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文档简介

1、 一、基因研究的发展过程 二、DNA的组成、结构和功能 三、基因工程的概念及主要内容 四、工具酶和基因载体 五、基因工程的基本技术 六、基因工程在食品产业中的应用四、工具酶和基因载体 4.1 基因工程的工具酶 限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 4.2 基因工程载体 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 4.1 基因工程的工具酶(1)限制性内切酶 限制性内切酶的定义和分类 II型限制性内切酶的命名 II型限制性内切酶的识别序列 II型限制性内切酶的酶切位点 II型限制性内切酶的的主要用途 限制性内切酶的定义 是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷

2、酸二酯键断开,产生具有3-OH基团和5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。 至今发现的限制性内切酶有三种类型,各具特性,基因工程操作中真正有用的是II型酶。 限制性内切酶的命名 命名原则一般是以酶源生物的属名和种名前1、2个字母以及株(型)代号来命名。如果从同一种生物中先后分离到多种限制性内切酶,则依次用罗马数字表示。 举例:EcoRI中的Eco表示从大肠杆菌(Escherichia coli)中分离出来的,R代表大肠杆菌的R株,I表示从中分离出的第一种限制性内切酶。 从流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)菌株d中分离出来的第三种限制酶,被命名为HindIII。 I

3、I型限制性内切酶的识别序列 限制性内切酶在双链DNA上能够识别的核苷酸序列被称为识别序列。 多数限制酶的识别序列由6个核苷酸对组成。 如常用的限制酶EcoRI、HindIII和BamHI的识别序列分别是 GAATTC AAGCTT GGATCC CTTAAG 、 TTCGAA、 CCTAGG。 少数限制酶的识别序列由4个或5个核苷酸对组成,或者由多于6个核苷酸对组成。 如Sau3A的识别序列是GATC MaeIII的识别序列是GTNAC CTAG, CANTG。 限制性内切酶识别序列的共同规律:呈回文结构,即序列被正读和反读是一样的。 为了便于书写,识别序列可以以5 3走向的单链DNA表示。例

4、如,识别序列5AAGCTT 3就可以写成 3TTCGAA 5 AAGCTT。 有的限制酶可识别两种以上的核苷酸序列。例如,AccI既可识别GTATAC,又可识别GTCGAC。 II型限制性内切酶的酶切位点 DNA在限制性内切酶的作用下,使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为酶切位点,可用 表示。 限制酶在DNA上的酶切位点一般是在识别序列内部,如G GATCC、AT CGAT等。少数在两侧,如 GATC、 CATG 等。 DNA分子经限制性内切酶酶切产生的DNA片段末端,因所用限制酶不同而不同。HindIII对双链DNA分子的切割作用限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA 分子的构建 I

5、I型限制性内切酶的主要用途 (1) 在特异位点上切割DNA,产生特异的限制酶切割的DNA片段。 对于核苷酸序列已知的DNA分子,可利用此法直接分离目的基因。 (2) 建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱 B E H BHEH BEM3 kb2kb1.5 kb1 kb500 b(a)BBBEHBHEB(b)BEBEBEEEHHEHHBHBHBBBB3 .31.71.71.61.40.32.03.03.50.61.50.93.51.52.31.00.51.23.31.7限制性作图的基本原理 (3) 构建基因文库 基因工程中,需要将某种生物的全部基因组的遗传信息,贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,

6、以备需要时随时能够应用。这种保存基因组遗传信息的材料(受体细胞),就称为基因文库。 (4) 用限制酶切出相同的黏性末端,以便重组DNA。5G-C-T- C-T-G-C-A-G-G-A-G33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5(2)DNA连接酶 DNA连接酶的定义 能将两段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶。该酶催化DNA相邻的5磷酸基团和3羟基末端之间形成磷酸二酯键,将DNA单链缺口封合起来。 OH PDNA连接酶5G-C-T- C-T-G-C-A G-G-A-G33C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C5OH P DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(nick)

7、,即双链DNA上的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂,而不能封闭裂口(gap),即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。 DNA连接酶的种类 目前常用的DNA连接酶有大肠杆菌DNA连接酶和T4连接酶。 大肠杆菌DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接。 T4连接酶可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接,也能催化双链DNA片段平末端之间的连接,但平末端之间的连接效率比较低。 DNA连接酶的连接作用 (a)缺口DNA (b)平末端DNA (c)粘性末端DNA分子 粘性末端DNA片段的连接 具粘性末端的DNA片段的连接比较容易,

8、也比较常用。但是,在连接反应混合物中,具有粘性末端的载体DNA分子会发生自我环化作用,并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合的环形结构。这样,就会使只含有载体分子的转化子克隆的“本底”比例大幅上升,最终给重组DNA分子的筛选工作带来麻烦。 用碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子,以移去其末端的5磷酸基团,可以克服这一缺点。碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性的质粒DNA分子再环化 平末端DNA片段的连接 基因克隆实验中,常用的平末端DNA片段的连接法,主要有同聚物加尾法、接头连接法等。 (1)同聚物加尾法 同聚物加尾法是利用互补的同聚物序列之间的退火作用完成的连接。其核心部分是,利用末端脱氧核苷

9、酸转移酶(能够在无模板链的情况下,将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3-OH基团上)转移核苷酸的特殊功能。 应用互补的同聚物加尾法连接DNA片段 (2)接头连接法 DNA接头,是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端,另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。人工接头连接(3)DNA聚合酶 DNA聚合酶的定义 具有催化DNA体外合成反应作用的酶称为DNA聚合酶。这类酶的特点在于,能够把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端,催化核苷酸的聚合作用。DNA聚合酶作用时大多都需要模板,合成产物的序列与模板互补。 常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、 T7

10、 DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶和反转录酶等。 到目前为止,已从大肠杆菌中纯化出了三种不同类型的DNA聚合酶,即大肠杆菌DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。 DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II的主要功能是参与DNA的修复过程,而DNA聚合酶III的主要功能与DNA的复制有关。 基因工程中常用的DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶:是它的发现使PCR扩增特异性DNA片段成为可能。PCR反应过程中需将模板DNA置于高温下变性、解链,而耐热DNA聚合酶在靶DNA变性的高温下仍能保持活性,因而在PCR过程中只需一次性加入反应系统即可,简化了操作过程。 目前有于PCR的耐热DNA聚合酶主要

11、有Taq DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶等。 反转录酶:催化以单链RNA为模板生成双链DNA的反应,又称依赖RNA的DNA聚合酶。 反转录酶是分子生物学中最重要的核酸酶之一。以mRNA模板合成cDNA,是其最主要的用途。反转录酶的5 3方向的DNA聚合酶活性 都齐全了,能够在试管中切割或连接都齐全了,能够在试管中切割或连接DNA了了4.2 基因工程载体理想的基因工程载体应具备的特征(1)具有复制起点,能携带外源DNA片段进入受体细胞,进行稳定的DNA自我/同步复制(2)具有标记基因(3) 具有若干限制酶的单一识别位点(4) 具有较高的外源DNA的载装能力常见的基因工程

12、载体 包括质粒载体、 噬菌体类载体等。(1)质粒载体 质粒的一般生物学特性 质粒DNA 质粒DNA的复制类型 质粒载体的构建及重要的质粒载体 天然质粒用作克隆载体的局限性 重要的质粒载体 质粒DNA 质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。 绝大多数是质粒都是由环形双链DNA分子组成的复制子。 环形双链的质粒DNA分具有三种不同的构型: 共价闭合环形DNA(SC)、开环DNA(OC)和线形DNA(L)。 质粒DNA的分子构型 在琼脂糖凝胶电泳中,不同构型的同一种质粒DNA具有不同的电泳迁移率。走在最前沿的是scDNA,其后依次是LDNA和ocDNA。 质粒DNA琼脂糖凝胶电

13、泳模式图 不同质粒DNA分子量差异显著,小的不到1 kb,大的超过500 kb,多数在10 kb。 标准的质粒命名,通常用一个小写的p来代表质粒,而用一些英文缩写或数字来对这个质粒进行描述。例如,pBR322,BR代表研究出这个质粒的研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的头一个字母,322是实验编号。 质粒DNA的复制类型 根据寄主细胞所含拷贝数的多少,可将质粒分成两个不同的复制型:一种是低拷贝数的质粒(1-3份拷贝),称为“严密型”复制控制的质粒;另一种是高拷贝数的质粒(10-60份拷贝),称为“松弛型”复制控制的质粒。 拷贝数的常用定义:生长在标准的培养基条件下,每个细菌细胞中所含

14、有的质粒DNA分子的数目。 有的文献定义为每条细菌染色体所平均具有的质粒DNA分子的数目。 一种质粒究竟是属于严密型还是松弛型并非绝对的,还受到寄主的控制。例如,R1质粒 大肠杆菌寄主(严密型)、奇异变型杆菌寄主(松弛型)。 2.质粒载体的构建及重要的质粒载体 (1)重组体分子的转化存在三种可能性 (1)没有转化进宿主细胞 (2)质粒发生自身环化,没有重组成功(空载质粒) (3)重组成功(重组质粒) 质粒的克隆位点位于抗菌素标记之外无抗性有抗性有抗性质粒的克隆位点位于抗菌素标记之内无抗性有抗性无抗性克隆位点克隆位点克隆位点克隆位点 质粒的克隆位点位于抗菌素标记之外无抗性有两种抗性有两种抗性质粒

15、的克隆位点位于抗菌素标记之内无抗性有两种抗性有一种抗性克隆位点克隆位点抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因克隆位点克隆位点抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因(2) 天然质粒用作克隆载体的局限性q 天然质粒是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。 例如:天然质粒pSC101 特点:只有一个四环素抗性选择标记(Tetr),三个基因插入失活克隆位点和一个其它克隆位点(EcoRI)。 缺点:分子量较大(9.1 kb),拷贝数较低,只有一个抗菌素抗性基因(无法使用插入失活技术选择重组体分子) (3)重要的质粒载体 为改进转化子筛选技术,有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗药性的选择记号,又具有低分子量

16、、高拷贝、以及外源DNA插入不影响复制功能的多种限制酶单酶切位点等优点的新的质粒载体。 pBR322质粒载体 酵母2m质粒 pBR322质粒载体 构建pBR322质粒的关键性步骤是,通过体内易位或体外重组加入可选择的抗药性记号,同时设法除去非必要的区段(亲本质粒DNA上一些对基因克隆无关紧要的DNA片段,及对DNA克隆无用的限制酶识别位点),以降低分子量。pBR322质粒三个不同来源的组成部分质粒载体pBR322pBR322质粒的优点质粒的优点具有较小的分子量(4.36 kb);具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号;具有较高的拷贝数2) 酵母2m质粒 酵母是一种最简单的单细胞真核生物,

17、具有对外源基因翻译后进行蛋白质加工和修饰的功能。 在啤酒酵母中发现的质粒,多数长度为2m 。在每个细胞中的平均拷贝数为50-100,能稳定地存活于细胞中。 目前已构建了一系列用于酵母转基因的质粒载体,也包括穿梭质粒载体。酵母质粒具有广阔的发展前景。(2)噬菌体类载体 质粒载体在基因工程研究中快速简便,但由于其自身特性的限制,最大可以克隆的DNA片段一般在10 kb左右。若要构建一个基因文库,往往需要克隆更大一些的DNA片段。为满足这一要求,人们把噬菌体发展成为一种克隆载体。 噬菌体是寄生在细菌中的病毒,其结构比细菌或真核细胞简单,但比质粒分子复杂得多。它由蛋白质外壳和头部外壳内的DNA组成。高

18、效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞;自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,因而噬菌体能被开发成基因工程的有用载体。 v噬菌体的一般生物学特性噬菌体的结构及其核酸类型 噬菌体有三种不同的基本类型,即无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型和线状体型。 噬菌体的核酸,最常见的是双链线性DNA。 噬菌体的结构示意图 噬菌体的生命周期 可分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。溶菌周期噬菌体(烈性噬菌体)将其感染的寄主细胞变成噬菌体的“制造厂”,产生大量的子代噬菌体颗粒。溶源生长周期噬菌体(温和噬菌体)不产生子代噬菌体颗粒,噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上。噬菌体的生命周期 烈性噬菌体的生命周期噬菌体的生命周期 温和噬菌体的生命周期v噬菌体载体 噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体。其基因组中有部分基因为非必要基因,被外源基因取代后,并不影响其生命功能。这是赖以发展作为基因克隆载体的一种重要特性。 噬菌体线性DNA分子的粘性末端(cos位点)及其环化作用v 噬菌体载体的主要类型 构建噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除和切除掉非必要的区段。 构建出的派生载体,可归纳成两种类型:一种只具有一个可供外源DNA插

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