图解RCR的反应原理类型应用范例ppt课件

1、生物化学实验技术 PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟DNA体内复制的体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。体内体内DNADNA的复制体系的复制体系引物引物引物引物40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶Saiki1988将耐热将耐热DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用热变性解链，使利用热变性解链DNA模板可行。模板可行。PCR反响循环反响循环dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：模板

2、：DNA引物：引物：P1 +P2DNA聚合酶：聚合酶：TaqE原料：原料：dNTP反响缓冲液反响缓冲液10 xBuffer辅助因子：辅助因子：Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。浓度为0.5-2.5mmol/L。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反响特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反响体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反响中游离的Mg2+浓度。逆转录酶逆转录酶聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂交双链杂交双链PCRPCR扩增扩增1. 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处置细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处置后便适于普通后便适于普通

3、PCRPCR试剂包括引物和试剂包括引物和TaqTaq酶进入酶进入2. PCR2. PCR扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段3. 3. 原位杂交检测扩增产物原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达5353SGSGSGSGSGExcitationEmission 实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪梯度梯度PCR仪仪普通普通PCR仪仪1 1、资料：含、资料：含0.3Kb0.3Kb插入片段的克隆载体插入片段的克隆载体2 2、仪器：微量移液器及吸头、仪器：微量移液器及吸头、PCRPCR仪及仪及PCRPCR管管 琼脂糖凝胶电泳设备琼脂糖凝胶电泳设备3 3、试剂：、试剂：10X

4、PCR10XPCR反响缓冲液反响缓冲液 25mmol/L MgCl2 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mmol/L dNTP 10mol/L 10mol/L 引物引物1 1和引物和引物2 2二、实验资料、仪器和试剂二、实验资料、仪器和试剂1.1.反响体系反响体系5050l l体系：体系： 10 X PCR 10 X PCR反响缓冲液反响缓冲液 25mmol/L MgCl2 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mmol/L dNTP 10mol/L 10mol/L 引物引物1 1 10mol/L 10mol/L引物引物2 2 模板模板DNA

5、DNA TaqE TaqE 补充水补充水 三、操作步骤三、操作步骤10 X B10 X P1 P210 X T10 X E 2.2.按照如下体积向按照如下体积向PCRPCR管中按顺序参与各试管中按顺序参与各试剂剂 并混匀：并混匀： 三、操作步骤三、操作步骤10 X Buffer 2.5 L10 X P1 2.5 L10X T 2.5 L10 X E 2.5 L25 L水水 12.5 L10 X P2 2.5 L3.PCR3.PCR扩增程序：扩增程序： 94 5-10min 94 5-10min预变性预变性 94 30S 94 30S 55 30S 55 30S 72 30S 72 30S 72

6、 5- 72 5-10min10min后延伸后延伸 4 4 保温保温30Cycles屏幕显示方式屏幕显示方式MainRun Enter List Edit File Lid运转已运转已有程序有程序已有程已有程序菜单序菜单删除已删除已有程序有程序新建反新建反响程序响程序编辑已编辑已有程序有程序热盖封热盖封锁调理锁调理EnterEnter abcdefghi# jklmnopqr# Name #stuvwxyz#In Use! .,-+/():=#Enter PCR1Control MethodBLOCK Sim-Tube输入文件名输入文件名,满满8个字个字符自动生成程序名符自动生成程序名,不不满

7、满8个字符时用个字符时用#终止终止BLOCK:屏幕显示样品台屏幕显示样品台温度温度(样品台温控方式样品台温控方式)Sim-Tube:屏幕显示反响屏幕显示反响液温度液温度(模拟管温控方式模拟管温控方式)Enter PCR1Segment #1 Hold Cycle END选择预变性保温选择预变性保温循环内第一步温度和时间循环内第一步温度和时间Enter PCR1Hold at 94CHold for 5m0s预变性温度和时间预变性温度和时间Enter PCR1Segment #2Hold Cycle END 3 step PCR循环参数设置循环参数设置Step #194.0C Hold 0m30

8、s循环内步骤数循环内步骤数Step #1Option？ No yes不需求拓展功能不需求拓展功能Step #255.0C Hold 0m40s循环内第二步温度和时间循环内第二步温度和时间Step #2Option？ No yes不需求拓展功能不需求拓展功能Step #372.0C Hold 0m30s循环内第三步温度和时间循环内第三步温度和时间不需求拓展功能不需求拓展功能设置循环数设置循环数后延伸保温后延伸保温后延伸温度和时间后延伸温度和时间Step #3Option？ No yesTotal Cycle= 35Segment #3Hold Cycle ENDHold at 72.0CHold

9、 for 10m0sSegment #4Hold Cycle END选择反响完后保温选择反响完后保温Hold at 4.0CHold for 99m0s设置反响完后的保温温度设置反响完后的保温温度和时间和时间Segment #5Hold Cycle END终止参数设置终止参数设置Enter PCR1Estimated Run Time：1h53m05sSave？ YES no估计反响时间，程序能否估计反响时间，程序能否保管保管LidLIDTurn off heatedLid below 9C当温度低于当温度低于9度时，度时，热盖自动封锁热盖自动封锁RunPCR1 PCR2RUN PCR1Use heated lid? Yes NoRUN PCR1Vessel: 0.2