合成培养中都能良好地生长。工程菌发酵所使用大肠杆菌、其他细菌和酵母菌在合成培养中都能良好地生长。工程菌发酵所使用的培养基也是合成培养基，包括葡萄糖、铵盐和无机盐等。其组成必须满足获得高浓的培养基也是合成培养

22、基，包括葡萄糖、铵盐和无机盐等。其组成必须满足获得高浓度菌体的要求，发酵中间过程还必须补加碳源和氮源，也用氨水来调节控制发酵度菌体的要求，发酵中间过程还必须补加碳源和氮源，也用氨水来调节控制发酵pHpH。其他的培养条件，如搅拌转速（与剪切力有关）、溶解氧、培养温度、培养其他的培养条件，如搅拌转速（与剪切力有关）、溶解氧、培养温度、培养pHpH、接种龄和、接种龄和接种量等条件，对菌体生长和产物产量都有影响。接种量等条件，对菌体生长和产物产量都有影响。 从安全性来考虑菌体营养源的问题，培养工程菌的外界条件至少要遵守物理密封（从安全性来考虑菌体营养源的问题，培养工程菌的外界条件至少要遵守物理密封（P

23、 P1 1P P4 4）方法中的）方法中的P P1 1级规定。从生物安全性来考虑，常采用维生素或氨基酸营养缺陷型的工程菌级规定。从生物安全性来考虑，常采用维生素或氨基酸营养缺陷型的工程菌。维生素缺陷型仅需极少量维生素，过量也无影响。在培养氨基酸缺陷型菌株达到高浓度菌体。维生素缺陷型仅需极少量维生素，过量也无影响。在培养氨基酸缺陷型菌株达到高浓度菌体之前，培养一开始就要加入必需量的氨基酸，这样就会因过量氨基酸而抑制菌的生长。为此，之前，培养一开始就要加入必需量的氨基酸，这样就会因过量氨基酸而抑制菌的生长。为此，可采用调节可采用调节pHpH的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法，使整个培养期间葡萄糖

24、和氨基酸的浓的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法，使整个培养期间葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，培养大肠杆菌度几乎保持恒定，培养大肠杆菌C600C600菌株时获得菌株时获得60 g/L60 g/L干菌体。菌体对葡萄糖及氨基酸的收干菌体。菌体对葡萄糖及氨基酸的收得率因培养条件不同而不同。以葡萄糖、苏氨酸、亮氨酸、组氨酸、色氨酸为营养源时，平均得率因培养条件不同而不同。以葡萄糖、苏氨酸、亮氨酸、组氨酸、色氨酸为营养源时，平均每克所得菌体量（干重）分别为每克所得菌体量（干重）分别为0.30.3、2.52.5、1515、4040、40g40g。以获得。以获得1g1g菌体所需要营养源的价菌体所需要营养

25、源的价格进行比较，苏氨酸的费用最高，因此要避免用苏氨酸缺陷型作基因重组用的宿主菌格进行比较，苏氨酸的费用最高，因此要避免用苏氨酸缺陷型作基因重组用的宿主菌，最好使用维生素缺陷型菌株。，最好使用维生素缺陷型菌株。 菌株和质粒的稳定性菌株和质粒的稳定性 在工业发酵运行中，菌株必须具有很好的稳定性。对工程菌发酵来说，细胞中的质在工业发酵运行中，菌株必须具有很好的稳定性。对工程菌发酵来说，细胞中的质粒稳定性和质粒内在稳定性同样重要。质粒保存率高，相应地就会得到高浓度的产物。在粒稳定性和质粒内在稳定性同样重要。质粒保存率高，相应地就会得到高浓度的产物。在进行摇瓶试验时，因菌体浓度低，无须考虑质粒稳定性的

26、问题，但在研究工业化生产时，进行摇瓶试验时，因菌体浓度低，无须考虑质粒稳定性的问题，但在研究工业化生产时，这是一个极为重要的课题。在含有抗生素抗性标记相应的培养基中进行培养，保持选择压这是一个极为重要的课题。在含有抗生素抗性标记相应的培养基中进行培养，保持选择压力。力。 有关质粒保持和稳定性的遗传和环境的影响因素，研究的比较多。有人报道，大肠杆有关质粒保持和稳定性的遗传和环境的影响因素，研究的比较多。有人报道，大肠杆菌菌RRIRRI中的中的pBR322pBR322质粒可以维持约质粒可以维持约6060代。以这样稳定的细胞，代。以这样稳定的细胞，1 1个细胞可以分裂足够多的次数个细胞可以分裂足够多

27、的次数，产生细胞密度为，产生细胞密度为10g/L10g/L的培养液达的培养液达11500L11500L。在。在2424（或少于（或少于2424）小时，就能产生出象胰岛素、）小时，就能产生出象胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质。因此就不需要利用抗生素耐药性来保持稳定性，而且另外的方法，如调生长激素、干扰素等蛋白质。因此就不需要利用抗生素耐药性来保持稳定性，而且另外的方法，如调节温度，使得在相当短的时间内，得到很高水平的基因表达。节温度，使得在相当短的时间内，得到很高水平的基因表达。3.3.安全问题安全问题(1)(1)重组重组DNADNA实验准则实验准则 19741974年，提出了年，提出了DNAD

28、NA重组实验具有潜在生物危险的问题。后来就制订了在实重组实验具有潜在生物危险的问题。后来就制订了在实验室中构建工程菌及使用工程菌的实验应遵循的准则，以保证实验的安全和推动重组验室中构建工程菌及使用工程菌的实验应遵循的准则，以保证实验的安全和推动重组DNADNA的研的研究。这些准则是采用物理密封（究。这些准则是采用物理密封（P P1 1P P4 4）和生物学密封（）和生物学密封（B B1 1B B2 2）两种方法。）两种方法。 物理密封物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L20L以下时

29、，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项所组成。密封程度分以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项所组成。密封程度分为为P P1 1、P P2 2、P P3 3和和P P4 4级，数字越大，密封水平越高。级，数字越大，密封水平越高。生物学密封生物学密封要求用只有在特殊培养条件要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。，可以防止重组菌向外扩散。 企业中进行重组菌培养的设备标准有企业中进行重组菌培养的设备标准有LS-1

30、LS-1和和LS-2LS-2。 LS-2LS-2相当严格，工相当严格，工业生产应在业生产应在LS-1LS-1的设备标准下培养。的设备标准下培养。LS-1LS-1标准要点是：标准要点是：使用防止重组体外漏、能在密闭状态下进行内部灭菌和培养装置；使用防止重组体外漏、能在密闭状态下进行内部灭菌和培养装置；培养装置的排气由除菌器排出；培养装置的排气由除菌器排出；使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。 设计用于基因重组菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂菌侵入，还要防止设计用于基因重组菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂菌侵入，还要防止重组菌

31、的外漏。此外，培养后的菌体分离、破碎等处理也必须在安全柜内进重组菌的外漏。此外，培养后的菌体分离、破碎等处理也必须在安全柜内进行，或是采用密闭型的设备。行，或是采用密闭型的设备。(2) (2) 防止基因重组菌外漏的措施防止基因重组菌外漏的措施 在普通通气搅拌培养罐培养菌体时，可能发生外漏的部分和操作有：在普通通气搅拌培养罐培养菌体时，可能发生外漏的部分和操作有：A A 排气；排气；b b 机械密封；机械密封；c c 取样；取样；d d 培养后的灭菌；培养后的灭菌；e e 接种；接种；f f 放罐。这些部放罐。这些部分和操作均应采取一些措施，以防止重组菌外漏。分和操作均应采取一些措施，以防止重组

32、菌外漏。 有关负压洁净室级别分类技术标准和有关负压洁净室级别分类技术标准和 P1P1P4 P4 级实验室适用工况范围见级实验室适用工况范围见下页表。下页表。负压洁净室级别分类技术标准负压洁净室级别分类技术标准级别级别 工作特点工作特点 P1 1.通常用微生物实验室通常用微生物实验室 若干低等真核生物及原生动物、磁菌体若干低等真核生物及原生动物、磁菌体 2.可用嘴操作吸管可用嘴操作吸管 3.对外人进入不限制对外人进入不限制 4.可在开放性实验台上进行实验可在开放性实验台上进行实验 P2 1.禁止外人进入实验区域禁止外人进入实验区域 无脊椎动物及植物、变温脊椎动物无脊椎动物及植物、变温脊椎动物 2

33、.可能发生气溶胶的实验在可能发生气溶胶的实验在II级生物学安全柜级生物学安全柜 的生殖细胞和胚胎的生殖细胞和胚胎 3.禁止用嘴操作吸管禁止用嘴操作吸管 4.室内设高压消互毒柜室内设高压消互毒柜,对废弃物先灭菌再排放对废弃物先灭菌再排放 P3 1由双重门，气闸和外部隔离开实验区域由双重门，气闸和外部隔离开实验区域 变温脊椎动物，无脊椎动物的病毒变温脊椎动物，无脊椎动物的病毒 2非本区人员禁止入内非本区人员禁止入内 植物病毒灵长类以外的哺乳类及鸟类植物病毒灵长类以外的哺乳类及鸟类 3平时送外部空气送入室内，室内排气经平时送外部空气送入室内，室内排气经HEPA 滤后排放室外滤后排放室外 4在在II级

34、生物学安全柜内进行实验级生物学安全柜内进行实验 5实验人员工作服为室内专用，先灭菌后，再拿实验人员工作服为室内专用，先灭菌后，再拿 到外面去洗涤到外面去洗涤 P4 1采用独立建筑物由隔离区与外部隔断采用独立建筑物由隔离区与外部隔断 2根据相应隔离等级，保持室内负压根据相应隔离等级，保持室内负压 3在密闭型生物学安全柜（在密闭型生物学安全柜（GBL II级）内做实验级）内做实验 4非本区人员禁止入内非本区人员禁止入内 5取出器材，废弃物先经双门高压消毒柜灭菌消取出器材，废弃物先经双门高压消毒柜灭菌消 毒后，再取出，排出废液也要先灭菌后再排放毒后，再取出，排出废液也要先灭菌后再排放 6实验入口处设

35、置国际生物学危险标志实验入口处设置国际生物学危险标志 灵长类的癌及致癌性研究灵长类的癌及致癌性研究 如何提高高产菌的稳定性？如何提高高产菌的稳定性？ （1 1）首先在菌种选育中应把菌株产量分布中的稳度作为评价菌株的条件之一。不仅以产）首先在菌种选育中应把菌株产量分布中的稳度作为评价菌株的条件之一。不仅以产量高低为基准；量高低为基准；（2 2）菌株选育中避免使用含有多核的包子和菌丝片断；）菌株选育中避免使用含有多核的包子和菌丝片断；（3 3）用单倍化试剂处理高产菌株，有提高菌株稳定性的作用；）用单倍化试剂处理高产菌株，有提高菌株稳定性的作用；（4 4）在培养基中加入某些金属离子可增加菌株的稳定性

36、；）在培养基中加入某些金属离子可增加菌株的稳定性；（5 5）利用营养缺陷型和原养型在生理和抗性上的不同，在发酵培养基中加入抗生素）利用营养缺陷型和原养型在生理和抗性上的不同，在发酵培养基中加入抗生素也会有防止回复突变发生的效果；也会有防止回复突变发生的效果；（6 6）在生产过程中应尽力减少菌种传代次数，这是发酵工业中普遍遵循的原则；）在生产过程中应尽力减少菌种传代次数，这是发酵工业中普遍遵循的原则；（7 7）杂菌污染、发酵条件改变都能引起发酵生产产量波动，应注意区分原因）杂菌污染、发酵条件改变都能引起发酵生产产量波动，应注意区分原因。提高次级代谢产物产量的方法？提高次级代谢产物产量的方法？ 答

37、：答：1 1）补加前体类似物；）补加前体类似物； 2 2）加入诱导物；）加入诱导物； 3 3）防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生；）防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生； 4 4）防止氮代谢阻遏的发生；）防止氮代谢阻遏的发生； 5 5）筛选耐前体或前体类似物的突变株；）筛选耐前体或前体类似物的突变株； 6 6）筛选抗抗生素突变株；）筛选抗抗生素突变株； 7 7）筛选营养缺陷型的回复突变株；）筛选营养缺陷型的回复突变株； 8 8）抗毒性突变株的选育。）抗毒性突变株的选育。试述提高初级代谢产物产量的方法？试述提高初级代谢产物产量的方法？ 1)1)使用诱导物；使用诱导物；2)2)除去诱导物除去诱导物-选育组成

38、型产生菌；选育组成型产生菌；3)3)降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生；降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生；4)4)解除分解代谢阻遏解除分解代谢阻遏-筛选抗分解代谢阻遏突变株；筛选抗分解代谢阻遏突变株；5)5)解除反馈抑制解除反馈抑制-筛选抗反馈抑制突变株；筛选抗反馈抑制突变株；6)6)防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株；防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株；7)7)改变细胞膜的通透性；改变细胞膜的通透性；8)8)筛选抗生素抗性突变株；筛选抗生素抗性突变株；9)9)选育条件抗性突变株；选育条件抗性突变株；10) 10) 调节生长速率；调节生长速率；11) 11) 加入酶的

39、竞争抑制剂。加入酶的竞争抑制剂。二二. . 动植物细胞的组织培养动植物细胞的组织培养1. 1. 动物细胞培养动物细胞培养 动物细胞培养又称组织培养，是生物技术的重要组成部分。它与植物细胞、微生物细胞培养不同，是将来自动物某些器官或组织的细胞，在模拟体内生理条件下进行体外培养，使之存活和生长。 早期的动物细胞培养，实际上是以组织片来进行培养的，后来改进为单细胞状态培养，并作为生产疫苗等物质的培养手段。1975年后，建立了以大量制备有用的细胞成分为目的的培养设施而进入新阶段。它不仅用于生产各类疫苗，而且随着动物细胞可以作为外来DNA的受体细胞的DNA重组技术的成功而得到发展，已可用来生产人生长激素

40、、人胰岛素和干扰素。培养能产生生长激素的基因工程细胞猴肾细胞，最高表达量，以1107个细胞计，每日可获得近1mg的产物。使用该法生产的产物有5大类：a. 病毒疫苗（如脊髓灰质炎、狂犬病、乙型肝炎等的疫苗）；b. 干扰素；c. 激素；d. 免疫剂；e.人体活性蛋白（如胰岛素、血纤维蛋白溶酶原等），其中病毒疫苗生产已得到广泛应用。 (1) (1) 动物细胞的性质动物细胞的性质 动物组织经物理切碎、切片，或者经化学法或酶法处理所得的细胞，一般经约动物组织经物理切碎、切片，或者经化学法或酶法处理所得的细胞，一般经约5050代分裂代分裂繁殖，便退化死亡。在培养期内，染色体数目和二倍体细胞特性仍保持正常。

41、这类细胞繁殖，便退化死亡。在培养期内，染色体数目和二倍体细胞特性仍保持正常。这类细胞被称为初代培养细胞。细胞在反复分裂的过程中，有时出现繁殖能力突然培强、几乎无被称为初代培养细胞。细胞在反复分裂的过程中，有时出现繁殖能力突然培强、几乎无限制繁殖的细胞。其形态、病毒敏感性、抗原性、染色体构成等都发生了变化，完全失限制繁殖的细胞。其形态、病毒敏感性、抗原性、染色体构成等都发生了变化，完全失去原细胞的特性。我们把这一类通常所说的癌细胞称之为确立细胞株或株化细胞。来源去原细胞的特性。我们把这一类通常所说的癌细胞称之为确立细胞株或株化细胞。来源于小鼠的于小鼠的L L细胞和来源于人子宫颈癌的细胞和来源于人

42、子宫颈癌的HelaHela细胞就是有名的确立细胞株。绝大部分初代培细胞就是有名的确立细胞株。绝大部分初代培养细胞只能附着面层着在容器壁上进行繁殖，形成单层状细胞层，因此称为贴壁附着细养细胞只能附着面层着在容器壁上进行繁殖，形成单层状细胞层，因此称为贴壁附着细胞或附着性细胞。用胰蛋白酶处理这个细胞层，又可分散成单细胞，如果继续培养又可胞或附着性细胞。用胰蛋白酶处理这个细胞层，又可分散成单细胞，如果继续培养又可形成单细胞层。我们把这种操作称为移植继代培养。但这类细胞与确立细胞株不一样，形成单细胞层。我们把这种操作称为移植继代培养。但这类细胞与确立细胞株不一样，不能无限繁殖，人胚胎组织的细胞经过不能

43、无限繁殖，人胚胎组织的细胞经过5050次分裂便停止繁殖，为区别起见，把这类细次分裂便停止繁殖，为区别起见，把这类细胞称为细胞株。胞称为细胞株。 这类细胞在繁殖初期也有形态变化，经过几代反复分裂繁殖后，只有一种能继续繁这类细胞在繁殖初期也有形态变化，经过几代反复分裂繁殖后，只有一种能继续繁殖的叫做成纤维细胞，其他形状的细胞就消失了。殖的叫做成纤维细胞，其他形状的细胞就消失了。 通常，成纤维细胞在通常，成纤维细胞在5050代内染色体是正常的。成纤维细胞的繁殖过程是，开始于初代内染色体是正常的。成纤维细胞的繁殖过程是，开始于初代培养细胞期，随着世代的增加进入对数繁殖期，大约经过代培养细胞期，随着世代

44、的增加进入对数繁殖期，大约经过30305050代的繁殖，生长速度就变代的繁殖，生长速度就变缓慢，进入衰减期，这时细胞分开明繁殖就完全停止，继而死亡。在此繁殖过程中可能出现有少部缓慢，进入衰减期，这时细胞分开明繁殖就完全停止，继而死亡。在此繁殖过程中可能出现有少部分细胞发生变异的确立细胞株。分细胞发生变异的确立细胞株。 成纤维细胞在衰减期之前，大部分不具癌化性，仍留初代培养细胞的性质，因成纤维细胞在衰减期之前，大部分不具癌化性，仍留初代培养细胞的性质，因此非常安全可靠。如果从中采集繁殖此非常安全可靠。如果从中采集繁殖10102020代的细胞作种细胞，冷冻保存在代的细胞作种细胞，冷冻保存在-80-

45、800 0C C，供作生产，供作生产疫苗、尿激酶、干扰素等的组织培养的种细胞是可行的。疫苗、尿激酶、干扰素等的组织培养的种细胞是可行的。 确立细胞株一般都显示非常稳定的繁殖特性，可以无限增殖，在大多数情况下，可用确立细胞株一般都显示非常稳定的繁殖特性，可以无限增殖，在大多数情况下，可用于大量悬浮培养。然而，它具有癌化性质，用来生产疫苗之类物质是带有一定的危险性。于大量悬浮培养。然而，它具有癌化性质，用来生产疫苗之类物质是带有一定的危险性。可是，近代分离纯化支术的进步，有可能除去夹杂有害物质。这样用确立细胞株生产有用可是，近代分离纯化支术的进步，有可能除去夹杂有害物质。这样用确立细胞株生产有用物

46、质也是完全可能的。例如：物质也是完全可能的。例如：19821982年用来自淋巴瘤的确立细胞株淋巴芽球细胞作种细胞进年用来自淋巴瘤的确立细胞株淋巴芽球细胞作种细胞进行悬浮培养，生产出用于临床的人干扰素。行悬浮培养，生产出用于临床的人干扰素。 （2 2）培养条件）培养条件 动物细胞的培养条件和微生物培养相似，除要保证无杂菌外，还需要适当的营养、动物细胞的培养条件和微生物培养相似，除要保证无杂菌外，还需要适当的营养、pHpH、温度、溶解氧、温度、溶解氧、罐压、搅拌转速、渗透压等。罐压、搅拌转速、渗透压等。 细胞培养最适温度为细胞培养最适温度为3737+ +0.50.5，偏离此温度，生长和代谢就受到影

47、响，甚至死亡。实验证明，细胞对低温的耐受性，偏离此温度，生长和代谢就受到影响，甚至死亡。实验证明，细胞对低温的耐受性比对高温强。比对高温强。 大多数生物体液的大多数生物体液的pHpH都接近中性，细胞生存的都接近中性，细胞生存的pHpH在在6.86.87.67.6之间，最适之间，最适pHpH为为7.27.27.47.4间，当间，当pHpH低于低于6.06.0或高于或高于7.67.6时，生长就受到影响，甚至死亡。但多数类型的细胞对偏酸性的耐受性较强，在仿碱性条时，生长就受到影响，甚至死亡。但多数类型的细胞对偏酸性的耐受性较强，在仿碱性条件下则会很快死亡。作为代谢产物的件下则会很快死亡。作为代谢产物

48、的COCO2 2，除保证体内的代谢活动外，还有调节，除保证体内的代谢活动外，还有调节pHpH的作用。大多数培养的作用。大多数培养基的基的pHpH就是利用就是利用COCO2 2（NaHCONaHCO3 3缓冲系液）和细胞代谢产物（特别是乳酸）的组合来控缓冲系液）和细胞代谢产物（特别是乳酸）的组合来控NaHCONaHCO3 3控系统就是控系统就是血中自然缓冲剂。在培养箱中，可根据需要持续地提供一定比例的血中自然缓冲剂。在培养箱中，可根据需要持续地提供一定比例的COCO2 2气体。在培养罐中，可增加气体。在培养罐中，可增加NaHCONaHCO3 3的用量，调的用量，调节节COCO2 2浓度来控制培养

49、液的浓度来控制培养液的pHpH，以保持比较稳定的，以保持比较稳定的pHpH范围。范围。 溶解氧的控制，通常都是采用控制通气量、搅拌转速和空气中的氧浓度等因素来实现，但对脆弱的动物细溶解氧的控制，通常都是采用控制通气量、搅拌转速和空气中的氧浓度等因素来实现，但对脆弱的动物细胞和易产生泡沫的含血清培养基，只有在维持适宜的通气量和缓慢的搅拌的基础上，通过改变空气中的氧浓度胞和易产生泡沫的含血清培养基，只有在维持适宜的通气量和缓慢的搅拌的基础上，通过改变空气中的氧浓度来进行。现在有一种控制溶氧的办法是将硅氧管浸的培养液中，通过硅氧膜从管内供氧。用这种办法可增加供来进行。现在有一种控制溶氧的办法是将硅氧

50、管浸的培养液中，通过硅氧膜从管内供氧。用这种办法可增加供氧浓度，也可增加气液接触面积。适当的渗透压可通过调节培养液中的盐和葡萄糖浓度来维持。氧浓度，也可增加气液接触面积。适当的渗透压可通过调节培养液中的盐和葡萄糖浓度来维持。 只有满足这些基本条件，细胞才能在体外正常存活和生长。在实际培养中，还应根据不同细胞体外培养的只有满足这些基本条件，细胞才能在体外正常存活和生长。在实际培养中，还应根据不同细胞体外培养的难易程度采取不同的具体措施。难易程度采取不同的具体措施。 （3 3）培养基）培养基 动物细胞培养基的组成是一个极为重要的问题。它必须要有足够的糖、脂肪动物细胞培养基的组成是一个极为重要的问题

51、。它必须要有足够的糖、脂肪、蛋白质和核酸等代谢所需要的各种成分，包括十几种必需氨基酸及其他非必需氨基酸、维、蛋白质和核酸等代谢所需要的各种成分，包括十几种必需氨基酸及其他非必需氨基酸、维生素、糖和无机盐等。氨基酸只利用生素、糖和无机盐等。氨基酸只利用L-L-型；碳源以葡萄糖为最常用，半乳糖也可以，但不能利用型；碳源以葡萄糖为最常用，半乳糖也可以，但不能利用双糖；维生素、无机盐是由血清提供或单独添加。由于培养基成分的来源不同，有下列几种培养基双糖；维生素、无机盐是由血清提供或单独添加。由于培养基成分的来源不同，有下列几种培养基。 合成培养基和血清培养基合成培养基和血清培养基 人们对确立细胞株的营

52、养要求进行了广泛的研究，出现了许多化人们对确立细胞株的营养要求进行了广泛的研究，出现了许多化学合成培养基，并在市场上出售。其中最有名的是伊格尔（学合成培养基，并在市场上出售。其中最有名的是伊格尔（EagleEagle）的最低基本培养基，简称）的最低基本培养基，简称MEMMEM，见下表。它是由，见下表。它是由1313种必需氨基酸、种必需氨基酸、8 8种维生素、葡萄糖和无机盐所组成。对于细胞繁殖来种维生素、葡萄糖和无机盐所组成。对于细胞繁殖来说，尚须加入说，尚须加入5%-10%5%-10%的动物血清（如小牛血清）。但从经济成本或血清供给来看，使用这种的动物血清（如小牛血清）。但从经济成本或血清供给

53、来看，使用这种培养基都是不现实的。由于所用血清来源批次不同和含有较多蛋白质，培养结果的重复性往培养基都是不现实的。由于所用血清来源批次不同和含有较多蛋白质，培养结果的重复性往往较差，细胞产物还混有异种蛋白，给分离精制带来很大的困难。往较差，细胞产物还混有异种蛋白，给分离精制带来很大的困难。 无血清培养基无血清培养基 近年来对无血清培养基进行了深入研究，已有商品出售。通常所说近年来对无血清培养基进行了深入研究，已有商品出售。通常所说的无血清培养基有：基本合成培养基、基本合成培养基加生长因子（功能因子）和基本的无血清培养基有：基本合成培养基、基本合成培养基加生长因子（功能因子）和基本合成培养基加组

54、织抽提液三种。合成培养基加组织抽提液三种。 伊格尔的最低基本培养基（伊格尔的最低基本培养基（MEMMEM）组成）组成 成成 分分 浓度，浓度，mg/L 成成 分分 浓度，浓度，mg/LNaCl基压裂液基压裂液 6.800KCL 400 NaH2PO4（无水）（无水） 115 MgSO4（无水）（无水） 93.5CaCl2（无水）（无水） 200葡萄糖葡萄糖 1000L-精氨酸盐酸盐精氨酸盐酸盐 126L-半胱氨酸盐酸盐（一水）半胱氨酸盐酸盐（一水）31.4L-酪氨酸酪氨酸 36琥珀酸琥珀酸 75 75 琥珀酸钠琥珀酸钠 100 100 重酒石酸胆碱重酒石酸胆碱 1.8 1.8 叶酸叶酸 1 1

55、肌醇肌醇 2 2 烟酰胺烟酰胺 1 1 泛酸钙泛酸钙 1 1 L-组氨酸盐酸盐（一水）组氨酸盐酸盐（一水） 42L-异亮氨酸异亮氨酸 52L-亮氨酸亮氨酸 52L-赖氨酸盐酸盐赖氨酸盐酸盐 73L-蛋氨酸蛋氨酸 15L-苯丙氨酸苯丙氨酸 32L-苏氨酸苏氨酸 48L-色氨酸色氨酸 10L-缬氨酸缬氨酸 46盐酸吡哆醛盐酸吡哆醛 1 1核黄素核黄素 0.10.1盐酸硫胺素盐酸硫胺素 1 1生物素生物素 0.020.02卡那霉素卡那霉素 6060酚红酚红 6 6 注：注：L-L-谷氨酰胺（过滤灭菌）谷氨酰胺（过滤灭菌）0.292g/L0.292g/L 10% 10%碳酸氢钠水溶液（在密闭状态下高压

56、灭菌）适量碳酸氢钠水溶液（在密闭状态下高压灭菌）适量 前两种成分明确，又称已知成分培养基，第三种成分较复杂，含量不确定。后前两种成分明确，又称已知成分培养基，第三种成分较复杂，含量不确定。后2 2种中加有种中加有生长繁殖所需的生长因子或组织抽提物，又称为代血清或无血清培养基。无血清培养基应考虑的生生长繁殖所需的生长因子或组织抽提物，又称为代血清或无血清培养基。无血清培养基应考虑的生长因子有上皮细胞生长因子、长因子有上皮细胞生长因子、T-T-细胞生长因子、氢化可的松、胰岛素、硒、铁传递蛋白等十八种。细胞生长因子、氢化可的松、胰岛素、硒、铁传递蛋白等十八种。该培养基的成分和配比是可以人工控制的，因

57、而具有极强的适应性，可使人工细胞、变异细胞在最该培养基的成分和配比是可以人工控制的，因而具有极强的适应性，可使人工细胞、变异细胞在最适生长条件下生长繁殖，产生有用的物质，也可简化产物的分离和精制。这些都是添加生长因子无适生长条件下生长繁殖，产生有用的物质，也可简化产物的分离和精制。这些都是添加生长因子无血清培养基的优点。血清培养基的优点。 （4 4）动物细胞大量培养技术）动物细胞大量培养技术 培养的动物细胞可分为悬浮型和贴附型两大类。培养的动物细胞可分为悬浮型和贴附型两大类。 悬浮型细胞呈圆形，生长时呈悬浮状态，通常是某些癌细胞和血液细胞。悬浮型细胞呈圆形，生长时呈悬浮状态，通常是某些癌细胞和

58、血液细胞。 大多数培养的细胞是贴附型，培养时贴附在支持物上。由于细胞类型不同，故有下大多数培养的细胞是贴附型，培养时贴附在支持物上。由于细胞类型不同，故有下 列几种培养技列几种培养技术：术： a a悬浮培养；悬浮培养； b b贴壁附着培养；贴壁附着培养； c c 罐培养技术罐培养技术 悬浮培养悬浮培养 这种培养技术与培养微生物相似，基本上利用常用的发酵罐装置，控制条件（如氧化这种培养技术与培养微生物相似，基本上利用常用的发酵罐装置，控制条件（如氧化还原电位、细胞类密度等）有所不同。曾用一定规模的发酵罐培养淋巴芽球细胞来生产过还原电位、细胞类密度等）有所不同。曾用一定规模的发酵罐培养淋巴芽球细胞

59、来生产过a-a-干扰素。在特干扰素。在特殊的连续培养装置中，使用无血清培养基实现了该细胞的高密度发酵。因此，这种方法可进行大规模细胞殊的连续培养装置中，使用无血清培养基实现了该细胞的高密度发酵。因此，这种方法可进行大规模细胞培养来生产有用物质。培养来生产有用物质。 贴壁附着培养贴壁附着培养 贴附型细胞的基本特性就是必须附着培养容器壁的介质上才能生长繁殖，因贴附型细胞的基本特性就是必须附着培养容器壁的介质上才能生长繁殖，因此这类细胞就要采用贴壁附着培养。为了增大附着面积，过去常用扁瓶简单装置来进行单层静置培养此这类细胞就要采用贴壁附着培养。为了增大附着面积，过去常用扁瓶简单装置来进行单层静置培养

60、。由于生物技术的迫切需要，现已开发出各种形式的培养装置，如旋转瓶和多段式托盘培养装置，已。由于生物技术的迫切需要，现已开发出各种形式的培养装置，如旋转瓶和多段式托盘培养装置，已用于用于B-B-干扰素的生产。但利用这些装置仍是手工操作，生产量不大，所以又研制出微载体培养。干扰素的生产。但利用这些装置仍是手工操作，生产量不大，所以又研制出微载体培养。 微载体培养微载体培养 所用的微载体是交联葡萄糖经二乙氨基乙基化后所得的离子交换树脂，其电荷所用的微载体是交联葡萄糖经二乙氨基乙基化后所得的离子交换树脂，其电荷密度规定在适于细胞培养的范围内。将这种载体悬浮在培养液中，细胞便附着在上面进行单层状增殖密度