优生ELISA试剂操作注意事项

1、一、风疹病毒抗体筛查免疫功能正常的成人感染风疹病毒一般症状轻微，而孕妇感染风疹病毒却是造成胎儿先天畸形的重要原因之一，特别是在妊娠初期三个月内感染风疹病毒则可能会使胎儿成为先天性风疹综合征患儿，形成多种先天畸形和缺陷。我国约有85%左右的育龄妇女感染过风疹病毒而具备免疫力。建议育龄妇女应在孕前半年筛查风疹病毒IgG抗体，风疹病毒IgG抗体阳性者说明已经具备免疫力，不需要再做风疹病毒抗体相关检测，也不需要注射风疹病毒疫苗；风疹病毒IgG抗体阴性的待孕妇女，建议到具备资质的机构接种风疹病毒疫苗，接种疫苗三个月后再怀孕。二、巨细胞病毒抗体筛查巨细胞病毒是一种全球性的可引发宫内感染造成胎儿损害的最常见

2、的病原体。巨细胞病毒感染是引发智力迟钝的重要原因之一，仅次于唐氏综合征；先天性耳聋患者中也有一半是由巨细胞病毒感染引起。巨细胞病毒人群感染率高，目前尚无疫苗，也无完全安全有效的治疗药物。孕早期原发感染对胎儿造成的损害远远大于继发感染，原发感染中有30-40%导致胎儿感染，可能引起不良结局。预防措施主要是及时准确发现孕早期的原发感染。建议育龄妇女在孕前筛查巨细胞病毒IgG抗体，阳性者可不再做相关检测，阴性者建议在孕早期做巨细胞病毒IgG抗体亲和指数和IgM抗体检测。巨细胞病毒IgG抗体阳性的待孕妇女怀孕后一般不会发生原发感染，孕后可不再做巨细胞病毒抗体检测，但要告知其孕后如有发热、疲倦、头痛、关

3、节肌肉痛、鼻炎、咽炎、咳嗽、转氨酶升高、淋巴细胞数目升高等类似感冒症状出现，应考虑不一定是感冒，而有可能是巨细胞病毒继发感染，应进一步作巨细胞病毒IgG抗体亲和指数和IgM抗体检测。三、弓形体抗体筛查弓形体感染是一种人畜共患性寄生虫病。免疫功能正常的人，弓形体感染不会造成严重危害，但对免疫功能受损的患者影响严重甚至危及生命。当孕妇感染时，不论有无临床表现，弓形体均可通过胎盘传染给胎儿，有30-46%能直接影响胎儿发育，严重致畸甚至死亡，也可造成流产、死产、早产或增加妊娠并发症。弓形体传染源为动物。约有140多种哺乳动物和一些鸟类均有弓形体寄生，并互相传播，也成为人类的传染源。含弓形体卵囊的动物

4、粪便污染了水源可造成人类感染，家畜的肌肉及奶制品中可能含有弓形体包囊，人类食用未熟的肉品、奶制品也可被感染；与宠物密切接触，手、脸部被宠物舔到都可能被感染。由于弓形体感染源清楚、感染途径明确，因此只要告知准备怀孕的妇女在怀孕前半年远离动物、宠物，不生食肉品、奶制品，即可避免弓形体感染，预防效果较好。无动物、宠物接触史和生食肉类史的待孕妇女，只要免疫功能正常，可不考虑弓形体感染问题，不需检测弓形体。建议有动物接触史或生食习惯的待孕妇女孕前检测弓形体IgM抗体，阳性者建议3个月以后再怀孕。孕早期检测弓形体IgM抗体阳性者应积极治疗，基本可以防止宫内感染的发生。一般孕早期治疗效果要好于孕晚期。四、单

5、纯疱疹病毒抗体筛查单纯疱疹病毒分为I型和II型两个血清型，I型主要引起腰部以上、生殖器以外的皮肤粘膜和器官感染，II型引起腰部以下的皮肤粘膜和器官感染，以生殖器区最常见。但近年来也发现I型可引起生殖器感染。我国成人多数已感染过单纯疱疹病毒，I型较多，II型较少。 由于多数妇女已经获得抗单纯疱疹病毒的特异性抗体，故血中单纯疱疹病毒含量很少，先天性宫内感染情况很少发生。据文献报告，1983-2003年近20年间，全世界仅仅报告十几例单纯疱疹病毒宫内感染。因此基本可以不用考虑孕妇单纯疱疹病毒宫内感染，孕前及孕期一般不需作单纯疱疹病毒实验室筛查。孕期若有生殖道单纯疱疹病毒感染体征者，经实验室检测确认感

6、染者，建议行剖宫产术。l ELISA实验中，标本如何采集、保存及注意事项大部分ELISA 检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP 为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。一般说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需20保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，

7、澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。具体注意事项：（1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。 （2）样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则

8、一些细菌的内源性酶，如大肠杆菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 （3）血清标本如是以无菌操作分离，则可以在28下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70以下。（4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。 （5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。l ELISA实验中如何正确加样加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样

9、太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近反应孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上都是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒，这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。一般来讲，正确的加样为将所加物垂直悬空加在ELISA 反应板孔的底部（不要接触反应板底或孔内其它液体成分），避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。l ELISA实

10、验中如何正确温育温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37和室温，其次是43和28。 温育这一步是临床ELISA测定中最容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37 30分钟1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37 12小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中一定要注意以

11、下几点： （1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入恒温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育的时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。 （2）温育温度的选择。在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37下1小时，另一种则为43下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全。如28下反应24小

12、时。较高的反应温度，由于分子运动的加快，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此，我们建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。 （3）“边缘效应”的排除。以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色，比中心孔深，产生这种“边缘效应”的原因可能为96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同。但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25左右）置于37温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存

13、在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至反应板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。 总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，可采用下述简单办法来确保温育条件，即尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反应溶液的温度迅速与温室平衡。l ELISA实验中如何正确洗涤洗涤在ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记

14、物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液

15、中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而降低试验的灵敏度。洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释，应按要求稀释，所用的水电导率最好在1.5us/cm 之下，洗液如果结晶应待其融解后配制。保证洗板浸泡时间为40 秒左右，孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。l ELISA实验中如何正确比色ELISA的比色测定由酶标仪进行，有的同行可能会认为，既然由酶标仪进行，那么此时便可以万事大吉了，其实不然，因为当代较为先进的酶标仪，均有较多的功能，使用不当，会得到令人难以理解的

16、结果。如使用酶标仪比色测定后，有许多阴性测定孔的吸光度值为负数或测定假阳性率大大增加等等。这主要是没有正确地理解和使用酶标仪所致，此处，只是强调下面两点： （1）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。由于有的临床实验室在进行ELISA测定时，以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。 （2）单波长或双波长比色选择的问题。中档以上的酶标仪基本上都同时具有单波长和双波长比色功能。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行

17、比色测定；而双波长双色酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波长下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，一般不必设空白孔。如在使用双波长比色时，仍设空白孔，就可能会造成前面提到的测定孔吸光度为负数的现象。由

18、于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。l ELISA实验中本底及假阳性产生的原因分析1. 基因工程抗原与合成肽抗原的区别1.1 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成

19、肽为包被抗原的试剂盒有效期只有3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试剂盒的灵敏度，提高检出率。d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。1.2 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点：a.分子量太小b.一般只含有一个抗原决定簇c.纯度高d.稳定性差由于基因工程抗原较于合成肽抗原有无可比拟的优越性，ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。就HCV ELISA 试剂盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV 特异性抗原

20、决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV 特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了。由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA 反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。值得欣慰的是也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学得对待反应结果。2假阳性本底产生的原因2.1 抗原因素2.1.1 融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断

21、试剂盒为例为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列，因此可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。2.1.2 错误排序的影响。合成肽在制备过程中，如果某些肽序列错误，会导致合成肽特异性改变而产生假阳性。另外，在构建基因工程表达载体时引入的HCV 核苷酸发生相位改变或点突变也会对抗原的特异性产生不利的影响，但由于基因工程技术的不断进步，由工艺原因造成的抗原特异性降低会逐渐被克服。2.2.3 抗原纯度对特异性的影响。以HCV 抗原为例，利用大肠杆菌大规模表达后需经破碎细胞、盐析、粒子交换柱等分离纯化步骤才能最后的到一定纯度的HCV 抗原。目前的工艺还不能做到

22、抗原纯度为100，因此抗原中还混有大肠杆菌的其它杂蛋白，受过大肠杆菌感染的人，血清中的抗大肠杆菌抗体可和这些杂蛋白产生反应而引起假阳性。2.2 人血清中的正常IgG人血清中IgG 的浓度对HCV 试剂盒有较大的影响。HCV 试剂盒采用的间接法，酶标抗抗体能与人所有IgG 结合，而IgG 吸附于板孔的能力很强，因此我们采用100 微升样稀加10 微升血清来将其稀释以降低本底。到成人时，据统计学调查，成人的IgG 为12mg/ml，而有些人的IgG 浓度会远远高于此，这部分人的血清经ELISA 反应后往往会显色。2.3 人血情中异常的IgG结缔组织病（系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤等）等病症时，血清

23、中的风湿小体和其它异常IgG（IgG 浓度达到50mg/ml）会引起本底升高或假阳性。2.4 溶血的影响当溶血时，红细胞中的血红蛋白释放到血清中，血红蛋白具有过氧化物酶的性质，当其通过吸附或“PP 效应”（蛋白质间相互吸附的现象）结合后，可催化A、B 液显色而造成假阳性。2.5 操作不当引起任何操作不当都会影响结果，因此在操作过程中保证操作的规范，严格按照说明书进行是得到准确结果的关键和基础。2.5.1 加样2.5.1.1 样品稀释液少加，或血清多加，都会引起本底增高。对于间接法来说，受上述两个因素影响更大。因为血清中受检的特异性IgG 只占总IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很强，非特异

24、IgG 可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异的IgG均可以和酶标二抗发生反应而造成较高阴性本底或假阳性。如果加入的血清过多，高于规定的稀释倍数，必将带来阴性高值。2.5.1.2 酶结合物的不正确加入。一般来讲，酶也有一定的非特异吸附，将包被好的酶联板再封闭，一方面也可避免酶的非特异性吸附。通常每孔加入的封闭液为120l。如果加入的酶多于120l 或加在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底升高或假阳性。2.5.2 温育5.2.1 由于试剂盒确定的一定温度下的反应时间并不是反应的终点，升高反应的温度，会加快反应，同样增加时间会延长反应，这样得到的反应程度会比试剂盒确定的反应

25、程度多，也会引起阴性高值或假阳性。5.2.2 由于试剂盒通常设定的反应温度为37 度，在这个温度下放置30 分钟，蒸发的水分会很多，对于整个反应体系来讲，各种反应物的浓度会不断增加，这样必会导致反应最后的值升高。因此温育时应盖上胶贴。5.2.3 试剂盒在设计时，反应是在静置条件下完成的，如果反应改变为振动条件，会加快分子的热运动，增加反应的机会。5.2.4 试剂盒的温育过程是在培养箱中进行，这和水浴的条件不一样。水浴可是酶联板迅速升温，但较难将温度控制在较稳定的温度，往往高于37 度，同样会引起高值阴性。2.5.3.洗板2.5.3.1 各个厂家使用的洗液配方是不同的，是根据各自试剂的条件配制的

26、，采用不配套的洗液常会得到不正常的反应结果，包括本底过高。本公司的洗液采用独特的洗涤系统不能和其它公司的试剂盒混用。2.5.3.2 试剂盒中提供的洗液是浓缩的，应该稀释到规定的倍数使用，过多稀释洗液，会影响洗液的效果，而使反应的本底过高。2.5.3.3 稀释洗液的水应该是新鲜的蒸馏水，电导率小于1.2s。如果水中含有过多的Ca2+、Mg2+，这些离子会占用表面活性剂，影响洗涤效果。2.5.3.4 洗板时，应每孔加满洗液，如果加入的洗液液量不够，对洗涤的效果影响也是很大的。本公司的酶联板板孔为400l，比别的厂家的板孔大，因此洗了别公司的板后要及时调整液量，以避免加液量不满。2.5.3.5 洗板

27、的次数不够孔内多余的抗原（抗体）或酶结合物不能彻底去除，也会因此本底升高。2.5.3.6 洗板的强度和洗板的浸泡时间是密切相关的。洗板机不同，使用的泵不同，液体加入时的冲力不同。如果加入洗液的冲力不大，也没有设定浸泡时间，同样会使结果的A 值偏高。2.5.3.7 洗板完毕后，要进行拍板，尽量采用质量好的毛巾和吸水纸，使用易掉渣的纸，纸屑会留在板孔中，由于纸屑中含有氧化剂而造成高值阴性。2.5.4 显色。加A、B 液准确，顺序不能颠倒，要及时终止显色。终止后要在3 分钟内读数，否则强阳性会变低。2.5.5.枪头、加样槽或其它来源的污染如果使用的枪头、加样槽是反复使用的，必须肯定其没有来自酶或阳性

28、的污染。酶作为反应的催化剂，及其微量也会很明显影响反应。反复使用的枪头、加样槽清洗不当，也会干扰反应。如将枪头使用84 消毒液浸泡而没有冲洗干净，因为84 是强氧化剂，加入AB 液后就会显色。同样枪头和加样槽不正确清洗，改变加入试剂的PH 值，反应的结果也会不正常。常常有人用手纸将加样槽擦干，但是如果使用的手纸容易掉渣，会将纸上的强氧化剂留在槽中而影响反应。2.5.6.测A 值时，微孔条底部不透明、带水滴、有划痕及不规则的表面都可能引起A 值的升高。l ELISA实验中如何进行cut off 值附近血清的处理1.cut off 值附近的值是客观存在的cut off 值指经过大量临床调查后自行制定的判断阴阳性的界限。cut off 值附近的值客观存在基于以下原因：大量