扫描电子显微镜样品制备

1、扫描电子显微镜样品制备扫描电子显微镜样品制备小组成员：裘英华，张国荣小组成员：裘英华，张国荣，薛晓波，薛晓波，储钢，金志华储钢，金志华2010-1-6n扫描电镜相比透射电镜的一大优点：样扫描电镜相比透射电镜的一大优点：样品制备简单。品制备简单。n但不意味着样品制备可以随意进行。忽但不意味着样品制备可以随意进行。忽视样品制备，往往影响检测结果。视样品制备，往往影响检测结果。扫描电子显微镜的成像扫描电子显微镜的成像是靠观察物体表面发射是靠观察物体表面发射的电子。扫描电子显微的电子。扫描电子显微镜是用聚焦电子束在样镜是用聚焦电子束在样品表面扫描。品表面扫描。电子激发电子激发样品表面的原子放电样品表面

2、的原子放电，释放出微细的二次电子，释放出微细的二次电子，用检测装置可以捕获它用检测装置可以捕获它们，然后通过类似电视们，然后通过类似电视机的原理将样品图象呈机的原理将样品图象呈现出来。现出来。1.扫描电子显微镜原理n二次电子对检测器的作用取决于样品表面的性质，当二次电子对检测器的作用取决于样品表面的性质，当电子激发样品表面突起部位时，会有大量二次电子进电子激发样品表面突起部位时，会有大量二次电子进入检测器，而表面凹陷处则只有少量二次电子进入，入检测器，而表面凹陷处则只有少量二次电子进入，所以可以显出所以可以显出反差突出反差突出、明暗清晰的三维图象。而且、明暗清晰的三维图象。而且它的它的成像焦深

3、较长成像焦深较长，图象的立体感强，和肉眼所见差，图象的立体感强，和肉眼所见差别不大。别不大。n制备扫描电子显微镜的样品也先要经过固定、脱水等制备扫描电子显微镜的样品也先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。2. 对样品要求不会被电子束分解。不会被电子束分解。在电子束扫描下热稳定性要好。在电子束扫描下热稳定性要好。能提供导电和导热通道。能提供导电和导热通道。大小与厚度要适于样品台的安装。大小与厚度要适于样品台的安装。观察面应该清洁，无污染物。观察面应该清洁

4、，无污染物。进行微区成分分析的表面应平整。进行微区成分分析的表面应平整。3. 介绍几种样品制备方法n块状样品n粉末样品n生物样品3.1 块状样品制备n块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。n对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导导电胶电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电镜中观察。镜中观察。n对于块状的非导电或导电性较差的材料，要先对于块状的非导电或导电性较差的材料，要先进行镀膜处理，在材料表面形

5、成一层导电膜。进行镀膜处理，在材料表面形成一层导电膜。以避免以避免电荷积累电荷积累，影响图象质量。并可防止试，影响图象质量。并可防止试样的热损伤。样的热损伤。 试样与样品座的粘结情况 (b) 合理粘结合理粘结(a) 不合理粘结不合理粘结 蒸镀膜 试样 粘结剂 试样座n对于金属、岩矿或无机物，切割成要求的尺寸，对于金属、岩矿或无机物，切割成要求的尺寸，粘在样品台上。如果样品数量多，注意样品尺粘在样品台上。如果样品数量多，注意样品尺寸最好一致。寸最好一致。n微区成分分析样品微区成分分析样品表面应该平坦表面应该平坦或经研磨抛光，或经研磨抛光，可以保证检测时几何条件不变。对于样品的断可以保证检测时几何

6、条件不变。对于样品的断口面，要选择起伏不大的部位，最好是分析点口面，要选择起伏不大的部位，最好是分析点附近有小的平坦区。样品表面和底面应该平行。附近有小的平坦区。样品表面和底面应该平行。3.2 粉末样品制备n1直接撒粉法直接撒粉法 将粉末直接撒在清洁光亮的样品台上将粉末直接撒在清洁光亮的样品台上, ,滴一滴滴一滴0.5%0.5%火棉胶醋酸戊脂溶液火棉胶醋酸戊脂溶液于试样边沿于试样边沿, ,火棉胶液火棉胶液立即浸润粉末立即浸润粉末, ,再把试样台水平轻轻晃动几下再把试样台水平轻轻晃动几下, ,使使试样分布平整、均匀试样分布平整、均匀, ,并用电热风并用电热风吹干吹干, ,粉末固定粉末固定在样品台

7、上即可放入电镜内进行观察在样品台上即可放入电镜内进行观察。 优点优点：制样方法简单制样方法简单, ,但均匀性差但均匀性差, ,适应于一适应于一般要求的般要求的粗颗粒样品粗颗粒样品的观察。的观察。n2导电胶粘结法导电胶粘结法 对于对于150150- -500500umum粉末粉末可采用一薄层导电胶将粉可采用一薄层导电胶将粉末粘在已抛光的铜样品台上末粘在已抛光的铜样品台上, ,其其基本做法基本做法是先在样是先在样品台上均匀涂上一层导电胶品台上均匀涂上一层导电胶(Ag(Ag胶、石墨孔胶等胶、石墨孔胶等),),然后将粉末撒在上面然后将粉末撒在上面, ,把试样台面朝下使不与胶层把试样台面朝下使不与胶层接

8、触的粉粒脱落接触的粉粒脱落, ,这样这样, ,在表面留下被导电胶粘结在表面留下被导电胶粘结的均匀一层。的均匀一层。 制样的关键制样的关键：导电胶涂敷要均匀导电胶涂敷要均匀, ,平整平整, ,尽可能薄尽可能薄一些一些, ,否则会造成视场起伏或颗粒下陷于胶体内否则会造成视场起伏或颗粒下陷于胶体内, ,造成立体失真。造成立体失真。n3溶液均匀法溶液均匀法 细粉末的分散好坏是决定测量结果准确性的重要因素。细粉末的分散好坏是决定测量结果准确性的重要因素。当粉末粒子为当粉末粒子为0.50.5- -4 4umum或或小于小于0.50.5umum时时, ,其表面活性很大其表面活性很大, ,常常是以互相粘附的二

9、次粒子状态存在。常常是以互相粘附的二次粒子状态存在。 将粉末颗粒放在将粉末颗粒放在酒精酒精或或乙醚乙醚等清洁且又不与粉末发生反等清洁且又不与粉末发生反应的溶剂中应的溶剂中, ,加入少许加入少许分散剂分散剂( (偏磷酸钠等偏磷酸钠等),),并均匀摇动并均匀摇动或用超声波振荡器和手动搅拌器结合等分散方式或用超声波振荡器和手动搅拌器结合等分散方式, ,使其使其分分散均匀散均匀。用吸管将含粉粒的溶液滴到清洁光亮的样品台。用吸管将含粉粒的溶液滴到清洁光亮的样品台上上, ,再用一根小小的木棒粘上少许酒精在样品台表面上留再用一根小小的木棒粘上少许酒精在样品台表面上留下一层较均匀的粉粒下一层较均匀的粉粒, ,

10、滴一滴滴一滴0.5%0.5%火棉胶醋酸戊脂溶液于火棉胶醋酸戊脂溶液于试样边沿试样边沿, ,并用电热风吹干即可放入电镜内进行观察并用电热风吹干即可放入电镜内进行观察, ,这这种方法特别适合于观察种方法特别适合于观察单颗粒的细微粒子单颗粒的细微粒子。3.3 生物样品制备n超薄切片实际上是样品的二维切片，不能表达细胞超薄切片实际上是样品的二维切片，不能表达细胞的三维结构，而且在观察切片后所拍摄的显微照片的三维结构，而且在观察切片后所拍摄的显微照片时，容易造成错误的印象，用扫描电子显微镜时，容易造成错误的印象，用扫描电子显微镜(SEM)能直接观察标本表面的三维空间结构能直接观察标本表面的三维空间结构，

11、真实地反映，真实地反映各种细胞表面和断裂面的形态特征。各种细胞表面和断裂面的形态特征。n扫描电镜细胞样品的预处理包括取材、固定、脱水扫描电镜细胞样品的预处理包括取材、固定、脱水等。等。 n扫描电镜要求完整且清洁表面，但是在许多样品的扫描电镜要求完整且清洁表面，但是在许多样品的表面常附有粘液、血液、组织液及灰尘等杂物，妨表面常附有粘液、血液、组织液及灰尘等杂物，妨碍着观察，以致造成对图像的错误解释，所以，在碍着观察，以致造成对图像的错误解释，所以，在固定前都必须特别做好固定前都必须特别做好表面的清洁表面的清洁工作。工作。葡萄球菌的细胞表面 红血球 具体具体制备步骤制备步骤n1 、取材、取材 一般

12、原则与超薄切片相似，但用于扫描电镜观察的样品块略大，通常为 5mm 8mm 左右。n2 、清洗、固定清洗、固定 铺片培养的细胞取出浸入磷酸盐缓冲液 （PBS） 中，漂洗细胞表面。然后将细胞铺片放入青霉素小瓶中，加 4 预冷的 3% 戊二醛，在 4 固定 2h 或过夜，吸出固定剂，用 PBS 浸洗 2 次，每次10min ，再用 4 预冷的 1% 锇酸。在 4 固定 1h ，然后用 PBS 浸洗 2 次，每次 10min 。n3、脱水脱水 丙酮 / 醋酸异戊酯(1:1)脱水 10min ，接下来醋酸异戊酯脱水 30min ，或用系列梯度酒精（ 30% 、 50% 、 70% 、 80% 、 90

13、% 、 95% 、 100% ）脱水，每种浓度酒精通过 2 次，每次 15min 。n4 、干燥、干燥 以临界干燥法临界干燥法最理想，但必须要有专门的仪器，只需使用仪器干燥即可。一种消除了物相界面(液相气相)，也就是消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。 当实验室不具备此种仪器时，可采用乙腈干燥法。乙腈干燥法的关键是乙腈置换。将样品浸入 520% 的乙腈溶液中，然后依次更换 70% 、 80% 、 90% 、 95% 、 100% 的乙腈溶液，每次浸泡 15-20min ，最后再换 100% 乙腈。然后进行真空干燥。 n5 、样品导电处理、样品导

14、电处理 将干燥的样品用导电性好的粘合剂或其他粘合剂粘在金属样品台上，用真空喷镀法。4. 镀膜n样品不导电样品不导电，在电子束连续扫描下，表面会积，在电子束连续扫描下，表面会积累负电荷，使样品表面形成一个较强的负电位，累负电荷，使样品表面形成一个较强的负电位，这是这是充电现象充电现象。n样品的负电位抵消掉入射电子部分能量，负电样品的负电位抵消掉入射电子部分能量，负电位使二次电子位使二次电子发射和运动不稳定，图象畸变，发射和运动不稳定，图象畸变，亮度变化无常亮度变化无常。导电样品与样品台。导电样品与样品台粘接不好粘接不好同同样也会发生充电现象。样也会发生充电现象。n镀膜材料的要求：镀膜材料的要求： 导电率好；二次电子产率高；导电率好；二次电子产率高； 常用常用 Au，Pt 或或 Au-Pd C