系统原理应用及发展学习教案

1、会计学1第一页，共28页。1 CRISPR-Cas概述概述(i sh)u1987年，日本大阪大学（年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌编码）在对一种细菌编码(bin m)的碱性磷酸酶（的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，发现在这个）基因进行研究时，发现在这个基因编码基因编码(bin m)区域的附近存在一小段不同寻常的区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。特有的序列。u2013

2、以后，研究者们在包括以后，研究者们在包括science和和nature biotechnology等等著名杂志上发表多篇文章介绍著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。第1页/共27页第二页，共28页。1 CRISPR-Cas概述概述(i sh)CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导指导Cas蛋白对蛋白对靶向基因靶向基因(jyn)进行修饰的技术。进行修饰的技术。第2页/共27页第三页，共28页。CRISPR-C

3、as主要由两部分主要由两部分(b fen)组成：组成：识别识别(shbi)(shbi)切割切割(qig)(qig)1 CRISPR-Cas概述概述第3页/共27页第四页，共28页。1.1 CRISPR结构结构(jigu)CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一个特殊的是一个特殊的DNA重复序列家族重复序列家族, 广泛分布广泛分布(fnb)于于细菌和古细菌基因组中。细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复位点通常由短的高度保守的重复序列序列(repeats) 组

4、成组成, 重复序列的长度通常重复序列的长度通常 2148 bp, 重复序列之间重复序列之间被被 2672 bp 间隔序列间隔序列(spacer)隔开。隔开。CRISPR就是通过这些间隔序就是通过这些间隔序列（列（space）与靶基因进行识别。）与靶基因进行识别。第4页/共27页第五页，共28页。1.1 CRISPR结构结构(jigu)第5页/共27页第六页，共28页。1.2 Cas家族家族(jiz)Cas（CRISPR associated）：）： 存在于存在于CRISPR位点附近，是一种双链位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与引导下

5、对靶位点进行切割。它与folk酶功能酶功能(gngnng)类似，但类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。第6页/共27页第七页，共28页。2 CRISPR-Cas系统系统(xtng)的发现的发现 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过(tnggu)对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。切割，从而达到对自身的免疫。第7页/共27页第八页，共28页。2 CRISPR-Cas系统系统(xtng)的发

6、现的发现第8页/共27页第九页，共28页。2 CRISPR-Cas系统系统(xtng)的发现的发现第9页/共27页第十页，共28页。2 CRISPR-Cas系统系统(xtng)的的发现发现 CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫特异性免疫, 而而这种特异性是由间隔序列（这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR 介导介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRI

7、SPR 间隔序列的动态间隔序列的动态性变化，即通过增加性变化，即通过增加(zngji)或删除间隔序列（或删除间隔序列（spacer）来实现的。）来实现的。第10页/共27页第十一页，共28页。2 CRISPR-Cas系统系统(xtng)靶向要求靶向要求最主要最主要(zhyo)的要求：的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）为）为NGG。第11页/共27页第十二页，共28页。2 CRISPR-Cas系统系统(xtng)靶向靶向要求要求 在人类在人类(rnli)基因组中，平均每基因组中，平均每8bp就出现一个就出现一个NGG PAM。第12页/共27页第十三页，共28

8、页。2 CRISPR-Cas系统系统(xtng)靶向靶向要求要求第13页/共27页第十四页，共28页。3 CRISPR-Cas系统系统(xtng)介导基因修介导基因修饰饰第14页/共27页第十五页，共28页。3.1 dual-RNA：Cas介导编辑介导编辑(binj)模板替换模板替换 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上发表的上发表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好系统用设计好的的DNA模板替换的相应

9、模板替换的相应(xingyng)基因来达到基因的定向修饰。基因来达到基因的定向修饰。第15页/共27页第十六页，共28页。3.1 dual-RNA：Cas介导编辑介导编辑(binj)模板替换模板替换第16页/共27页第十七页，共28页。3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上发表的上发表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用一文中，作者利用(lyng)人工合成的人工合成的sgRNAs能指导能指导Cas9

10、内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。第17页/共27页第十八页，共28页。3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰第18页/共27页第十九页，共28页。3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰第19页/共27页第二十页，共28页。3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰Cas9sg-RNA第20页/共27页第二十一页，共28页。 2013年年2月月15日在日在science上发表的上发表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文中，作者利用一个一文中

11、，作者利用一个(y )包含两个靶向不同基因的包含两个靶向不同基因的spacers的的crRNA实现了同时对两个基因实现了同时对两个基因进行编辑。进行编辑。3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰介导双基因修饰 第21页/共27页第二十二页，共28页。3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰介导双基因修饰 第22页/共27页第二十三页，共28页。4 CRISPR-Cas系统系统(xtng)前景分析前景分析 这是一项靶向基因修饰的革新这是一项靶向基因修饰的革新(gxn)技术，一项极具有可技术，一项极具有可能获得诺贝尔奖技术。能获得诺贝尔奖技术。第23页/共27页第二十四页，共28页。4 CRI

12、SPR-Cas系统系统(xtng)前景分析前景分析 2013年年4月月12日在日在cell stem cell上发表上发表(fbio)的的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用一文中，作者利用TALENs和和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和和51%-79%。第24页/共27页第二十五页，共28页。4 CRISPR-Cas系统系统(xtng)前景分析前景分析

13、而且从实际应用的角度来说，而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比比TALENs更容易更容易(rngy)操作，因为每一对操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于都需要重新合成，而用于CRISPR的的gRNA只需要替换只需要替换20个核苷酸就行。个核苷酸就行。第25页/共27页第二十六页，共28页。4 CRISPR-Cas系统系统(xtng)前景分析前景分析u 只需合成一个只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋蛋白不具特异性。白不具特异性。u 编码编码sgRNA的序列不超过的序列不超过100bp，因此比构建，因此比构建TALENs和和ZFNs更简单方便。更简单方便。u 较短的较短的sgRNA序列也避免了超长、高度序列也避免了超长、高度(god)重复的重复的TALENs编码载体带来的并发症。编码载体带来的并发症。技术(jsh)优势第26页/共27页第二十七页，共28页。NoImage内容(nirng)总结会