AB7500荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程

1、颁发部门制订人：复核人：批准人：质保部制订日期：复核日期：批准日/月：执行日期版本1.0编号 SOP04006制作份数修订记录份修订人发送部门修订原因修订内容版 本修订日 期1.2 .目的：确保荧光定量PCR仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。3 .4 .范围：适用于AB7500荧光定量PCR仪的使用及维护。5 .6 .定义：无7 .8 .职责：荧光定量PCR仪使用人员负责本规程的实施。质保部对本规定的有效执行承担监督检查责任。9 .10 .内容：5.1室内温度控制在1530,相对湿度4575%。5.2 仪器操作5.2.1 依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入W

2、indows界面。5.2.2 接着打开AB7500仪器电源开关，预热10分钟。5.2.3 点击7500 Software v2.3图标，打开软件。5.2.4 按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测的8联PCR反应管或者96孔PCR反应 板放入检测孔位，记下放置位置。检测8联PCR反应管用*反应孔模块，检测96孔PCR反应板用 *反应孔模块。（检测8联PCR反应管需放入盖紧管盖的空8联PCR反应管配平，检测96孔PCR 反应板无需配平）5.2.5 再次按压托盘使其滑入仪器。5.2.6 新建扩增参数模板：例如新建一个UG-63-62的模板，扩增参数是95°，10'；（9

3、5°，10"； 63°， 45"）x5 cycles；（95°，10"； 62°，35"）x40 cycles，在 62°时收集荧光信号（HEX、FAM 信号）， 203反应体系。5.2.6.1 在 Setup-Plate Setup-Define Targets and Samples中，将 Target Name 下的 Targetl 改成 FAM； 点击Add New Target将新增的Target1改成HEX，点击Reportee下拉菜单，选择VIC。5.2.6.2 在 Setup-Run Me

4、thod-Graphical View中的 Reaction Volume Per Well后面输入 20 （203反应 体系）。选中第一个 Holding Stage,点击 Delete Selected 删除；在 Cycling Stage 中的 Number of Cycles后输入5,在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度63度，输入时间45秒，将 63度下面收集荧光图标点掉;点击Add Stage下拉菜单选择Cycling，在Cycling Stage中的Number of Cycles后输入40，在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度62度，输入时间35

5、秒， 在62度下面点击图标收集荧光。3点击Save下拉菜单下的Save As Tamplate，文件名输入UG-63-62，保存在默认ab7500-config-tamplates文件夹内，关闭设置界面。5.2.7 已有扩增参数模板：在软件Home界面中点击Template,选择需要的模板，点击打开。例如： UG-63-62,其扩增参数就是95°，10'；（95°，10"； 63°，45"）x5 cycles；（95°，10"； 62°，35"） x40 cycles，在 62°时收集荧

6、光信号（HEX、FAM 信号），Reaction Volume Per Well:20pl（203反 应体系）。5.2.8 在 Setup-Plate Setup-Assign Targets and Samples 中选择 8 联管摆放的位置，全部勾选 Sample 1； UGT1A1*6 勾选 HEX，UGT1A1*28 勾选 FAM。5.2.9 在Run-Amplification Plot中点击START RUN，命名为（当日日期+当日上机次数，例:2014年 1月1日第1次上机编号为），保存在默认文件夹中，开始运行。结果分析PCR反应结束后自动保存结果，对扩增曲线进行分析。也可根据分

7、析后图像调节Baseline的Start值、End值以（用户可根据实际情况自行调整，Start值可 以在315、End值可设在520），Threshold值（Rn）推荐设定为500015000，点击Analyze 进行分析，然后到Plate窗口下记录每个反应的Ct值。实验结束后取出反应管（切勿打开管盖），顺序关闭AB7500软件、定量PCR仪电源，关闭电脑。5.3 仪器维护5.3.1 每周维护检查计算机磁盘空间。如需要，将实验文件归档或备份。至少每周检查一次计算机磁盘空间。如果硬盘的可用空间不足其总容量的20%，应将较陈旧的数据传输到备份存储设备上保存。Instrumento）使用75%酒精浸

8、泡反应管托架（晾干后放回仪器内）。5.3.2 每月维护执行背景校准。（可执行一次背景校准以检查是否存在污染物）运行磁盘清理和磁盘碎片整理。 至少每月一次。 当Windows®操作系统显示消息提示执行碎片整理时。 切勿同时运行磁盘管理实用工具和7500 Real-Time PCR Software。5.3.3 每半年（6个月）维护1检查灯具状态。在 7500 Software 中，选择 Instrumentf Lamp Status/Replacement 以确定卤素灯的状态。显示 Lamp Status/Replacement对话框： Condition -表示以下其中一种状况：-G

9、ood -灯具工作良好，不需要更换。单击Closeo-Failed -必须更换灯具。单击Close,然后按照步骤更换卤素灯。-Change Soon -灯具使用超过2000小时；生产商建议将其更换。单击Close,然后决定是否更换灯具。如果决定更换，请按照步骤更换卤素灯。, Usage (Hours)-灯具已照明的总小时数。 Lamp Current -灯具的输出电流，以安培为单位(A)。低电流意味着灯具可能将要失效。, Date Last Replaced -上次更换灯具的日期。在执行一次运行之前或期间，7500 Software可能显示以下警告:消息描述Warning - Cannot d

10、etect sufficientcurrent from lamp. Either lamp is notinstalled properly or needs to bereplaced.在运行开始时，灯具电流低于可接受水平。在按照步骤更换卤素灯具之前，无法继续该运 行。Warning - Cannot detect sufficientcurrent from lamp. Either lamp is notinstalled properly or needs to bereplaced.7500 Software停止了该次运行，因为在运 行中灯具电流下降到可接受水平之下。在按照 步骤更

11、换卤素灯具之前，无法继续该运行。在 消息框中单击OK,检查仪器日志，然后更换 灯具。Warning - The lamp usage hasexceeded 2000 hr. We recommendreplacing the lamp soon to ensure optimal assay performance.在运行开始时，灯具使用时间超过2000小 时。单击Cancel Run，然后更换灯具，或者 单击Continue Run。重新运行ROI、背景、 光学和染料校准。执行目标区(ROI)校正。执行背景校准。执行光学校准。执行染料校准。执行RNase P仪器验证试验。5.3.4其它维护

12、任务（需要时执行）样本块污染清除。执行以下程序，去除7500 Instrument样本块的荧光污染。荧光污染是导致背景运行失败的常 见原因，在此情况下，一个或多个反应孔会持续表现出异常的高信号。注意！切勿移去设备上的盖板。7500 Instrument中没有用户可安全维修的组件。如果怀疑存 在问题，请联系生产商服务代表。全程戴上一次性无粉手套操作。找到样本块中受污染的反应孔（参阅“如何确定污染”）。从7500 Real-Time PCR Instrument中取出反应板和托盘支架。a.按压托盘门，将其打开。b.取出反应板和托盘支架。c.关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。手动降低样本块：

13、b.在 Instrument Maintenance Manager 的 ROI 选项卡中，单击 Start Manual Calibration。c 在 ROI Inspector 对话框中，单击 Move Block。d.当 ROI Inspector 对话框显示 “Block Down” 时，单击 Done。关闭7500 Real-Time PCR Instrument,然后拔下其电源电缆。允许仪器冷却15分钟。打开 7500 Real-Time PCR Instrument 的检查门。a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。b.打开仪器前门。抬起门栓，然后将受热

14、的护盖门推到仪器的背面。使用少量的双蒸水，清洁样本块中被污染的反应孔：a.用移液管吸取少量双蒸水并滴入每个受污染的反应孔中。b.抽吸并滴入反应孔中的双蒸水数次，以冲洗反应孔。c.将用过的双蒸水水吸入废液瓶中。d.使用棉花拭子，擦试每个被污染的反应孔的内壁。e.使用无绒布料，吸出残余的双蒸水。7500 Real-Time PCR Instrument将受热的护盖门拉到仪器的正面。抬起门栓，然后将受热 的护盖门紧固到交叉杆。通过执行背景校准运行确认已消除污染（参阅5.4.2 “背景校准”）。如果污染仍然存在，重复步骤至，然后使用95%乙醇溶液清洁样本块中受污染的反应 孔：a.用移液管吸取少量95%

15、乙醇溶液并滴入每个受污染的反应孔中。b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。c.将用过的乙醇溶液吸入废液瓶中。重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用双蒸水冲洗反应孔。重复步骤至，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。如果污染仍然存在，重复步骤至，然后使用10%漂白剂溶液清洁样本块中受污染的反 应孔：a.用移液管吸取少量10%漂白剂溶液并滴入每个受污染的反应孔中。b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。c.将用过的漂白剂溶液吸入废液瓶中。重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用去离子水冲洗反应孔。重复步骤至，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清

16、除掉污染物。如果仍有污染，请与 生产商技术支持联系。确保受热盖门完全关闭并上闩。如果没有，则7500 Software显示错误消息。2移动PCR仪。（更换或移动光学器件的任何部件后，必须执行ROI校准、背景校准、光学校准、染 料校准以及RNase P仪器验证。）3更换卤素灯。全程戴上一次性无粉手套操作。关闭7500 Instrument，然后拔下其电源电缆。允许仪器冷却15分钟。a.注意！灼热。7500 Instrument和灯具灼热！灯具在使用中会变得非常灼热。在处理灯具 之前，应允许灯具冷却15分钟，并戴上无粉防护手套。b.重要！为避免灼伤及缩短新灯具的使用寿命，处理灯具时请戴上一次性无粉

17、手套。c.注意！ 7500 Instrument按设计仅可使用12V、75W的卤素灯。打开7500 Instrument的检查门。a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。b.打开仪器前门。从仪器中取出灯具：a.向下滑动灯具释放杆。b.用手紧紧地抓住卤素灯并向上提，使灯具从安装槽口中脱出。ab查看灯具并确定有无故障迹象（有故障的灯具内壁上通常有碳黑层）。将新灯具安装至仪器上：a.向上滑动灯具释放杆。b.用手紧紧地握住灯具，将灯具放入带槽口的安装座内，然后小心地向下滑动灯具，使其到 位。关闭仪器前门。插上电源插头并开启7500 Instrumento打开ROI Inspec

18、tor对话框：a,在 7500 Software 中，选择 InstrumentInstrument Maintenance Manager。b.在 Instrument Maintenance Manager 的 ROI 选项卡中，单击 Start Manual Calibration。在 ROI Inspector 对话框中，选择 Lamp Control Idle。当仪器运行时，通过检查门上的缝隙观察，确保灯具发光，然后单击Doneo如果灯具发光，在 7500 Software 中选择 Instrumentf Lamp Status/Replacement,单击 Reset Lamp T

19、imer，然后单击OK。如果灯具不发光，则替换的卤素灯可能有缺陷。重新更换 灯具。如果再次更换灯具后仍不发光，检查仪器的保险丝是否存在故障（参阅第71页）。更换灯具后，按顺序执行以下校准。请参阅： 5.4.1目标区（ROI）校准 5.4.2背景校准 5.4.3光学校准 5.4.4染料校准 5.4.5验证仪器性能4 更换 7500 Instrument保险丝。保险丝损坏时，更换7500 Real-Time PCR Instrument保险丝。（注意！为在长时间内防止 火灾，更换保险丝时请使用类型和额定值与仪器原始保险丝相同的经认可的保险丝。）全程戴上一次性无粉手套操作。关闭仪器电源，并拔下电源插

20、头。使用平口螺丝刀从仪器上旋松并卸下保险丝座。将每一个保险丝从其保险丝座中取出，然后检查是否损坏。损坏的保险丝内部通常有炭黑覆 盖。使用12.5A、250V、5X20mm保险丝更换损坏的保险丝。注：电压和电流额定值见保险丝座。安装保险丝座。插上电源插头，然后开启仪器。如果仪器接通了电源，说明保险丝已安装成功。注：保险丝损坏可能是由仪器供电电源波动导致。为了防止继续出现故障，可以考虑安装电气 保护设备，例如UPS或其他电涌保护器。5更新Windows®操作系统。更新 7500 Softwareo7监控仪器状态(使用Function Test对话框对主要7500 Instrument组件

21、执行高级诊断。一般情况下 不需要执行功能测试，除非怀疑有硬件故障，或者Life Technologies代表指示这样做。)在 7500 Software 中，选择 Instrumentf Function-Test。根据需要执行功能测试。要测试： 所有组件-单击All Tests,然后等候软件执行所有功能测试。 一个或多个特定组件-单击以下其中一项或多项。 USB-测试7500 Real-Time PCR Instrument和计算机之间的通用串行总线(USB)连 接。如果7500 Software能够和7500 Real-Time PCR Instrument建立通信，则表示测试 通过。 C

22、CD -测试7500 Real-Time PCR Instrument内的CCD摄像机。如果摄像机能够拍摄 图像，则表示测试通过。 Filter Wheel -测试7500 Real-Time PCR Instrument内的过滤轮。如果过滤轮控制器 运行正确版本的固件，则表示测试通过。 Shutter-测试7500 Real-Time PCR Instrument的光学快门。如果快门控制器运行正 确版本的固件，则表示测试通过。 Lamp -测试7500 Real-Time PCR Instrument的卤素灯。如果灯具控制器运行正确版 本的固件，则表示测试通过。循环仪的控制器运行正确版本的固

23、件，则表示测试通过。当7500 Software完成一项测试时，软件报告该测试的通过/失败状态，并提供结果描述。结束测试时，单击Close。5.4仪器校准5.4.1 目标区（ROI）校准5.4.1.1 全程戴上一次性无粉手套操作。5.4.1.2 从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出ROI校准反应板。5.4.1.3 让ROI校准反应板温度上升至室内温度（约需5分钟）。在立即运行反应板之前，不要从包装 袋内取出ROI校准反应板。反应孔中的荧光染料具有光敏感特性。长时间曝光可降低染料在反应板 中的荧光。5.4.1.4 从包装袋中取出ROI校准反应板。将光学薄膜留在反应板上。不要丢弃存放ROI校准反应

24、板 的包装袋。若贮存于原始包袋中，反应板最多可重复使用三次。5.4.1.5 振荡ROI校准反应板5秒钟。5.4.1.6 用板式离心机将反应板离心2分钟。ROI校准反应板必须充分混合并离心。5.4.1.7 确认ROI校准反应板每个反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更高的转速及更 长的时间离心反应板。5.4.1.8 按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配 器中被正确对齐。（装入标准反应板，使A12凹口位置位于托盘的右上角。）5.4.1.9 以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。5.4.1.10 执行自动ROI校准在 7500 Soft

25、ware 中，选择 InstrumentInstrument Maintenance Manager。在 Instrument Maintenance Manager 的 ROI 选项卡中，单击 Start Calibration。按照向导的指示，完成校准。ROI Calibration对话框显示三个选项卡： Setup-显示ROI校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。 Run-单击START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开 Analysis选项卡。 Analysis -指明校准状态（Passed/Failed）。如果校准失败，请参阅“排除ROI校

26、准故障”。5.4.1.11执行手动ROI校准在 7500 Software 中，选择 InstrumentInstrument Maintenance Manager。在 Instrument Maintenance Manager 的 ROI 选项卡中，单击 Start Manual Calibration。在ROI Inspector对话框中（如图1 ）：a.在 Exposure Time 字段中，输入 2048。b.选择Filter A （滤光器1）。单击Snapshot,生成一张ROI图像。确定ROI图像是否可接受（下图所示为未饱和以及过饱和的图像）。可接受图像中的反应 孔：在不过饱和

27、的前提下，必须尽可能明亮。（生成ROI校准时，如果反应孔过饱和，则 显示一条警告。）可以含有但不是必须含有红色像素（表示饱和）。未饱和正常饱和过度饱和可接受不可接受如果ROI图像可接受，转至步骤。如果ROI图像过饱和，将Exposure Time降低一半， 然后单击Snapshot。重复执行，直至获得可接受的ROI图像。如果无法获得可接受的图像，请 参阅“排除ROI校准故障”。单击Generate Calibrationo 7500 Software采集一张截图，然后显示一个消息框或ROI图像：如果软件显示：执行：或a.单击OK。b.将 Exposure Time 降低一半（参阅5.4.1.1

28、1步骤a）oc.重复步骤和。ROI图像非常模糊或者无法成功校准。请参阅“排除ROI校准故障”。可接受的校准图像注：在所有反应孔周围出现绿色圆圈，表示反应孔成功校准。注：绿色圆圈表示反应孔位置的目标区已足够亮。验证以下各项：,Wells Found 值为 96。成功校准-Wells Found必 须为96。,在ROI图像上每个反应孔 区的周围显示绿色圆圈。单击 Save Calibration。软件保存滤光器1新产生的ROI校准。在ROI Inspector的Filter Masks Loaded区域,“OK”出现在滤光器1旁边。对其余滤光器重复步骤至，对每个滤光器执行校准之前，将Exposur

29、e Time重置为2048。当所有滤光器的Filter Masks Loaded都显示OK时，ROI校准完成。当所有滤光器的Filter Masks Loaded都是OK时，校准完成。点击Done。拆卸反应板（注意！灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过100° C。若刚使用过仪器，在样本块 恢复至室温之前，请勿触摸样本块。）取出校准反应板：a.按压托盘门，将其打开。b.取出校准反应板。c.按压托盘门，将其关闭。将校准反应板放入其包装套中。如果要执行背景和光学校准：a.在接下来的8小时，将ROI校准反应板置于室温下。光学校准使用ROI校准反应板。b.第二天将放入包装套的反应板放回贮存

30、在冷冻柜内的光谱校准套件中。c.重要！不要丢弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在打开其包装后 最多可重复使用反应板3次。d.重要！执行ROI校准后，也必须执行背景校准、光学校准、染料校准以及仪器验证。排除ROI校准故障问题/症状可能原因行动ROI校准失败样本块可能位于降低的位置。1.如果 ROI Inspector 的 CCD Control/Settings 显示 “BlockUp”，则单击Block Up将样本块升高。ROI图像模糊2 .检查确认受热的盖组件已被全程向前拉出，以确保托盘可 以被正确推入。如果7500 Instrument安装了受热盖栓，检查 确认盖栓处于锁定

31、位置。3 .如果ROI校准仍然失败，检查7500 Instrument内的卤素 灯状态（参阅“监控灯具状态”），然后，如果需要时，更换灯 具（参阅“更换卤素灯”）。5.4.2背景校准全程戴上一次性无粉手套操作。从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出准备好的背景反应板。让背景反应板温度上升至室温（至少需要5分钟）。从包装袋中取出背景反应板。（重要！不要丢弃存放反应板的包装袋。若将背景反应板贮存在其原始包 装套内，背景反应板最多可重复使用三次。）振荡反应板5秒钟。用板式离心机将反应板离心2分钟。反应板必须充分混合并离心。确认反应板每个背景反应孔中的液 体均位于反应孔底部。如果不是，则以更长的时间离心

32、反应板。按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正 确对齐。以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。（注：如果无法打开托盘，样本块可 能位于其“升高”位置，锁定了托盘门位置。要降低样本块，选择Instrument-Calibrate,然后退 出 ROI Inspector。）在 7500 Software 中，选择 Instrument-Instrument Maintenance Managero在 Instrument MaintenanceManager 中，选择 Background 选项卡。在 Background 选项卡中，单击

33、 Start Calibration。按照向导的指示，完成校准。Background Calibration对话框显示四个选项卡:, Overview -显示校准相关信息。 Setup-显示背景校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。 Run-单击START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开 Analysis选项卡。, Analysis -指明校准状态（Passed/Failed）。如果校准失败，请参阅“排除背景校准故障”。注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正 确温度。校准完成后，取出校准反应板：按压托盘门

34、，将其打开。取出校准反应板。按压托盘门，使其滑入仪器。将校准反应板放入其包装套内，并将包装好的反应板放回冷冻柜内的光谱校准套件中。（重要！不要丢 弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在初次打开其包装后最多可重复使用反应 板3次。）排除背景校准故障问题/症状可能原因行动背景校准失败背景反应板上的一个或 多个反应孔产生的光谱超 过仪器的最高限度。1 .使用相同的背景反应板重复执行校准。2 .若校准再次失败，请使用另一不同的背景 反应板重复执行校准。3 .若校准再次失败，请按下文“如何确定污 染”的说明，确定污染源。如何确定污染若信号超过正常背景荧光的限度，则表明校准反应板或样本块上存

35、在荧光污染物。常见污染 物包括记号笔中残存的油墨、一次性手套洒落的粉末及灰尘。欲确定污染来源和位置：在查看原始数据时，选择反应板布局中数块连续的较小区域，以找出受污染反应孔的位置。将背景反应板旋转180°,然后再次执行背景校准。重复步骤以找出污染物的位置。如果步骤和中找到的包含污染物的反应孔位置： 相同-则表明样本块中含有污染物。请按照“样本块污染清除”的说明，除去样本块中的 污染物。 相反-则表明背景反应板中含有污染物。丢弃当前使用的背景反应板，并使用新背景反应 板执行背景校准程序。如果更换背景反应板并且取出样本块的污染后校准失败:将用黑纸覆盖的反应板装入7500 Instrume

36、nto按照本章的说明，执行背景校准程序。校准完成后，选择反应板布局中的所有反应孔。查看光谱图谱中的峰值。如果峰值： 可见-则表明7500 Instrument的光学部件可能已被污染。请与生产商联系。 不存在-则表明样本块已被污染。请按照“样本块污染清除”的说明，除去样本块中的污 染物。5.4.3 光学校准全程戴上一次性无粉手套操作。从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出ROI校准反应板。让ROI校准反应板温度上升至室温（至少需要5分钟）。从包装袋中取出ROI校准反应板，振荡反应板5秒钟。（重要！不要丢弃存放反应板的包装袋。若将 ROI校准反应板贮存在其原始包装套内，ROI校准反应板最多可重复使用

37、三次。）（如果执行ROI校准后，将ROI校准反应板保持在室温，则跳到步骤，以减少在反应板在室 温时形成的冷凝。如果ROI校准反应板位于冷冻柜中，转至步骤。用板式离心机将反应板离心2分钟。ROI校准反应板必须充分混合并离心。确认ROI校准反应板每个 反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更长的时间离心反应板。按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正 确对齐。以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。在 7500 Software 中，选择 InstrumentInstrument Maintenance Managero在 Instr

38、ument MaintenanceManager 中，选择 Optical 选项卡。在 Optical 选项卡中，单击 Start Calibration。按照向导的指示，完成校准。Optical Calibration对话框显示四个选项卡：, Overview -显示校准相关信息。 Setup-显示光学校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。 Run -单击START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击 Next提示可以打开 Analysis选项卡。, Analysis -指明校准状态（Passed/Failed）。如果校准失败，请参阅“排除背景校准故障”。注：开始校准之

39、前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正确 温度。取出校准反应板：按压托盘门，将其打开。取出校准反应板。按压托盘门，使其滑入仪器。将校准反应板放入其包装套中。将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。（重要! 不要丢弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在打开其包装后最多可重复使用反 应板3次。）5.4.4 染料校准全程戴上一次性无粉手套操作。从冷冻柜中取出光谱校准套件，并从套件内取出所有染料反应板。将光谱校准套件放回冷冻柜贮藏。让染料反应板温度上升至室内温度（约需5分钟）。（重要！在立即运行之前，请勿从包装袋内取出染料反应板。在每个染料反

40、应板上，反应孔中 的荧光染料具有光敏感特性。长时间暴露在光线中会降低反应板的荧光信号强度。）注：如果将7500 Real-Time PCR Instrument染料反应板贮存在其原始包装内并放在冷冻柜中， 则在打开包装后6个月内可以校准7500 Real-Time PCR Instrument最多3次。在 7500 Software 中，选择 InstrumentInstrument Maintenance Managero在 Instrument Maintenance Manager 中，选择 Dye 选项卡。在 Dye 屏幕上，选择 System Dye Calibration。单击 S

41、tart Calibration。按照向导的指示，完成每个反应板的校准。（重要！在每个校准中，向导将单独指示。必须独立设置、 运行和分析每个染料反应板。）Dye Calibration对话框显示四个选项卡： Overview-显示校准相关信息。当软件提示获取需要的材料时，选择要校准的染料。 Setup-显示染料校准设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。当软件提示装入染 料反应板时，按照步骤所述准备并装载反应板。 Run-单击START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开Analysis选项卡。 Analysis-指明校准状态（Passed/Failed）。

42、当软件提示分析从每个染料反应板采集的光谱 时，核实校准的状态：, Passed7500 Instrument校准通过。转到步骤11的。 Failed7500 Instrument校准失败。请参阅“排除染料校准故障”。注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正 确温度。将软件所需的染料反应板从其包装中取出。振荡反应板5秒钟。（重要！不要丢弃存放反应板的包装袋。 若贮存于原包袋中，反应板最多可重复使用3次。用板式离心机将反应板离心2分钟。反应板必须充分混合并离心。确认反应板每个背景反应孔中的液 体均位于反应孔底部。如果不是，则以更长的时间离心反应板。检查并确

43、保要装入的染料反应板与在7500 Software中选取的荧光匹配。按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正 确对齐。关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。（注：如果无法打开托盘，样本块可能位 于其“升高”位置，锁定了托盘位置。要降低样本块，选择nstrumentf Calibrate,然后退出ROI Inspector。）因为向导对每个染料校准单独提供指示，所以请对校准的每个染料执行以下程序。lib WinnSetupRunAii.iMeik| Omwl | PfwIm | | Mal j j FFii第 EN1EW验证校准状态：, Pa

44、ssed7500 Instrument 校准通过。转到 b）。 Failed7500 Instrument校准失败。请参阅“排除染料校准故障”。核实染料光谱的分组：a.在反应板布局中，选择反应板的孔。b.检查原始数据。对于每个光谱，请确认峰值：,位于7500 Instrument的可检测范围内。,无不规格光谱峰值。,出现在染料的正确通道上。如果某光谱不符合上述标准，请参阅“排除染料校准故障”。注：在含有相同染料的各反应孔中，光谱位置和峰值位置的差异是由于不同反应孔之间 的光学属性及激发能存在细微差异而引起的。若所有光谱均可接受，则单击Next。取出校准反应板：（注意！灼热。仪器工作期间，样本块

45、温度可能超过100° C。若刚使用过仪器，在 样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。）按压托盘门，将其打开。取出校准反应板。按压托盘门，将其关闭。将校准反应板放入其包装套中。将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套 件中。（注：如果将7500 Real-Time PCR Instrument染料反应板贮存在其原始包装内并放 在冷冻柜中，则在打开包装后6个月内可以校准7500 Real-Time PCR Instrument最多3 次。）在按照指示将染料反应板取出后，单击Finisho按照开始操作，准备并运行下一个反应板。滤光器峰值(nm)染料/光谱1-520FAM染料SYB

46、R Green染料2-550JOE染料VIC染料CY3染料NED染料TAMRA染料3-5804-610ROX染料TEXAS RED染料5-670CY5染料排除染料校准故障问题/症状可能原因行动一个或多个原始光 谱达到或低于校准 的可检测阈值。光谱校准反应板未充分离 心。光谱校准反应板含有陈旧试 剂或试剂体积不足。若正运行定制光谱校准反应 板，染料可能浓度不足。1.卸载7500 Instrument并查看光谱校准反应板的 反应孔。若反应孔中的液体不是：-位于反应孔底部，请将反应板离心更长时间， 然后重复执行校准。-体积相等，则表明反应板未密封致使试剂挥 发。请将其丢弃，并运行另一反应板。2 .若

47、光谱校准反应板显示正常，则丢弃该反应板并 运行另一块反应板。3 .如果问题依然存在，请与生产商联系。注：若正运行定制光谱校准反应板，请创建另一反 应板但要增加产生不足信号的染料的浓度。一个或多个原始光 谱超过 7500 Instrument 的最高 限量。样本块或光谱校准反应板含 有荧光污染物。若正运行定制光谱校准反应 板，染料可能浓度过大。请按照5.4.2 “背景校准”操作，以确认是否存在 污染物。若背景校准未显示样本块含有污染物，则 光谱校准反应板可能含有污染物。注：若正运行定制光谱校准反应板，请创建另一反 应板但要降低超过可检测限量的染料的浓度。光谱在一个以上的 滤光器中含有峰 值。样本

48、块或光谱校准反应板含 有荧光污染物。5.4.5验证仪器性能全程戴上一次性无粉手套操作。冷冻柜中取出TaqMan ® RNase P 96-Well Instrument Verification Plate然后让反应板温度上升到室温 （大约需要5分钟）。从包装袋中取出RNase P反应板。振荡反应板5秒钟。用板式离心机将反应板离心2分钟。反应板必须充分混合并离心。确认液体位于反应板每个反应孔底部。 如果不是，则再次以更长的时间离心反应板。（重要！注意不要让RNase P反应板的底部染上 尘污。反应板底部沾上的液体和其它污染物可污染样品区组，导致异常高的背景信号。） 上图为RNase

49、P反应板上标准和未知种群的分布情况。RNase P反应板包括五个重复组的标 准物（1250、2500、5000、10,000和20,000拷贝）、两个未知重复组（5000和10,000拷贝） 和阴性对照反应孔（NC）。按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正 确对齐。关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。开始运行反应板：在 7500 Software 中，选择 InstrumentInstrument Maintenance Manager。在Instrument Maintenance Manager 中，选择 RNase P 选项卡。在

50、 RNase P 屏幕，单击 Start RNase P Run。按照向导的指示，完成校准。RNase P对话框显示四个选项卡：, Overview -显示校准相关信息。 Setup-显示RNase P运行设置说明。单击Next提示可以打开Run选项卡。 Run -单击START RUN可以开始运行流程并显示处理消息。单击 Next提示可以打开 Analysis选项卡。, Analysis -指明运行状态（Passed/Failed）。注：开始运行之前，仪器可能暂停（最长10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。注：7500 Software完成RNase P运行后，会自动分析运行，并在Analysis屏幕显示结果。在RNase P Run向导的Analysis屏幕上，确认运行状态：, Passed - 7500 Instrument