体外分析-核医学-2016

1、 待测物质浓度与检测手段待测物质浓度与检测手段 临床化学分析临床化学分析10-1210-910-610-310-0pg/Lng/Lm mg/Lmg/Lg/L免疫分析免疫分析Therapeutic DrugsThyroid HormoneFertility HormoneAllergyCancer MarkersInfectious DiseaseVitaminsSerum Proteins常量常量微量微量超微量超微量定定 义：义：利用利用放射放射分析方法或其派生的相关技分析方法或其派生的相关技术，测定生物样品中术，测定生物样品中微量生物活性物微量生物活性物质质含量含量检测检测：激素：激素 肿瘤

2、标志物肿瘤标志物 药物浓度药物浓度 受体受体分分 类类：Click to add title in here 423(IRMA) Ag Ab+Ag-Ab一一. RIA. RIA基本原理基本原理* * 抗原和标记抗原对抗体具有完全相同抗原和标记抗原对抗体具有完全相同 的免疫活性的免疫活性2. 抗体只有一种抗原结合位置抗体只有一种抗原结合位置 1+1=1反应反应3. 反应符合质量作用定律反应符合质量作用定律 Ag+Ab AgAb 一一. RIA. RIA基本原理基本原理* *V1V2 AgAbAg AbK=一一. RIA. RIA基本原理基本原理* *（一）竞争抑制免疫结合反应：（一）竞争抑制免疫

3、结合反应： 过量的过量的放射性标记抗原（放射性标记抗原（*Ag）与非标记抗原（即待测抗原，与非标记抗原（即待测抗原，Ag）同时与同时与限限量的量的特异性抗体（特异性抗体（Ab）进行竞争抑制免疫结进行竞争抑制免疫结合反应合反应 （三种成份）（三种成份） Ag-Ab + Ag *Ag Ab+*Ag-Ab(B)(F) +Ag+ *Ag（过量部分）（过量部分）*Ag:标记抗原标记抗原 Ag:非标记抗原非标记抗原 Ab:特异性抗体特异性抗体*Ag-Ab:标记的抗原标记的抗原-抗体复合物抗体复合物 Ag-Ab:非标记的抗原非标记的抗原-抗体复合物抗体复合物一一. RIA. RIA基本原理基本原理* *一一

4、. RIA. RIA基本原理基本原理* *RIA原理示意图原理示意图一一. RIA. RIA基本原理基本原理* *（二）（二） 剂量反应曲线剂量反应曲线/标准曲线：标准曲线： 定量基础：定量基础： *Ag-Ab的量（因变量）与的量（因变量）与Ag的量的量（自变量）之间存在竞争性抑制数量关系（自变量）之间存在竞争性抑制数量关系函数关系函数关系：二次函数关系：二次函数关系 用标准竞争抑制曲线（简称标准曲线）替代用标准竞争抑制曲线（简称标准曲线）替代一一. . RIARIA的基本原理的基本原理* *标准曲线的制备标准曲线的制备一一. . RIARIA基本原理基本原理* *标准曲线标准曲线一一. RI

5、A. RIA基本原理基本原理* *（三）未知样品的检测（三）未知样品的检测:同等条件下同等条件下 + 温育温育 分离分离B和和F 测量放射性活度测量放射性活度 查标准曲线求出浓度查标准曲线求出浓度一一. . RIARIA基本原理基本原理* *一一. . RIARIA基本原理基本原理* *未知样品的检测未知样品的检测Ag未知样品的检测未知样品的检测一一. . RIARIA基本原理基本原理* *完整的试剂盒（商品化）包括：完整的试剂盒（商品化）包括： 1. 抗体抗体 2. 标记抗原标记抗原 3. 标准抗原标准抗原 4. 质控品质控品 5. 沉淀剂沉淀剂二二. . RIARIA基本试剂基本试剂（一）

6、抗体（一）抗体（Antibody,Ab） IgG类类 “三高三高”: 1 亲和力亲和力 以亲和常数以亲和常数K表示表示 2 特异性特异性 以交叉反应率表示以交叉反应率表示 3 滴度滴度 以抗体最适稀释度表示以抗体最适稀释度表示二二. . RIARIA基本试剂基本试剂 AgAbAg AbK= 抗体的制备抗体的制备： 多克隆抗体多克隆抗体 免疫动物所得抗血清免疫动物所得抗血清 单克隆抗体单克隆抗体 杂交瘤技术所得抗体杂交瘤技术所得抗体 二二. . RIARIA基本试剂基本试剂（二）标记抗原（二）标记抗原（* Antigen,*Ag）抗原分子中一个或数个原子被放射性抗原分子中一个或数个原子被放射性核

7、素所取代核素所取代 标记的放射性核素有标记的放射性核素有3H 14C 125I等等 125I 比活度高比活度高 半衰期合适（半衰期合适（60天）天） 利用酪氨酸的利用酪氨酸的“嗜碘性嗜碘性”标记标记 二二. . RIARIA基本试剂基本试剂（二）标记抗原（二）标记抗原（* Antigen,*Ag） 要求：要求： 1. 同质性同质性 2. 高放射性比活度（高放射性比活度（kBq/ug) 3. 放射化学纯度放射化学纯度 95% 4. 免疫活性高免疫活性高二二. . RIARIA基本试剂基本试剂（三）标准抗原（标准品）（三）标准抗原（标准品）高浓度的纯品物质高浓度的纯品物质化学标准品化学标准品 结构

8、清楚结构清楚 物理化学方法可测定物理化学方法可测定 质量单位质量单位(ng/L)生物标准品生物标准品 不能用物理化学方法测定不能用物理化学方法测定 采用与采用与 被测物质相似分子形式的物质被测物质相似分子形式的物质 生物单位生物单位(mIU/L)要求：要求：1. 均质性均质性 2. 纯度高纯度高 3. 定量准确定量准确 二二. . RIARIA基本试剂基本试剂（四）待测样品（四）待测样品血浆血浆 血清血清 体液体液 组织液组织液要求要求：符合放射性检测方法的要求符合放射性检测方法的要求 去除可能存在的干扰成份去除可能存在的干扰成份二二. . RIARIA基本试剂基本试剂（五）检测仪器（五）检测

9、仪器计数仪：计数仪：125I 检测检测射线射线闪烁计数器：闪烁计数器：3H或者或者14C 检测检测射线射线二二. . RIARIA基本试剂基本试剂（一）理想的分离方法：（一）理想的分离方法： 1. 完全分离完全分离 2. 不影响反应的平衡不影响反应的平衡 3. 不受外界或其它试剂的干扰不受外界或其它试剂的干扰 4. 操作简便操作简便 重复性好重复性好 5. 来源方便来源方便 价格低廉价格低廉三三. . RIARIA分离方法分离方法（二）常用分离方法的比较：（二）常用分离方法的比较：分离方法分离方法 优优 点点 缺缺 点点三三. . RIARIA分离方法分离方法分离快分离快 适用于任何温育体适用

10、于任何温育体积积 沉淀易于观察沉淀易于观察 便宜便宜组分介质及损伤组分的分析组分介质及损伤组分的分析 新方法的研究和建立新方法的研究和建立分离快，适用于任何温育体分离快，适用于任何温育体积，蛋白质含量较低的分离积，蛋白质含量较低的分离介质蛋白质浓度影响小，通介质蛋白质浓度影响小，通用，特异性高，分离完全用，特异性高，分离完全分离快，简易，适用于大批分离快，简易，适用于大批样品的检测样品的检测条件不易掌握，分离不完全，条件不易掌握，分离不完全，对蛋白质敏感对蛋白质敏感点样量少，不能处理大量样品，点样量少，不能处理大量样品，测定体积受限，特殊设备测定体积受限，特殊设备对蛋白质浓度、离子强度及对蛋白

11、质浓度、离子强度及PH都敏感，沉淀不稳定都敏感，沉淀不稳定二抗价格高、流程长，二次温二抗价格高、流程长，二次温育可能建立新的平衡育可能建立新的平衡依赖商品供应，抗体用量大，依赖商品供应，抗体用量大，价高，固相抗体贮存不稳定价高，固相抗体贮存不稳定活性炭吸附活性炭吸附法法电泳法电泳法沉淀法沉淀法双抗体法双抗体法固相法固相法（一）误差的种类：（一）误差的种类： 1. 系统误差系统误差 确定的原因确定的原因 :仪器设备仪器设备 试剂质量试剂质量 标准曲线拟合方式等标准曲线拟合方式等 结果：倾向性偏高或偏低结果：倾向性偏高或偏低 以以“准确度准确度”(accuracy)表示表示 2. 随机误差随机误差

12、 难以确定的原因：放射性测量的统计难以确定的原因：放射性测量的统计 涨落涨落 探测仪器不稳定等探测仪器不稳定等 结果：双向性结果：双向性 以以“精密度精密度”(percision)表示表示四四. . RIARIA质量控制质量控制（二）精密度与准确度的区别与联系（二）精密度与准确度的区别与联系 四四. . RIARIA质量控制质量控制 甲：即准确又甲：即准确又 乙：不准确，乙：不准确， 丙：尚准确，丙：尚准确， 丁：即不准确丁：即不准确 精密精密 但精密但精密 但不精密但不精密 也不精密也不精密1 零标准管结合率（零标准管结合率（B0%） 30%-50%2 非特异性结合率（非特异性结合率（NSB

13、%）5%-10%3 室内质控图室内质控图 制作及质控规则制作及质控规则四四. . RIARIA质量控制质量控制（三（三）室内质量控制室内质量控制 （四（四）室间质量控制室间质量控制 一一. IRMA. IRMA基本原理基本原理* *（一）非竞争性免疫结合反应：（一）非竞争性免疫结合反应： 过量的过量的放射性标记抗体（放射性标记抗体（*Ab）与非标记抗原（与非标记抗原（Ag）进行非竞争性免疫结合进行非竞争性免疫结合反应反应 （二种试剂（二种试剂 ）*Ab+Ag-*Ab + *AbAg（B）（F）（二）（二） 剂量反应曲线剂量反应曲线/标准曲线：标准曲线： 定量基础：定量基础： Ag- * Ab的

14、量（因变量）与的量（因变量）与Ag的的量（自变量）之间存在正相关的函数关系量（自变量）之间存在正相关的函数关系 用标准结合曲线（简称标准曲线）替代用标准结合曲线（简称标准曲线）替代一一. IRMA. IRMA基本原理基本原理* *标准曲线的制备标准曲线的制备一一. IRMA. IRMA基本原理基本原理* *一一. IRMA. IRMA基本原理基本原理* *B%标准曲线标准曲线一一. IRMA. IRMA基本原理基本原理* *B%B%一一. IRMA. IRMA基本原理基本原理* *二二. IRMA. IRMA常用方法常用方法 双抗夹心法双抗夹心法 (double antibody sandwi

15、ch method) 2.2.标记第三抗体法标记第三抗体法(labeled third antibody method) 3.3.双标记抗体法双标记抗体法(double labeled antibody method)优点：优点：l 反应动力学：非竞争性反应动力学：非竞争性 且抗体过量且抗体过量 容易达到平衡容易达到平衡 温度变温度变化对结果影响不大。化对结果影响不大。l 灵敏度：比灵敏度：比RIA高出高出10100倍。倍。l 加样误差少：加样误差主要来自抗原一个环节加样误差少：加样误差主要来自抗原一个环节缺点：缺点：l 需要特殊的分离方法。需要特殊的分离方法。l 对半抗原不适应对半抗原不适应

16、l 要大量的要大量的*Ab，昂贵昂贵 三三. . IRMAIRMA优缺点优缺点四四. IRMAIRMA与与RIARIA主要区别主要区别* *RIAIRMA竞争性抗原抗体结合反应竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应非竞争性抗原抗体结合反应采用标记抗原采用标记抗原采用标记抗体采用标记抗体三种主要反应试剂三种主要反应试剂二种主要反应试剂二种主要反应试剂所用抗体是限量的所用抗体是限量的所用抗体是过量的所用抗体是过量的*AgAb的量与待测的量与待测Ag的量呈负相的量呈负相关关Ag*Ab的量与待测的量与待测Ag的量呈正相的量呈正相关关反应到达平衡慢反应到达平衡慢反应到达平衡快反应到达平衡快低剂量

17、区有不确定因素低剂量区有不确定因素低剂量区无不确定因素低剂量区无不确定因素1 1 酶标记免疫分析技术酶标记免疫分析技术2 2 化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术 3 3 时间分辨荧光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术4 4 胶体金标记分析技术胶体金标记分析技术 一一 酶标记免疫分析技术酶标记免疫分析技术（enzyme immumoassay,EIA)enzyme immumoassay,EIA) 酶分子酶分子代替放射性核素代替放射性核素 标记抗原或抗体的免疫标记抗原或抗体的免疫分析的技术分析的技术 结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性。常见方法为

18、高敏感性。常见方法为ELISA。 常用的酶为常用的酶为辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 底物是底物是四甲基联苯四甲基联苯胺胺 (TMB) ，反应后显黄色。反应后显黄色。 二二 化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术( (CLIA)CLIA) 以以化学发光物质化学发光物质代替放射性核素作为示踪物代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。的超微量分析技术。 1 化学发光免疫分析化学发光免疫分析 吖啶酯吖啶酯2 化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析 金刚烷金刚烷3 电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定 三联吡啶钌三联吡啶钌三三 时间分辨荧光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）四四 胶体金标记分析技术技术胶体金标记分析技术技术（colloidal-gold immunoassay，CGIA）问题：问题：放射免疫分析反应物有几种放射免疫分析反应物有几种 ？放射免疫分析抗原通常用什么标记放射免疫分析抗原通常用什么标记?免疫放射分析反应物有几种？免疫放射分析反应物有几种？ 小结小结 掌握掌握: 1.放射免疫分析的原理放射免疫分析的原理 、方法、方法 及质量控制及质量控制 2.免疫放射分析的原理免疫放