MTT方法总结详解

1、MT。法总结1. MTT原理MTT比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法，所用的显色剂是一种能接 受氢原子的化合物MTT,原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的 MTT还原为蓝紫色的结晶formazan(甲瓒)后者的产量与活细胞数成正相关。 formazan可用DMSO、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解， 在酶标仪上以波长490nm 和570nm处进行比色。所检测的OD值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。 2优点(1)有灵敏度高，重复性好，(2)操作简便、经济、快速、易自动化的优点，(3)而且没有3HTdR掺入试验放射性污染，(4)还可以减少如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验中的人为性因素 缺点：

2、影响因素多，重复性较差。 MTT有毒性致突变性，操作时应注意防护 3.步骤 接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含 10%胎牛血清的 RPMI1604培养液配成单个细胞悬液，以每 孔5X1031X104个细胞接种于96孔 培养板中，每孔体积200uL培养细胞；将培养板移入 CO2孵箱中，在37C、5%CO2及湿度条件下，培 养4h以上(至细胞状态稳定).加药物干预 2448h(培养时间取决于实验目的 和要其求) 呈色：加MTT时一定要避光，测24h细胞增殖率时，于加药干预20h后， 每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20ul, 37C,继续孵育4h;测48h细胞增值率时, 于加药

3、干预44h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20uL,继续孵育4h。终止培养后，对悬浮生长的细胞，需离心，(2000rpm. 15min);对贴壁细胞 最好也离心(2000rpm,3min).然后用1mL或3mL注射器小心吸弃孔内培养上清 液，每孔加入150uL DMSO振荡10min,使结晶物充分溶解。(4)比色：选才？ 490nm和570nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值， 记录 结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线。4.注意事项(1)选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，接种前需计数，根据查阅文献决定不同细胞的接种个数，一般以每 孔5X1031M04个细胞接种于96孔培

4、养板中，每孔体积200uL。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行 MTT试 验前，对每一种细胞都具贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲 线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间， 以保证培养终止致细胞过满。这 样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。(2)实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚碉。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚碉，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。(2)避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响 试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性

5、。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。(3)加药时，每种药5个浓度(每个浓度相差10倍)，一个浓度设4个副孔。(4)设空白对照和正常对照，每块板设空白复孔，内加培养液，不含细胞与药物， 各做46个复孔，取平均值，主要目的是为了减少培养基含有的酚红对比色的影 响。每种细胞设46个正常对照孔，含细胞不含药物，每孔加样100仙:/孔。(对 照，不含细胞，含药物和培养基？)(5)细胞铺板时，要充分分散，而且要加几个孔就重新吹散一次，否则，细胞 浓度就会不同。(我曾经试验过，用后加的孔作试验组与用先加的孔作对照组， 结果有些差异，也许是我的熟练程度不行！)另

6、外，吹散次数过多也会影响细胞 活力。所以要熟练鞋、快些上板。(6)培养后，细胞的培养既要吸干净，否则，残留的蛋白会对 MTT有一定的 吸附作用，影响就过准确性。我使用的是翻转法，将培养液倒掉，这样做很简便， 又很快洁。重复性也不错。(7)测吸光度值要有一定的时间范围，在测定是你会发现，随着时间的推移没 空都会变深些，(这可能是由于 MTT在空气中氧化的结果，我记不清了，你再 找找书，另外，具体时间我也没有记清)(8)阳性药物的选择，要选择经典的，有说服力的，又对你的细胞有很好的杀 伤了力的药物。别认为简单，我就曾经因为阳性药物选择错误而重新做试验， 惨痛的教训呀！ ！(9)如果用96孔板，周围

7、一圈孔的值由于液体蒸发和温度梯度原因，会误差很大，尽量不用。(10)溶解甲膻时，如果是悬浮细胞或细胞贴壁不牢，尽量用酸性 SDS溶解， 不要弃去培养液，以免细胞损失。这还要求最后加入药物和MTT时，血清浓度低于10%。6.如何计算IC50用抑制率作为Y,加药浓度的对数作为X,进行线形回归，根据得到的方程求抑 制率是50%时的加药浓度，也就是IC50oIC50的计算和LD50的计算很相似，可以用SPSS计算。以剂量为横坐标，以抑 制率为纵坐标(Y)。进行回归分析也可以，即用抑制率作为 Y,加药浓度的对 数作为X,进行线形回归，根据得到的方程求抑制率是50%时的加药浓度，也就 是IC50。但是这有

8、要求：抑制率最好在30-70%之间才能采用回归，因为这一段 几乎是直线关系。我的经验是，因为药物的作用通常是一条S型曲线，在药物浓度很高或很低 的时候就接近一个平台，所以加药剂量的选取非常重要，在不知道药物大概的 IC50的时候，可以各个剂量之间10倍稀释，这样加药的范围就比较宽，可以摸 索到合适的剂量，如果已经有参考的剂量，也可以等倍稀释。如果你得到的抑制 率能够分布在50%上下各有几个点，那么以线形回归法得到的结果一般是比较准 确的。MTT法本身并不是非常准确，一般要重复 3次，得到的结果差不多才可信。MTT大汇总实验前应明确的问题1 .选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一

9、内贴壁细胞长满时约 有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行 MTT试验 前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲 线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感 性降低，太少观察不到差异。2 .药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初 筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的 时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3 .时间点的设定。在不同时间点的测定 OD值，/&入excel表，

10、最后得到不同时 问点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了 （到了平台 期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最 明显）。4 .培养时间。200ul的培养液对于10的45次方的增殖期细胞来说，很难维持 68h,如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向 G0期而趋于静止，影响结 果，我们是在48h换液的。5 .MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做 MTT时， 尽量无菌操作，因为细菌也可以导致 MTT比色OD值的升高。6 .理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。7 .实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、M

11、TT、二甲基亚碉。 对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚碉，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8 .避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试 验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于 10% 胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。实验步骤贴壁细胞：1.1 集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌 PBS填充）。1.5 %CO2, 37c孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药 物，原则上，细

12、胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天 下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度，每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个, 否则难以反应真实情况1.6 %CO2, 37c孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4 .每孔加入20U1MTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4h。若药物与 MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5 .终止培养，小心吸去孔内培养液。6 .每孔加入150ul二甲基亚碉，置摇床上低速振荡 10min,使结晶物充分溶解 在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7 .同时设置调零孔

13、（培养基、MTT、二甲基亚碉），对照孔（细胞、相同浓度的 药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚碉）悬浮细胞：1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度 ixi06/ml,按次序将补足的1640 （无 血清）培养基40ul ；加Actinomycin D （有毒性）10ul用培养液稀释l g/ml, 需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20）;需检测物10ul;细胞悬液50ul （即 5 M 04cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加 100 储存液 100 1640）。2）置37C, 5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。3）每孔加入10 ul

14、MTT溶液（5 mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4 h。（悬浮 细胞推荐使用 WST-1,培养4 h后可跳过步骤4）,直接酶联免疫检测仪OD570nm （630nm校准）测量各孔的吸光值）4）离心（1000转x10min）,小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚碉，置摇 床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm （630nm 校准）测量各孔的吸光值。5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚碉），对照孔（细胞、相同浓度 的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚碉），每组设定3复孔。MTT的配制MTT一般最好现用现配，过滤后 4£避光保存

15、两周内有效，或配制成 5mg/ml 保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、 锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把 MTT粉分装在EP管里，用的时候现配， 直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不 能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT 需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短， 或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉 .配制MTT时用用PBS<ph=7.4»?§解，也有人用生理盐水配，60c水浴助溶。PBS酉己方：Nacl

16、 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g调 ph 7.4定容1L关于细胞的接种（铺板）细胞过了 30代以后就不要用了，因为状态不好了 ；培养板要用好的（最好进口板）， 不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种，因为细胞密度在10000/ml左右时，所 测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结 果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过 快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/

17、ml, 100ul/ 孔。细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么 取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓 度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.其它的声音：1 .首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于月中瘤细胞。10000仇是太高了，这样即使药物有作用，MTT 方法也是表现不出的，最佳点板浓度在 4000-5000/JI,太少的话SD值会很大。2 .MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新 手

18、，20%的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一 定要过关。3 .我做的是月中瘤细胞的MTT实验，这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的 浓度来接种的，结果细胞长的太湖结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度, 用过4000080000/ML的浓度都做过MTT实验，结果发现做的结果比较好点的是 6000070000/ML的浓度组的用40000/M的浓度的组，由于细胞少，药物作用的梯 度还是有，只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性（有 时间依赖性和浓度依赖性的药物）来确定培养时间是48小时还是72小时.注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀

19、下来，导致每孔中的细胞数量不等， 可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移 液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。首先说说我的一点经验：1 .吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的 3至IJ4倍，可能比较容易混匀。 10ml的离心管里面最好装34ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太 多又不容易吹成单细胞悬液。2 .吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所 剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均 匀。如果是吸液量1m

20、l多的吸管，总液量在5ml左右为益3 .吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面， 否则容易吹打出气泡。4 .吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打 30-50次基 本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头 垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。）5 .向每孔中用枪头加入细胞时不要太快， 否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于 枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀 的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。 我习 惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右

21、3下，在往返回复3下移动，目的是 使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是 MTT实验的关键，也是基础，一定要 练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞， 最后细胞全死了，建议不要采用这种 方法混匀细胞。加入MTT个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的 MTT的适当 比例，具体细胞数目和真正起作用的的 MTT之间的关系确实不好确定，我认为 MTT多加一些比少加好一些MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以 10ul即够了。如果不使用96孔 板，培养基超过100ul, MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振荡一下让 MTT与培养基混匀，不过这个应该关系不大。如加入MTT后都有

22、个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性趣大 ，另外MTT稀 释彳爰加入系田胞前遢是需要以谩滤的方式滋菌悬宜 .且在加MTT前可以先在镜下 观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应。如果不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加 MTT即可。如何清除上清 百家争鸣：1 .加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前 先用平板离心机离心96孔板，2000r, 5分钟，然后吸掉上清（如果是悬浮细胞， 则推荐此法，悬浮细胞要离心2500rpmX10min.且其做MTT最好用圆底型96孔

23、板, 消除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉，建议各孔吸弃150-160U1即可）。2 .我每次将MTT加入后，再孵育四个小时，然后用离心机离心 1000G5min。但 是用枪小心地吸上清，还是会将一小部分蓝色结晶吸出。 所以还是建议翻转倒扣 的方法吧！3 .另外，可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸） 2 3次，比用成I的办法更不容 易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，发现紫色结晶几乎没有 肉眼可见的掉脱，但前提是你本身细胞贴壁要比较牢，半贴壁生长的细胞容易脱 离。假如药物作用时间长的话，阴性对照组可能由于细胞过多而使加入MTT后 形成的结晶漂起来，这样就不能直接倒掉上清。4 .做

24、MTT时，这一步骤一定要小心，不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞I会被倒掉，从而影响OD值。悬浮细胞，不要翻板，离心后也不要翻板，这个方 法害死人。5 .加完MTT反应3 4h后，从培养箱取出96孔板的动作要轻柔，避免振荡结晶, 使其滑落.你可以试着将96孔板倾斜30度角，然后用枪尖慢慢吸，有的细胞可 以用排枪一起吸，有的则要耐心的一个个用枪头吸，枪尖的力度和方向要保证每 个孔都一致。不要让枪头接触到孔底，且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平， 这样也会使结晶脱落。6 .用医用的注射器加上针头吸取液体的，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取就好 了！这次MTT我用1ml针头仔细吸培养液，觉得比其它方

25、法可靠，一般不会吸走 紫色结晶.避免消除上清而改进的方法由于一般可离心96孔板的离心机不好找。既使是贴壁细胞做MTT时，用DMSO 溶解得到结果也不好，不是得不到预期结果就是可重复性差。解决方法1:用以下文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993, 24 （10） : 455-457具体方法：配三联溶解液：10%SDS, 5%异丁醇，0.012mol/LHCL,蒸储水溶解。三联溶解液：SDS10g,异丁醇5ml, 10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶 液操作：在培养板上加一定密度的细胞悬液，90ul/孔；如需给药，则再于同时（悬 浮细胞）

26、或4h后（贴壁细胞）加入不同浓度的药物10ul/孔，均设三复孔。另外， 每块板上另没一个调零孔（只加培养液，不含细胞和药物）。培养2d后，加入MTT 溶液20ul/孔，继续培养4h,然后加入上述三联液100ul/孔，于37度放置过 夜后，用酶标仪测各孔A570值。优点：简化操作，提高了可靠性。解决方法2:日本同仁有一种新试剂CCK-8试剂，CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有 WST_8其化学名称为： 2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唾单钠盐,它在 电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（

27、1-Methoxy PMS）的作用下被细胞， 线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲染料（Formazan dy© 。生成的甲物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液或培养基进行稀释；同时，CCK-8试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。因此，无需特别的技巧，就可使每一位使用者准确、快速地得 到重现性好的实验结果。优点1、简便只需一步即可得到结果2、省时毋需预制，即开即用厂3、安全毋需放射性同位素和有机溶剂一4、快 速 省去了溶解除沉操作5、灵敏度高灵敏度高于MTT6、

28、重现性好步骤少；无损失；结果准确就是比较贵，如果经费充足，用这个是不错的 进行细胞增殖分析的使用方法：1、接种细胞悬液100小巾96孔板内，预先置于37C , 5% CO 2饱和湿度培养箱 内培养。2、在每个孔内加入10仙的CCK-8试剂。3、把培养板放在培养箱内培养1-4小时*。4、在450nm波长处测定吸光度，参比波长为 600nm或600nm以上。解决方法3:使用MTS解决方法4:力口入DMSO在同一批实验中最好不要更换 DMSO。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净，没 有去掉上清直接加DMSO, 一是沉淀会很难溶解.二培养液的颜色在检测时也能 被测到，会对最后结果造成影响。但前提是不能把

29、细胞也一起吸掉，因为这样带 来的误差要远远大于培养液没弃干净带来的误差，所以要在保证细胞不被吸掉的 前提下，尽量把培养液吸掉。如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养 液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul1 .加了 DMSO后用振荡器轻轻振荡510min,时间控制尽量严格一点，放置时间 长了会影响结果值会偏大，且结果不可信.2 .加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。如果实验孔不多，建议用此法，因其比振荡溶解效果好。3 .或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。振荡是为了让甲月赞溶解，这样才能更好的测量吸光度，振荡 96孔板有专的振荡

30、 器，目的：扎破气泡.有气泡存在时，由于其对光的反射与折射作用（酶标仪的原理 是通过测定特定波长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓度），会导致结果偏移.OD值的测定至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于DMSO,溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值，而ATCC公司的MTT试剂盒用的不是DMSO,它的测定波 长是570。（就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492,选用TMB显色 液则用450）;而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm,并且建议以655nm作为 参考波长。DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而S D S做为溶解液测吸收光值，其 值可在三天内保持不变.

31、细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大， 细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞 状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培 养的时间短，OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可 能存在污染，空白孔的OD值太高，很可能是细菌污染。复孔直接的OD值差别一般应在0.10.15,差别太大考虑：1.接种细胞数不均匀， 或是接种太多，应保证每孔一致，一般是每孔100010000个。可以细胞细胞计 数后，加入细胞悬液，再补培养基到预定体积，并轻轻吹打几次，使细胞均匀分 布，这样比直接加入预定体积的细胞悬液要好，接种时应加含血清培养基。2.贴壁时间：1824h,如果不够

32、，未悬浮的细胞会被吸掉。一般为了实验的准确，每个浓度可以设 5 6个复孔，可以最后统计时，可以除I 去一个最高值和一个最低值，或者除去其中数据离谱的值，这些离谱数字的出现 与细胞是否污染，细胞是否在培养期间死去，是否培养液蒸发过多，加MTT液是否准确，在37 C, 5%二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定（14小时）等有 密切的关系，当然测定 OD值的仪器工作状态是否正常也非常重要！（一般开机 预热 20min）。MTT方法的吸收度在0.20.8之间误差较小。这和分析化学中的1 a m b e r t-beer定律有关，对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中，经常出现标准 曲线不呈直线的情况，特别

33、是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓 度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲）。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线 弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。在吸光光度分析中，仪器测量不准确 也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光 源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器， 读数的波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大， 读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时，浓度测量误差都较 大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比T在

34、15%65%之间，或使吸光度 A在0.20.8之间，才能保证测量的相对误 差较小。当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误差最小。其它的声音：1 .最好用570nm波长的滤光片，因为MTT在这个波长的吸光度是峰值，换句话 说灵敏度高。用其它波长的也有，一般是 490nm，但我的经验灵敏度降低一半。2 .我们用的BIO-TEK公司的ELx800，一股值在2以下都是可靠的，如果复孔之间 值相差太大就要考虑是否是实验过程中的误差.我曾经看到园子的有些帖子报 道说OD值大卞S在0.2-1.2范围内与活细胞数有较好的线性关系，但OD值在0.3-0.9范围内可能更佳，若你的OD值不在这个

35、范围内则你实验的细胞数可能不 太合适，应调整你的细胞数。边缘效应96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不养细胞，否则这四行的数据会偏高或偏 低,96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，由于温 度梯度使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数 和时间。解决方法：将孔板周围的一圈孔全部不用，影响非常大，而且最外一圈 J 一定要加水、PBS或者培养液，只要能防止蒸发就可以.关于如何计算IC50(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg最大剂量I:lg(最

36、大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率举个例子：各组浓度 0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数 为 10,最大浓度为 0.1,抑制率为 0.95、0.80、0.65、0.43、0.21, 0.06。代入 计算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025Bliss法:自己查阅书籍（3）IC50

37、计算软件，见下面附件（4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50,关于LD50的方法与此相似！（5）在线求 IC50 或 EC50: http:/chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm结果统计学处理所有数值以xis表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01 时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公 式求IC50。或计算抑制率。细胞死亡率 %=OD对口组-OD实验组/OD对照组 excel表中可以做两两比较的T-test这个你可以参考一下；你的数据应该用多个样 本均数的T-test,方差分析也可。用的软件是 SPSS或者SAS。孔板的重复利用：培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。一般