第四章 酶的分子修饰

1、Contents of chapter 31、酶的提取与分离纯化技术路线3、细胞破碎4、酶的提取5、酶的分离方法GoGoGoGo6、酶的浓缩、干燥与结晶Go7、纯化方案的设计与评价Go2、发酵液的预处理Go酶 工 程Enzyme engineering绪论绪论第一章第一章 酶的基础知识酶的基础知识第二章第二章 酶的发酵生产酶的发酵生产第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第四章第四章 酶的分子修饰酶的分子修饰第五章第五章 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化第六章第六章 酶的非水相催化酶的非水相催化第七章第七章 酶的应用酶的应用第一篇第一篇 酶理论酶理论第二篇第二篇 酶工程酶工程Chapter 4

2、Modification of Enzyme Moleculen酶的分子修饰酶的分子修饰Contents of chapter 4酶的分子修饰酶的分子修饰1、什么是酶分子修饰2、酶分子修饰的基本要求和条件3、酶分子的修饰方法4、酶修饰后的性质变化GoGoGoGo5、化学人工酶Go1.酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰n稳定性不够，不能适应大量生产条件的稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要。需要。n作用的最适条件不符。作用的最适条件不符。n酶的主要动力学性质的不适应。酶的主要动力学性质的不适应。n临床应用的特殊要求。临床应用的特殊要求。酶的在应用中可能出现的问题酶的在应用中可能出现的问题:酶分子

3、改造的方向酶分子改造的方向n核酸水平核酸水平：利用基因操作技术对利用基因操作技术对DNA 或或mRNA 进行改进行改造或修饰，以期获得化学结构（一级结构和空间结构）造或修饰，以期获得化学结构（一级结构和空间结构）更为合理的酶。更为合理的酶。生物酶工程生物酶工程内容之一内容之一n蛋白质水平：人们用化学法或酶法对酶的一级结构进蛋白质水平：人们用化学法或酶法对酶的一级结构进行改造，这包括酶的一级结构中氨基酸的置换，包括行改造，这包括酶的一级结构中氨基酸的置换，包括用酶将肽链切断或部分切除，使酶的空间构象变得更用酶将肽链切断或部分切除，使酶的空间构象变得更为稳定。另一方面是对酶分子中氨基酸残基的修饰。

4、为稳定。另一方面是对酶分子中氨基酸残基的修饰。即即酶的化学修饰酶的化学修饰。生物酶工程 生物酶工程指酶学与以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，主要包括：（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）； 策略： 先在特定的酶的结构基因前加上高效的启动基因序列和必要的调控序列 将此片断克隆到一定的载体 将带有特定酶基因的杂交表达载体转化到适当的受体（细菌或酵母）中，通过发酵方法大量生产所需要的酶（2）对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（突变酶);通过定点诱变技术，改造编码酶分子中的DNA顺序，经过寄主细胞的表达，能产生被改造的新酶。这种遗传修饰，可改变酶的催化活性、底物专一性、最适PH;改

5、变含金属酶的氧化还原能力；改变酶的别构调节功能；改变酶对辅酶的要求；提高酶的稳定性。（3）设计新的酶基因，合成自然界即不曾有的新酶。酶化学修饰的应用领域酶化学修饰的应用领域=在在基础酶学研究基础酶学研究上上4探测探测酶活性必需氨基酸酶活性必需氨基酸的性质和数目的性质和数目4酶酶蛋白一级结构蛋白一级结构的测定的测定4酶的作用机理与催化反应历程酶的作用机理与催化反应历程4酶的固定化技术酶的固定化技术研究活性中心的方法（1）酶的专一性研究（2）酶分子侧链基团的化学修饰法（3）X射线晶体衍射法（4）定点诱变法一级结构测定步骤一级结构测定步骤要点：要点：a a. .测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质

6、分子中多肽链的数目b.b.多肽链的拆分多肽链的拆分（包括二硫键的断裂）（包括二硫键的断裂） c.c.多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段 d.d.确定所得每一种小肽段的氨基酸顺序确定所得每一种小肽段的氨基酸顺序 e.e.鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端残基末端残基 f.f.利用两套肽段上的重叠部位，进行核对拼接，排出整利用两套肽段上的重叠部位，进行核对拼接，排出整个肽链的氨基酸顺序。个肽链的氨基酸顺序。 g.g.确定确定二硫键的位置二硫键的位置基本战略基本战略：片段重叠法氨基酸顺序直测法：片段重叠法氨基酸顺序直测法多肽链的拆分多肽链的拆分（ 方法一方法一S SS S

7、S SS SS SS SHS-CHHS-CH2 2-CH-CH2 2-OH-OHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSCHSCH2 2C00HC00H SCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HICHICH2 2COOHCOOH多肽链的拆分多肽链的拆分（ 方法二：方法二： 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下（解离多肽链之间的非共价力）；应用过甲酸氧化法过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。s ss sHCOOOHHCOOOHSOSO3 3H HSOSO

8、3 3H H+ +- -+ +- -第二向第二向第一向第一向BrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解pH6.5pH6.5图中红色斑点是图中红色斑点是连二硫键的肽段连二硫键的肽段将所得的肽段利用将所得的肽段利用BrownBrown及及HartlayHartlay的的对角线电泳技术对角线电泳技术进行分离进行分离S SS SHCOOOHHCOOOHSOSO3 3H HSOSO3 3H H+ +- -+ +- -第二向第二向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay对角线电泳图解对角线电泳图解pH6.5pH6.5图中图中a a、

9、b b两个斑点是两个斑点是由一个二硫键断裂由一个二硫键断裂产生的肽段产生的肽段=在疾病治疗上在疾病治疗上4克服酶在体内的不稳定性克服酶在体内的不稳定性 4消除或降低酶的抗原性消除或降低酶的抗原性4有助于酶分子到达并集中于病灶细胞有助于酶分子到达并集中于病灶细胞=在工业上的应用在工业上的应用4酶稳定性提高，使生产成本降低酶稳定性提高，使生产成本降低4反应条件的改善和酶寿命的延长导致生反应条件的改善和酶寿命的延长导致生产工艺的技术革新和改进。产工艺的技术革新和改进。酶化学修饰的应用领域酶化学修饰的应用领域2. 酶化学修饰的基本要求和条件酶化学修饰的基本要求和条件（1）了解被修饰酶的性质）了解被修饰

10、酶的性质（2）选择修饰反应条件）选择修饰反应条件（1 1）了解了解被修饰酶的性质被修饰酶的性质酶的稳定性：酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，作包括热稳定性、酸碱稳定性，作用温度以及用温度以及pHpH，酶蛋白解离时的电化学性质，抑，酶蛋白解离时的电化学性质，抑制剂的性质等。制剂的性质等。酶活性中心的状况：酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心的组包括酶分子活性中心的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子等。成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。2. 酶化学修饰的基本要求和条件酶化学修饰的基本要求和条件（1）了

11、解被修饰酶的性质）了解被修饰酶的性质（2）选择修饰反应条件）选择修饰反应条件（2）选择修饰反应条件：）选择修饰反应条件： 修饰反应应尽量在酶稳定条件下进行，并尽修饰反应应尽量在酶稳定条件下进行，并尽 量不破坏酶活性必需基团，修饰率高，活力量不破坏酶活性必需基团，修饰率高，活力回收要高。回收要高。（2）选择修饰反应条件）选择修饰反应条件pH与离子强度：与离子强度：pH决定了酶分子中反应基团的解离状决定了酶分子中反应基团的解离状态，态，酶的解离状态不同酶的解离状态不同，其，其反应性能也不同反应性能也不同；另一方面，；另一方面，有些修饰试剂在有些修饰试剂在不同不同pH下下，与同一种基团反应可以，与同

12、一种基团反应可以形成形成不同的产物不同的产物。离子强度对修饰反应也有重要影响。离子强度对修饰反应也有重要影响。修饰反应的温度与时间：修饰反应的温度与时间：严格控制反应温度和时间可严格控制反应温度和时间可以以减少或消除减少或消除一些非专一性的修饰反应。一些非专一性的修饰反应。反应体系中酶与修饰剂的比例：反应体系中酶与修饰剂的比例：酶与修饰试剂的比酶与修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰程度例可以控制酶分子的修饰程度。（1）酶的表面修饰）酶的表面修饰（2）酶分子的内部修饰）酶分子的内部修饰（3）与辅因子相关的修饰）与辅因子相关的修饰（4）金属酶的金属取代）金属酶的金属取代3. 酶分子的化学修饰方法酶

13、分子的化学修饰方法反相胶团微囊化反相胶团微囊化脂质体包埋脂质体包埋分子间交联分子间交联分子内交联分子内交联酶的大分子修饰作用酶的大分子修饰作用酶的小分子修饰作用酶的小分子修饰作用化学固定化化学固定化（1）酶的表面修饰）酶的表面修饰（1）酶的表面修饰）酶的表面修饰 化学固定化化学固定化：一般是直接通过酶表面的氨基一般是直接通过酶表面的氨基酸残基将酶分子共价连接到酸残基将酶分子共价连接到惰性载体惰性载体上；由于载体上；由于载体的引入，使酶所处的微环境发生改变，进而改变了的引入，使酶所处的微环境发生改变，进而改变了酶的性质，特别是动力学性质发生了改变。酶的性质，特别是动力学性质发生了改变。酶的小分子

14、修饰作用：酶的小分子修饰作用：主要是利用一些小主要是利用一些小分子修饰试剂，通过共价结合来修饰酶的一些分子修饰试剂，通过共价结合来修饰酶的一些基团（如基团（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基、咪唑基等），提高酶的稳定性。常用的小分子修饰试等），提高酶的稳定性。常用的小分子修饰试剂有剂有乙基、糖基和甲基乙基、糖基和甲基等。等。酶的小分子修饰作用酶的小分子修饰作用 对巯基的化学修饰对巯基的化学修饰： 常用的修饰试剂有常用的修饰试剂有烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺等。等。 氨基的化学修饰氨基的化学修饰： 常用的修饰试剂有乙酸酐、常用的修饰试剂有乙酸酐、2，4，

15、6-三硝基苯磺酸、三硝基苯磺酸、2，4-二二硝基氟苯、烷基化试剂、丹磺酰氯硝基氟苯、烷基化试剂、丹磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯和苯异硫氰酸酯（ PITC)等。等。 羧基的化学修饰羧基的化学修饰： 水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反应、甲醇水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反应、甲醇-盐盐酸酯化反应等。酸酯化反应等。 咪唑基的修饰反应咪唑基的修饰反应： 焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。 吲哚基的化学修饰：吲哚基的化学修饰： 2-羟基羟基-5-硝基苄溴、光敏试剂、硝基苄溴、光敏试剂、4-硝基苯硫氯等。硝基苯硫氯等。 甲硫氨酸侧链基团的

16、化学修饰：甲硫氨酸侧链基团的化学修饰： H2O2、光敏试剂、碘代乙酰胺等、光敏试剂、碘代乙酰胺等 二硫键的化学修饰：二硫键的化学修饰： 2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、过甲酸等巯基乙醇、二硫苏糖醇、过甲酸等。 酚基的化学修饰：酚基的化学修饰： N-乙酰咪唑、碘化反应、四硝基甲烷、偶氮化试乙酰咪唑、碘化反应、四硝基甲烷、偶氮化试剂、二异丙基氟磷酸剂、二异丙基氟磷酸。 胍基的化学修饰胍基的化学修饰： 丁二酮、丁二酮、1，2-环己二酮、苯乙二醛等。环己二酮、苯乙二醛等。巯基的化学修饰 n巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰 剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空间构象、特性和功能。n

17、常用：烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺巯基的化学修饰 E E（1）DTNB：5，5-二硫代双（二硫代双（2-硝基苯甲酸）硝基苯甲酸）氨基的化学修饰 三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸羧基的化学修饰 Zn+咪唑基的化学修饰 胍基的化学修饰 反相胶团微囊化反相胶团微囊化脂质体包埋脂质体包埋分子间交联分子间交联分子内交联分子内交联酶的大分子修饰作用酶的大分子修饰作用酶的小分子修饰作用酶的小分子修饰作用化学固定化化学固定化（1）酶的表面修饰）酶的表面修饰糖类的修饰反应：糖类的修饰反应：4右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修饰反应：右旋糖苷是由修饰反应：右旋糖苷是由 -葡葡萄糖通过萄糖通过 -1，6-糖

18、苷键连接而成的高分子多糖，具有良好糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的的生物相容性和水溶性生物相容性和水溶性，其双羟基经过活化后可与酶分子，其双羟基经过活化后可与酶分子上的游离氨基相结合。主要的修饰方法有：上的游离氨基相结合。主要的修饰方法有：溴化氰法溴化氰法、高高碘酸氧化法碘酸氧化法。4糖肽糖肽（ Glycopeptide)的修饰反应的修饰反应: 糖肽是由人纤维蛋白或糖肽是由人纤维蛋白或 - 球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，其分子上具有游离氨球蛋白经蛋白酶水解后得到的产物，其分子上具有游离氨基，活化后可与酶分子上的氨基反应。主要方法有：基，活化后可与酶分子上的氨基反应。主要方法有：2，3-

19、 异氰酸甲苯活化法异氰酸甲苯活化法、戊二醛法戊二醛法。4聚乳糖聚乳糖修饰反应：聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原修饰反应：聚乳糖在一定温度下，通过适当的还原剂可与酶分子上氨基反应。剂可与酶分子上氨基反应。酶的大分子修饰作用酶的大分子修饰作用合成大分子多聚物修饰酶合成大分子多聚物修饰酶4聚聚N - 乙烯吡硌烷酮乙烯吡硌烷酮 (PVP):用水溶性的分子量为用水溶性的分子量为10,000的的PVP,经过开环水解经过开环水解,活化后活化后,与酶结合。与酶结合。4聚乙烯醇聚乙烯醇(PVA):PVA与对硝基苯氧酰氯反应，其硝基再用连二与对硝基苯氧酰氯反应，其硝基再用连二亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基

20、共价连接。亚硫酸钠还原为氨基，与酶分子中的羧基共价连接。4聚丙烯醇聚丙烯醇(PAA):用分子量为用分子量为250，000的的PAA，经过，经过N - 羟基琥羟基琥珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。珀酰亚胺活化后与酶的氨基反应。4聚顺丁烯二酸酐聚顺丁烯二酸酐:用分子量为用分子量为98，000的聚顺丁烯二酸酐，可以的聚顺丁烯二酸酐，可以直接与酶分子的氨基发生反应。直接与酶分子的氨基发生反应。4聚氨基酸聚氨基酸：用分子量为：用分子量为5，700的聚赖氨酸做修饰剂时，其氨的聚赖氨酸做修饰剂时，其氨基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交联。用丙氨酸的二基与酶分子上的羧基通过羰二亚胺产生交联。用丙氨酸的二肽或三

21、肽做修饰剂时，其酸酐可以与酶发生反应。肽或三肽做修饰剂时，其酸酐可以与酶发生反应。天然大分子对酶的修饰反应天然大分子对酶的修饰反应4肝素肝素：肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量：肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量约为约为20，000，是一种含硫酸酯的黏多糖；经过肝素修饰，是一种含硫酸酯的黏多糖；经过肝素修饰的酶具有良好的稳定性，不仅可以提高酶的疗效，而且具的酶具有良好的稳定性，不仅可以提高酶的疗效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。目前常用有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。目前常用羰二亚胺法羰二亚胺法、三氯均嗪法三氯均嗪法和溴化氰法活化肝素，对酶分子进行修饰。和溴化氰法活

22、化肝素，对酶分子进行修饰。4人血清蛋白人血清蛋白：常用：常用戊二醛法戊二醛法、羰二亚胺法羰二亚胺法和活性酯法对人和活性酯法对人血清蛋白进行活化，然后对酶分子进行修饰。血清蛋白进行活化，然后对酶分子进行修饰。活化酯法白蛋白修饰酶活化酯法白蛋白修饰酶是在多肽合成的原理上是在多肽合成的原理上发展而来的。发展而来的。主要过程：主要过程：白蛋白琥珀白蛋白琥珀化化、活性酯形成活性酯形成和和修饰修饰酶酶。主要特点是反应条件温主要特点是反应条件温和，从而避免了活泼的和，从而避免了活泼的双功能团交联剂与酶接双功能团交联剂与酶接触可能引起酶失活，减触可能引起酶失活，减少了修饰反应中副反应少了修饰反应中副反应的发生

23、，提高了修饰酶的发生，提高了修饰酶的活性回收率。的活性回收率。大分子聚乙二醇（大分子聚乙二醇（PEG）修饰：）修饰：利用一些可溶性大分子，通过共价键连接于酶分子的表面，利用一些可溶性大分子，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。形成一层覆盖层，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）是线性大分子，具有良好的生物相容性和是线性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性，被广泛用于酶的修饰。聚乙二醇末端活化后分子的抗原性，被广泛用于

24、酶的修饰。聚乙二醇末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，可以与酶产生交联，使酶分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改变，从而产生许多有用的性质，如可以在导致动力学发生改变，从而产生许多有用的性质，如可以在广泛的广泛的pH范围内溶解范围内溶解等。等。例如用例如用聚乙二醇聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化酶（共价修饰超氧化物歧化酶（SOD），不仅可），不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了半衰期，从而提高了药效。长了半衰期，从而提高了药效。反相胶团微囊化反相胶团微囊化脂质体包埋脂质体包埋分子间

25、交联分子间交联分子内交联分子内交联酶的大分子修饰作用酶的大分子修饰作用酶的小分子修饰作用酶的小分子修饰作用化学固定化化学固定化（1）酶的表面修饰）酶的表面修饰分子内交联：分子内交联： 增加酶分子表面的交联键数目是提高酶稳定性增加酶分子表面的交联键数目是提高酶稳定性的有效方法之一，例如的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶上的羧基上的羧基经过经过羰二亚胺羰二亚胺活化后，然后与酶分子上的氨基活化后，然后与酶分子上的氨基发生交联反应，使酶的稳定性得到改善。发生交联反应，使酶的稳定性得到改善。分子间交联：分子间交联： 利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶交联在利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶

26、交联在一起形成杂化酶。例如用一起形成杂化酶。例如用戊二醛戊二醛把胰蛋白酶和胰把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶凝乳蛋白酶交联在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性。的自溶性。脂质体包埋：脂质体包埋：一些医药用酶，如一些医药用酶，如 SODSOD、溶菌、溶菌酶酶等，由于分子量较大，不易进入人体细胞内，等，由于分子量较大，不易进入人体细胞内，而且在体内半衰期短，产生免疫原性反应；用而且在体内半衰期短，产生免疫原性反应；用脂质体包埋法纪可解决这些问题。脂质体包埋法纪可解决这些问题。 脂质体是天然脂类或类固醇组成的微球体，脂质体是天然脂类或类固醇组成的微球体，酶分子包埋在其内部，可

27、以通过与细胞的膜融酶分子包埋在其内部，可以通过与细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内。合或内吞作用而进入细胞内。 加加H2O 疏水尾部疏水尾部 亲水头部亲水头部 加酶液加酶液 S PEEE 图：反相胶团的结构和酶的分布图：反相胶团的结构和酶的分布反相胶团微囊化：反相胶团微囊化：这是近年来发展起来的酶在这是近年来发展起来的酶在有机相中进行催化的技术，反相胶团中酶的稳定性有机相中进行催化的技术，反相胶团中酶的稳定性大大提高；一些表面活性剂溶解在非极性有机溶剂大大提高；一些表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中时可自发地形成近似球状的反相胶团，反相胶团中时可自发地形成近似球状的反相胶团，反相胶团是表面活性剂

28、的疏水尾部朝外而极性头部朝内的微是表面活性剂的疏水尾部朝外而极性头部朝内的微胶团，其内部可容纳一定量的水，酶溶解在其中避胶团，其内部可容纳一定量的水，酶溶解在其中避免变性（见图）。免变性（见图）。反相胶团微囊化反相胶团微囊化脂质体包埋脂质体包埋分子间交联分子间交联分子内交联分子内交联酶的大分子修饰作用酶的大分子修饰作用酶的小分子修饰作用酶的小分子修饰作用化学固定化化学固定化（1）酶的表面修饰）酶的表面修饰（1）酶的表面修饰）酶的表面修饰（2）酶分子的内部修饰）酶分子的内部修饰（3）与辅因子相关的修饰）与辅因子相关的修饰（4）金属酶的金属取代）金属酶的金属取代3. 酶分子的化学修饰方法酶分子的化

29、学修饰方法（2） 酶分子的内部修饰酶分子的内部修饰非催化活性基团的修饰：非催化活性基团的修饰： 通过对通过对非催化残基的修饰非催化残基的修饰可以改变酶的可以改变酶的动力学性质，动力学性质，改变酶对特殊底物的亲和改变酶对特殊底物的亲和力力；通常可被修饰的氨基酸残基既可以；通常可被修饰的氨基酸残基既可以是亲核的，也可以是亲电子的，还可以是亲核的，也可以是亲电子的，还可以是可氧化残基。是可氧化残基。催化活性基团的修饰：催化活性基团的修饰：通过选择性修饰催化活性氨通过选择性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨基酸残基的取代，使一种氨基基酸的侧链来实现氨基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转化为另一种氨基酸侧链

30、，这种方法又称为酸侧链转化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称为化学突变法化学突变法。酶蛋白主链的修饰酶蛋白主链的修饰( (肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰) ) ：主要是靠主要是靠酶法进行修饰，用蛋白酶对主链进行部分水解，可酶法进行修饰，用蛋白酶对主链进行部分水解，可以改变酶的催化特性。以改变酶的催化特性。肽链伸展后的修饰：肽链伸展后的修饰：酶蛋白经过脲、盐酸胍处理，酶蛋白经过脲、盐酸胍处理，使肽链充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进行修使肽链充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进行修饰，然后在适当条件下，饰，然后在适当条件下，重新进行折叠重新进行折叠。酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰( (肽链有限水解修

31、饰肽链有限水解修饰) )n利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。n酶蛋白主链修饰主要是靠酶切酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/ /酶原激活法。酶原激活法。a a、胃蛋白酶原的激活、胃蛋白酶原的激活 HCl胃胃蛋蛋白白酶酶原原pH1.52（从从N N端端失失去去4 44 4个个氨氨基基酸酸残残基基）自自身身激激活活胃胃蛋蛋白白酶酶b b、胰蛋白酶原（、胰蛋白酶原（trypsinogentrypsinogen）的激活）的激活 -S-S-X静

32、电吸引静电吸引力或氢键力或氢键-S-S-XSSSSc c、胰凝乳蛋白酶原（、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogenchymotrypsinogen）的激活）的激活 （1）酶的表面修饰）酶的表面修饰（2）酶分子的内部修饰）酶分子的内部修饰（3）与辅因子相关的修饰）与辅因子相关的修饰（4）金属酶的金属取代）金属酶的金属取代3. 酶分子的化学修饰方法酶分子的化学修饰方法(3)(3)与辅因子相关的修饰与辅因子相关的修饰 对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修饰：对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修饰： 如果辅因子与酶是非共价结合的如果辅因子与酶是非共价结合的, ,可以将辅因子可以将辅因子共共价价结

33、合于酶分子上；结合于酶分子上； 引入新的具有引入新的具有更强反应更强反应的辅因子。的辅因子。（1）酶的表面修饰）酶的表面修饰（2）酶分子的内部修饰）酶分子的内部修饰（3）与辅因子相关的修饰）与辅因子相关的修饰（4）金属酶的金属取代）金属酶的金属取代3. 酶分子的化学修饰方法酶分子的化学修饰方法（4） 金属酶的金属取代：金属酶的金属取代： 酶分子中的金属离子可以被其他金属离子酶分子中的金属离子可以被其他金属离子取代，可以改变取代，可以改变酶的专一性、稳定性酶的专一性、稳定性等。等。（1）酶的表面修饰）酶的表面修饰（2）酶分子的内部修饰）酶分子的内部修饰（3）与辅因子相关的修饰）与辅因子相关的修饰

34、（4）金属酶的金属取代）金属酶的金属取代3. 酶分子的化学修饰方法酶分子的化学修饰方法4.酶修饰后的性质变化酶修饰后的性质变化（）热稳定性（）热稳定性：一般来说，经过化学修饰的一般来说，经过化学修饰的酶，热稳定性有较大的提高。主要是由于修酶，热稳定性有较大的提高。主要是由于修饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能饰试剂的多个功能基团与酶分子的多个功能基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性基团相互交联增加了酶分子构象的稳定性（表表4-1）。）。（）抗原性（）抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂有关，修饰酶的抗原性与修饰剂有关，目前比较公认的是目前比较公认的是PEG和和人血清白蛋白人血清白蛋白在消在消除酶

35、分子抗原性方面效果较好（除酶分子抗原性方面效果较好（表表4-2）。）。表表4-14-1 天然酶和修饰酶的热稳定性比较天然酶和修饰酶的热稳定性比较 酶酶 修饰剂修饰剂 修饰酶修饰酶 天然酶天然酶 处理条件处理条件(/(/时间时间) ) 残留酶活残留酶活(%)(%)酰苷脱氢酶酰苷脱氢酶 胰蛋白酶胰蛋白酶 过氧化氢酶过氧化氢酶 溶菌酶溶菌酶 尿激酶尿激酶糜蛋白酶糜蛋白酶 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 人血清白蛋白人血清白蛋白 肝肝 素素 37/100min37/100min 100/30min100/30min 50/10min50/10min 100/30

36、min100/30min 37/48h37/48h 37/24h37/24h 7070 100100 4646 6464 4040 9090 2020 9999 8080 0 0 9595 5050酶酶L-Asn L-Asn 酶酶SODSOD酶酶 Gln-Aln Gln-Aln 酶酶尿酸酶尿酸酶腺苷脱氢酶腺苷脱氢酶Arg Arg 酶酶过氧化氢酶过氧化氢酶胰蛋白酶胰蛋白酶抗原性抗原性修饰剂修饰剂 - - 葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶核糖核酸酶核糖核酸酶PEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-AlaPoly-DL-Ala消

37、消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除降降 低低降降 低低消消 除除表表4-24-2 修饰酶的抗原性变化修饰酶的抗原性变化(3)对各类失活因子的抵抗力对各类失活因子的抵抗力:化学修饰酶与天然酶相化学修饰酶与天然酶相比比,对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有不对蛋白酶、抑制剂等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高（表同程度的提高（表4-3）。）。(4)修饰酶在体内的半衰期：修饰酶在体内的半衰期：多数修饰酶在体内的半多数修饰酶在体内的半衰期得到有效延长（表衰期得到有效延长（表4-4）。）。(5)最适最适pH:大多数酶经化学修饰后，最适大多数酶经化学修饰后，最适pH发生

38、了发生了变化，这在应用上具有重要意义（表变化，这在应用上具有重要意义（表4-5）。）。(6)Km 的变化的变化:有些酶经化学修饰后，有些酶经化学修饰后，Km变大，这变大，这可能是由于可能是由于屏蔽效应屏蔽效应引起的。引起的。表表4-3 4-3 天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较天然酶和修饰酶抗失活因子能力比较酶酶抗抑制剂抗抑制剂抗蛋白酶抗蛋白酶修饰剂修饰剂抗失活剂抗失活剂过氧化氢酶过氧化氢酶核糖核酸酶核糖核酸酶溶菌酶溶菌酶胰蛋白酶胰蛋白酶 - - 葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶尿激酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白白蛋白右旋糖苷右旋糖苷抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗蛋白

39、酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗抗SDSSDS抗大豆抑制剂抗大豆抑制剂抗胃蛋白酶抗胃蛋白酶抗胎盘抑制剂抗胎盘抑制剂抗尿素抗尿素抗抗SDSSDS表表4-4 4-4 天然酶与修饰酶的半衰期比较天然酶与修饰酶的半衰期比较酶酶羧肽酶羧肽酶Arg Arg 酶酶Gln-AsnGln-Asn酶酶尿酸酶尿酸酶超氧化物岐化酶超氧化物岐化酶过氧化氢酶过氧化氢酶修饰剂修饰剂半衰期半衰期天然酶天然酶修饰酶修饰酶白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白糖肽糖肽右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷PEGPEG3.5h3.5h17h17h1.4h1.4h1h1h4h4h6min6min6h6h12h12h8h8h20h20

40、h4h4h8h8h表表4-5 4-5 天然酶与修饰酶的最适天然酶与修饰酶的最适pHpH酶酶修饰酶修饰酶天然酶天然酶修饰剂修饰剂糜蛋白酶糜蛋白酶猪肝尿酸酶猪肝尿酸酶吲哚吲哚-3 -3 -链烷羟化酶链烷羟化酶猪肝尿酸酶猪肝尿酸酶产沅假丝酵母尿酸酶产沅假丝酵母尿酸酶白蛋白白蛋白PEGPEGPEGPEG聚丙烯酸聚丙烯酸肝肝 素素10.510.57.4 - 8.57.4 - 8.55.0 - 5.55.0 - 5.59.09.08.88.83.53.58.28.28.28.28.08.09.09.04. 修饰酶的化学性质修饰酶的化学性质（）热稳定性（）热稳定性（）抗原性（）抗原性（）对各类失活因子的抵抗

41、力（）对各类失活因子的抵抗力（）修饰酶在体内的半衰期（）修饰酶在体内的半衰期（）最适（）最适pH（）（）Km 的变化的变化5. 化学人工酶化学人工酶=化学人工酶是根据酶的催化机理，模拟天然酶的生物催化功能，利用有机化学和生物学方法合成的具有专一催化功能的酶模拟物或酶；=依据合成方法，又分为半合成酶和全合成酶，抗体酶就是一种特殊的全合成酶；=此外，科学家还根据有关酶和辅酶的知识，用有机化学合成的方法设计、合成比辅酶分子更小简单的辅酶模型化合物，研究其在非酶促条件下的反应活性和催化机理。5.化学人工酶化学人工酶（1）半合成酶）半合成酶（2）全合成酶）全合成酶 小分子有机物全合成酶 抗体酶 人工聚合

42、物酶（3）辅酶模型化合物）辅酶模型化合物将具有催化活性的金属或金属有机物与具有特异性将具有催化活性的金属或金属有机物与具有特异性的蛋白质相结合；的蛋白质相结合； （1）半合成酶（）半合成酶（Semisynthetic Enzyme)半合成酶：半合成酶：将具有一定结构和功能的将具有一定结构和功能的物质物质与与特异的蛋特异的蛋白质白质相结合，形成的一类新的生物催化剂。相结合，形成的一类新的生物催化剂。半合成酶的合成方法有两种：半合成酶的合成方法有两种： Go将具有特异性的物质与具有催化功能的酶相结合。将具有特异性的物质与具有催化功能的酶相结合。 GoGrayGray与与MargalitMargal

43、it将电子传递催化剂将电子传递催化剂RnRn钌钌(NH(NH3 3) )3 3 3+3+与巨头鲸与巨头鲸肌红蛋白肌红蛋白结合，产生一种半合成的无机结合，产生一种半合成的无机生物酶。肌红蛋白传递氧气，生物酶。肌红蛋白传递氧气， Rn(NHRn(NH3 3) )3 3 3+3+将能将能氧氧化化各种有机物（如抗坏血酸）。各种有机物（如抗坏血酸）。这种人工酶的催化效率接近天然的抗坏血酸氧化这种人工酶的催化效率接近天然的抗坏血酸氧化酶的活力。酶的活力。抗坏血酸氧化酶抗坏血酸氧化酶美国美国SchultzSchultz小组，寡聚核苷酸链连接到金黄色小组，寡聚核苷酸链连接到金黄色葡萄球菌核酸酶的葡萄球菌核酸酶

44、的CysCys116116上（上（ LysLys116116突变成突变成CysCys116116 ）然后，作用于单链然后，作用于单链RNARNA底物上，使底物发生了序底物上，使底物发生了序列特异性切割列特异性切割这是第一个不同于这是第一个不同于DNADNA限制性内切酶的限制性内切酶的RNARNA限制限制性内切酶性内切酶（2）全合成酶）全合成酶=这类人工酶不是蛋白质（抗体酶除外），而是这类人工酶不是蛋白质（抗体酶除外），而是一些一些有机化合物有机化合物通过引入通过引入酶的催化基团酶的催化基团来控制来控制空间构象，象天然酶那样能选择性地催化化学空间构象，象天然酶那样能选择性地催化化学反应。全合成酶

45、又分为：反应。全合成酶又分为：4小分子有机化合物小分子有机化合物 ：是利用各种有机分子（如：是利用各种有机分子（如 -环糊精、卟啉等）和金属离子制备的具有水环糊精、卟啉等）和金属离子制备的具有水解、氧化还原或转氨等功能的全合成酶。解、氧化还原或转氨等功能的全合成酶。4抗体酶抗体酶：具有催化活性的抗体；是利用分子印：具有催化活性的抗体；是利用分子印迹技术制备的人工酶。迹技术制备的人工酶。4人工聚合物酶人工聚合物酶：制备原理与抗体酶相同，只是：制备原理与抗体酶相同，只是以以人工聚合物人工聚合物代替了抗体代替了抗体。 小分子有机物全合成酶小分子有机物全合成酶 ： 是利用各种是利用各种有机分子有机分子

46、（如（如 -环糊精、卟啉等）和环糊精、卟啉等）和金属离子金属离子制备的具有水解、氧化还原或转氨等制备的具有水解、氧化还原或转氨等功能的全合成酶。功能的全合成酶。 1985年年Bender等人用等人用 -环糊环糊精的空穴作为底物结合部位，精的空穴作为底物结合部位，以连在环糊精上的以连在环糊精上的羧基羧基、咪咪唑基唑基及环糊精自身的一个及环糊精自身的一个羟羟基基共同构成催化中心，制备共同构成催化中心，制备了名为了名为-Benzyme的胰凝乳蛋的胰凝乳蛋白模拟酶白模拟酶. 其中胰凝乳蛋白模拟酶催化其中胰凝乳蛋白模拟酶催化简单酯反应的速率和天然酶简单酯反应的速率和天然酶接近，但接近，但热稳定性热稳定性

47、与与pH稳定稳定性大大优于天然酶，模拟酶性大大优于天然酶，模拟酶的活力在的活力在80仍能保持，在仍能保持，在pH213的大范围内都是稳定的大范围内都是稳定的。的。 由环糊精制成的人工转氨酶由环糊精制成的人工转氨酶能催化第一酮酸与磷酸吡哆能催化第一酮酸与磷酸吡哆胺专一性地合成氨基酸胺专一性地合成氨基酸 其催化对叔丁基苯乙酸酯比天然酶快一倍其催化对叔丁基苯乙酸酯比天然酶快一倍氨肽酶全合成酶氨肽酶全合成酶：由三乙撑四胺（：由三乙撑四胺（TrienTrien）的）的CoCo3+3+络合物络合物转氨全合成酶转氨全合成酶：GlyGly与与AlaAla的西佛氏碱的的西佛氏碱的CuCu2+2+络合络合物物AT

48、PATP水解全合成酶水解全合成酶：CoCo3+3+Edda(HEdda(H2 2O O2 2) )2 2 - -GlyC=N-Ala O5.化学人工酶化学人工酶（1）半合成酶）半合成酶（2）全合成酶）全合成酶 小分子有机物全合成酶小分子有机物全合成酶 抗体酶抗体酶 人工聚合物酶人工聚合物酶（3）辅酶模型化合物辅酶模型化合物 抗体酶（抗体酶（Abzyme):=20世纪世纪80年代以来出现的一种具有催化活性的年代以来出现的一种具有催化活性的蛋白质，是利用生物学和化学的成果在分子水蛋白质，是利用生物学和化学的成果在分子水平上交叉渗透研究的产物；平上交叉渗透研究的产物；=抗体酶：抗体酶：其本质上是免疫

49、球蛋白，只是在其易其本质上是免疫球蛋白，只是在其易变区被赋予了酶的属性，因此抗体酶又称为催变区被赋予了酶的属性，因此抗体酶又称为催化抗体（化抗体（Catalytic Antibody)。4抗体酶的理论基础：抗体酶的理论基础：4半抗原与催化性抗体：半抗原与催化性抗体：4抗体酶的制备方法：抗体酶的制备方法：n抗体：是在动物体针对注射抗原产生抗体：是在动物体针对注射抗原产生 的，能特异与这种抗原结合的免疫球的，能特异与这种抗原结合的免疫球 蛋白。即：动物为对抗外来物质的入蛋白。即：动物为对抗外来物质的入 侵而合成的一种蛋白质。侵而合成的一种蛋白质。n抗原：能启动机体的免疫应答，且能与其应答产物结合，

50、并发抗原：能启动机体的免疫应答，且能与其应答产物结合，并发生一系列生物学效应的物质。抗原一般具备两种特性：一是生一系列生物学效应的物质。抗原一般具备两种特性：一是免免疫原性疫原性，即能刺激机体产生免疫应答（特异性抗体）；二是，即能刺激机体产生免疫应答（特异性抗体）；二是抗抗原性原性，指能与抗体特异性结合。，指能与抗体特异性结合。n完全抗原：同时具备免疫原性和抗原性的称为完全抗原完全抗原：同时具备免疫原性和抗原性的称为完全抗原n半抗原（半抗原（hapten）：只具备抗原性而不具备免疫原性的，也称）：只具备抗原性而不具备免疫原性的，也称不完全抗原（不完全抗原（incomplete antigen）

51、。外来的小分子不会刺激动）。外来的小分子不会刺激动物体产生抗体，但若他们与大分子结合后，则能诱导抗体的形物体产生抗体，但若他们与大分子结合后，则能诱导抗体的形成。成。抗体酶的理论基础抗体酶的理论基础Pauling(1948)过渡态结构理论：过渡态结构理论：酶与抗体的重要区别：酶能够结合并稳定化学酶与抗体的重要区别：酶能够结合并稳定化学反应的过渡态，降低反应的活化能；而抗体结合反应的过渡态，降低反应的活化能；而抗体结合的抗原只是一个基态分子。的抗原只是一个基态分子。相同点：酶分子与它催化反应的过渡态互补，相同点：酶分子与它催化反应的过渡态互补，抗体与抗原互补；酶和抗体都是有生物活性的蛋抗体与抗原

52、互补；酶和抗体都是有生物活性的蛋白质。白质。 Lerner(1984)提出：若以提出：若以过渡态类似物为半抗过渡态类似物为半抗原原，则其诱发，则其诱发产生的抗体应该与该类似物具有互产生的抗体应该与该类似物具有互补构象补构象；这种抗体与过渡态类似物结合后，从而；这种抗体与过渡态类似物结合后，从而引起催化引起催化作用。作用。1986 年年Lerner和和Schultz两个研究小组独自发表两个研究小组独自发表了关于芳香酯了关于芳香酯(aryl esters) 和碳酸酯和碳酸酯(carbonates) 的抗体催化水解的报道。首次证实由的抗体催化水解的报道。首次证实由过渡态类似过渡态类似物为半抗原物为半

53、抗原,通过杂交瘤技术产生的抗体具有类似通过杂交瘤技术产生的抗体具有类似酶的催化活性。酶的催化活性。 1986年年Lerner研究组在研究组在Science上发上发表了抗体酶研究的实验结果，标志着表了抗体酶研究的实验结果，标志着抗体抗体酶的研究进入了一个新阶段酶的研究进入了一个新阶段。l转酰基反应转酰基反应l水解反应水解反应lClaisen重排反应重排反应l酰胺合成反应酰胺合成反应lDiels-Alder反应反应l转酯反应转酯反应l光诱导反应光诱导反应l氧化还原反应氧化还原反应l脱羧反应脱羧反应l顺反异构化反应顺反异构化反应 抗体酶（抗体酶（Abzyme):4抗体酶的理论基础：抗体酶的理论基础：

54、4半抗原与催化性抗体半抗原与催化性抗体：4抗体酶的制备方法：抗体酶的制备方法：半抗原与催化性抗体半抗原与催化性抗体半抗原设计中应考虑：半抗原设计中应考虑：产生的抗体能否具有预期的产生的抗体能否具有预期的催化活性催化活性能否刺激机体能否刺激机体免疫应答免疫应答半抗原结构与催化抗体之间的关系：半抗原结构与催化抗体之间的关系：半抗原结构中应含有半抗原结构中应含有芳香结构芳香结构（具较强的免疫原性）（具较强的免疫原性）催化抗体和半抗原的催化抗体和半抗原的亲和力亲和力，一般认为结合常数，一般认为结合常数KiKi应小于应小于1010- -6 6mol/Lmol/L，容易获得高效催化抗体；，容易获得高效催化

55、抗体；诱导羧酸酯、酰胺水解的催化性抗体，可利用其具有诱导羧酸酯、酰胺水解的催化性抗体，可利用其具有四面体结四面体结构的高能过渡态类似物构的高能过渡态类似物为抗原为抗原半抗原设计应考虑催化反应的环境与反应机制，即所设计的半半抗原设计应考虑催化反应的环境与反应机制，即所设计的半抗原应能诱导催化抗体在其抗原结合部位抗原应能诱导催化抗体在其抗原结合部位创造出特定的有利创造出特定的有利于催化反应的环境于催化反应的环境（疏水微环境疏水微环境） 抗体酶（抗体酶（Abzyme):4抗体酶的理论基础：抗体酶的理论基础：4半抗原与催化性抗体：半抗原与催化性抗体：4抗体酶的制备方法：抗体酶的制备方法：诱导法：诱导法

56、：用设计好的抗原按照一定的单用设计好的抗原按照一定的单克隆程序，获得具有催化活性的抗体。克隆程序，获得具有催化活性的抗体。aa过渡态类似物过渡态类似物载体蛋白载体蛋白抗体酶抗体酶抗体酶的制备方法抗体酶的制备方法博莱克博莱克(Pollack)等以硝基苯酚磷酸胆碱酯作为半抗原诱导产生单等以硝基苯酚磷酸胆碱酯作为半抗原诱导产生单抗，经筛选找到加快水解反应抗，经筛选找到加快水解反应1.2万倍的抗体酶。万倍的抗体酶。抗体酶的制备方法抗体酶的制备方法拷贝法拷贝法：用已知的酶作为抗原对动物进行第一次免疫用已知的酶作为抗原对动物进行第一次免疫, ,获获得抗酶抗体得抗酶抗体; ;再用抗酶抗体作为抗原进行第二次免

57、疫获得抗抗再用抗酶抗体作为抗原进行第二次免疫获得抗抗体体, ,抗抗体实际上就是具有原来酶活性的抗体酶。抗抗体实际上就是具有原来酶活性的抗体酶。酶酶第一次免疫第一次免疫抗酶抗体抗酶抗体第二次免疫第二次免疫抗体酶抗体酶引入法引入法n将将催化基团催化基团或或辅助因子辅助因子引入引入到到抗体的抗原结合部位抗体的抗原结合部位, ,一一般可采用两种方法般可采用两种方法: :即即选择性化学修饰法选择性化学修饰法和和基因工程定基因工程定点突变法点突变法。n以底物为半抗原所产生的抗体应当具有以底物为半抗原所产生的抗体应当具有底物结合部位底物结合部位, , 然后在此抗体的结合部位上然后在此抗体的结合部位上引入催化

58、基团引入催化基团；如果引入；如果引入的催化基团与底物结合部位取向正确、空间排布恰到的催化基团与底物结合部位取向正确、空间排布恰到好处好处, , 则应产生高活力抗体酶则应产生高活力抗体酶. .n罗贵民领导的研究小组开发了一种化学诱罗贵民领导的研究小组开发了一种化学诱变具有底物结合部位的单克隆抗体制备变具有底物结合部位的单克隆抗体制备含含硒抗体酶硒抗体酶的方法。的方法。n该方法的原理是该方法的原理是, ,抗体可变区一般含有抗体可变区一般含有3 34 4 个丝氨酸个丝氨酸(Ser) (Ser) 残基残基, ,而而Ser Ser 可用化学修饰可用化学修饰法转化为硒代半胱氨酸法转化为硒代半胱氨酸(SeC

59、ys) ,(SeCys) ,而而SeCysSeCys 是是谷胱甘肽过氧化物酶谷胱甘肽过氧化物酶( GPX) ( GPX) 不可缺少的不可缺少的催化活性基团催化活性基团。n先用标准的单抗制备法获得具有谷胱甘肽先用标准的单抗制备法获得具有谷胱甘肽( GSH) ( GSH) 结合部位的单抗结合部位的单抗, ,再用苯甲基磺酰再用苯甲基磺酰氟氟( PMSF) ( PMSF) 活化活化Ser Ser 的羟基的羟基, ,相继以氢化硒相继以氢化硒(H(H2 2Se) Se) 处理处理, ,则将单抗结合部位上的则将单抗结合部位上的SerSer突突变成硒代半胱氨酸变成硒代半胱氨酸( (SeCysSeCys) ,)

60、 ,因而在单抗结因而在单抗结合部位上引入了酶的催化基团。这样合部位上引入了酶的催化基团。这样, ,单抗单抗的结合部位上既有底物结合部位的结合部位上既有底物结合部位, ,又有催化又有催化基团基团, ,因而会显示出因而会显示出GPXGPX活性活性20022008固氮酶固氮酶结构舆功能及其防结构舆功能及其防氧保证机制研究氧保证机制研究、酶稳酶稳定剂定剂的开发研究的开发研究、提高提高超氧化物岐化酶活力超氧化物岐化酶活力和稳定和稳定性的研究性的研究、含硒人工酶含硒人工酶研究研究等项目的研究工作。等项目的研究工作。v近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒硒代半胱氨酸代半胱氨酸，