醋酸纤维薄膜电泳实验

1、tnii学朮友叢网论文发表专家一l醋酸纤维薄膜电泳实验关键词醋酸纤维薄膜；电泳；影响因素；对策keywordscelluloseacetatemembrane;electrophoresis;influencingfactors;countermeasure醋酸纤维薄膜电泳因其有快速省时、分辨能力强、操作简单、成本低廉、透明后利于扫描定量及长期保持等优点，被广泛应用于血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、核酸及其他生物大分子的分析检测，已成为医学和临床检验的常规技术，血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验也成为了生物化学实验课程必开的基础实验项目之一。但该实验影响因素很多，每个环节的失误都会对实验结果产生影响而得不

2、到理想的图谱，并且还造成很大浪费。笔者结合多年的实验教学经验对影响本实验结果的常见因素进行分析探讨，并提出了相应的解决对策。现报道如下：1电泳前准备的影响因素1.1醋酸纤维薄膜的因素1.1.1醋酸纤维薄膜的选择醋酸纤维薄膜如果厚度不一、粗面细孔不均、脆性不一，在电泳时会出现区带不均匀、白色斑点处蛋白质不泳动而影响图谱的效果1。对策：购买知名度相对高的正规厂家生产的产品；将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，如漂浮20s左右时，膜片出现白斑点或条纹，应舍去不用2。1.1.2醋酸纤维薄膜的浸泡由于醋酸纤维薄膜亲水性比较低,匸交发表专家一LB国学朮发叢网浸泡时间过短，不能保证膜片上有一定量的缓冲液，难以使其

3、恢复原来多孔的网状结构，所以浸泡时间不少于30min。浸泡时用镊子将纤维薄膜条粗面向下平稳放入缓冲液中，使其自然湿润沉下液面或用手轻摇装液外盒，不要用镊子、玻棒等器材按压纤维素薄膜沉下液面，也不要同时将多条纤维素薄膜一起放进缓冲液盒。1.2标本的因素1.2.1血清标本的新鲜度不新鲜血清标本蛋白质电泳图谱a2与B之间可能会多出现一条粗而染色均匀的区带，也可能会出现电泳图谱区带不清晰，比较离散，甚至有拖尾现象1。有研究证明，在28C冰箱保存血清标本，第1天与第2天标本中各蛋白质组分百分比变化无统计学意义，从第3天开始，标本中白蛋白百分比下降，a1-球蛋白、a2-球蛋白和B-球蛋白百分比上升均有统计

4、学意义3。因此，必须使用新鲜的血清，如新采取血清标本不是马上用，则必须放4C冰箱贮存保鲜，但时间最多不能超过48h。1.2.2溶血标本溶血标本中白蛋白降低，a2-球蛋白、B-球蛋白升高。严重溶血时可见a2、B球蛋白区带重叠，区带百分比增加4，因此应采用清亮无溶血的血清标本。1.2.3点样标本的替代有文献报道，在实验教学中用鸡蛋白（鸡蛋清：缓冲液=1：9）代替血清作为点样样品，加样量约3卩l,可取得卵转铁蛋白、卵白蛋白、溶菌酶和卵黏蛋白4条电泳区带5。用鸡蛋白作为实验材料，既取材方便，又能节约成本。匸交发表专家一LB国学朮发叢网1.3缓冲液的因素1.3.1缓冲液的离子强度及ph值缓冲液的离子强度

5、应为0.06,ph应为8.6。如离子强度过低缓冲容量小，不易维持缓冲液的ph值恒定，同时导致样品所载电流增加，电泳速度加快，带电颗粒在介质上扩散严重，分辨力明显降低，区带展开延长，导致区带拖尾。ph过高、过低也会影响实验结果。研究证实，随着电泳次数的增加，巴比妥缓冲液的ph发生变化，且阳极变化明显，导致电流强度、蛋白迁移率、蛋向区带均变小，故巴比妥缓冲液实验6次左右就应更换，否则会发生明显拖尾现象7。对策：选择没有失效的分析纯药品；用电子天平准确称取药品，精确到0.001g；配好后用ph计校正；学生多次使用时，应在每次电泳前将正负两极的缓冲液混匀再分别加入电泳槽两极，保证缓冲液ph值稳定或重新

6、配置新的缓冲液。1.3.2缓冲液的替代巴比妥缓冲液中巴比妥有毒性，长期接触会对人体产生伤害，且实验教学中大量使用费用较贵。有实验证明，用硼酸缓冲液（离子强度：0.08；ph8.6）代替巴比妥缓冲液能得到更清晰、更理想的电泳图谱8-9。硼酸缓冲液连续电泳实验10次蛋白仍可分离清晰，这样既减少了避免了巴比妥对操作者的伤害，又减少了成本。1.4点样的因素点样是本实验关键的一步，点样前薄膜的准备、点样器的选择、匸交发表专家一LB国学朮发叢网点样位置的选择、点样的量的多少都直接影响最后图谱的效果。1.4.1点样前薄膜的准备浸泡好的薄膜吸得过干，电泳时电流不易通过薄膜，样品在薄膜上流动困难，易导致电泳图谱

7、有条痕；亦不能留存过多的缓冲液，以避免点样时血清随着缓冲液而扩散开来，导致电泳图谱分离不齐10。因此只要用滤纸轻轻吸取薄膜上的多余水分即可。142点样器的选择传统用载玻片端面点样，因其宽度稍大于薄膜宽度，点样血清会横跨薄膜，产生明显的边缘效应，且有拖尾现象。有文献报道，用自制点样器（将宽为1.3cm的订书针折成0.4cm宽，抛光，再将两头插入小块有机玻璃作为手柄）得到的电泳图谱中蛋白质条带无边缘效应，也无明显拖尾现象11，并且可以在同一张薄膜上点样两次，在实验教学中可增加学生的训练次数。143点样位置的选择点样太靠薄膜边缘，易产生边流现象；点在薄膜光泽面上，则血清不能渗入薄膜，图谱不清晰。所以

8、应点在无光泽面距边缘1.52.0cm处，点样线与薄膜短边平行。144点样的量点样的量太多易导致电泳图谱分离不良或产生拖尾现象；点样的量太少会使图谱区带显色过浅。加样量的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关，如电泳后要用洗脱法定量时，每厘米加样线上加样量为0.10.5匸交发表专家一LB国学朮发叢网卩l，相当于51000卩g;如是血清蛋白常规电泳分离时，加样量不超过每厘米1卩l，相当于6080卩g。对策：对每一种样品的加样量应先做预实验；点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后，再以印章法使点样后的样品呈一条线涂于纤维薄膜12。2电泳时的影响因素2.1搭桥根据电泳槽裁剪大小

9、合适的滤纸或脱脂纱布，使其对折后一端的长边能浸入缓冲液中，另一端的长边与支架前沿对齐。待滤纸完全浸透后，用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸或纱布以驱赶气泡，使其紧贴在膜支架上13。2.2平衡薄膜倾斜放置，电泳图谱会出现要靠近阳极越窄。薄膜搭在滤纸桥时应将无光泽面向下，点样端放在负极，加样线距离桥垫2mm左右；膜条要紧贴滤纸桥不能有气泡；膜条要拉直，不能下垂。盖上电泳槽盖平衡1015min。2.3通电2.3.1通电电压电流电压过高，图谱展开短，蛋白质各组分之间出现挤压，区分困难；反之，以低电压进行电泳时，样品泳动速度慢且易扩散，所呈现的图谱常有“拖尾”现象。总电流要根据放入膜条的多少计算后调节，如果

10、太大会将膜条烧断6。按电场强度1012v/em（指薄膜与滤纸桥总长度），电流强度0.50.8ma/em匸交发表专家一LB国学朮发叢网膜宽（指薄膜数目的总宽度）进行计算，并以控制电流大小为主效果较好14。232通电时间电泳时间的长短跟室温是密切相关的，具体可待电泳区带展开3.54.0cm后关闭电源。3电泳后的影响因素3.1染色染色时间过长，薄膜底色难以脱掉，时间过短，区带不易区分；多条薄膜放入染液时重叠易致染色不良。因此薄膜应一条一条逐次放入染液，保证前一条薄膜染色固定后再放入下一条，并轻轻摇动染色杯，染色10min即可。3.2漂洗漂洗液成分主要为乙醇，易发挥，所以应密封保存或在临用前配制。为节

11、省洗液，用镊子将薄膜从染液中取出时尽量沥去染液。另外，温度对薄膜漂洗结果也有影响，如室温过低，可将漂洗杯放入恒温水浴箱，不能超过25C，能提高漂洗效率，又不影响实验结果15-16。因此，只需准备3杯漂洗液，将薄膜依次放入3份洗液中，每次5min即可达到漂洗的目的。综上所述，影响血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的因素很多，在实际操作过程中想要得到理想的图谱而又不造成浪费和污染，就必须选择最佳的操作条件和操作方法，尽量避免和减少上述影响因素的影响，以达到临床检验和教学实验的目的。匸交发表专家一LB国学朮发叢网参考文献1 翁闪凡,庄锡伟.醋酸纤维薄膜法血清蛋白电泳的影响因素分析与对策j.检验医学与临床，

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